荧光活化细胞分选-放射性配体处理组织（FACS-RTT）以确定放射性信号的细胞来源

摘要

荧光激活细胞分选 - 放射性配体处理组织（FACS-RTT）是研究18 kDa易位蛋白或血清素5HT_2A受体表达在细胞尺度上阿尔茨海默病中的作用的强大工具。该协议描述了FACS-RTT在TgF344-AD大鼠模型中的 离体 应用。

摘要

神经胶质细胞可能在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病（AD））的病理生理学中具有相当大的影响。它们的改变可能与促炎状态有关。TgF344-AD大鼠菌株设计用于表达人类APP和人类PS1_ΔE9 基因，编码淀粉样蛋白Aβ-40和Aβ-42，并随着年龄的增长显示淀粉样蛋白病理学和认知缺陷。本研究使用TgF344-AD大鼠模型来评估18 kDa易位蛋白（TSPO，神经胶质细胞活化的标志物）结合的细胞起源，以及可能在AD中破坏的5HT_2A受体（5HT_2AR）血清素受体水平。这里介绍的技术是荧光活化细胞分选为放射性配体处理组织（FACS-RTT），这是一种定量细胞类型特异性技术，补充 了体内 PET或SPECT或 离体/体外 放射自显影技术。它在细胞术细胞分选后使用γ计数器量化先前用于成像的相同放射性标记示踪剂。这允许确定具有高细胞特异性和灵敏度的放射性标记蛋白的细胞来源。例如，FACS-RTT的研究表明，（i）脂多糖（LPS）诱导的神经炎症大鼠模型中TSPO结合的增加与小胶质细胞相关，（ii）12个月和18个月时TSPO结合的增加首先与星形胶质细胞相关，然后与野生型（WT）大鼠相比，TgF344-AD大鼠中的小胶质细胞相关，以及（iii）纹状体密度为5HT_2A在同一大鼠AD模型中，R在18个月时星形胶质细胞减少。有趣的是，这种技术可以扩展到几乎所有的放射性示踪剂。

引言

神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（AD），其特征在于与症状增加相关的神经元丢失。AD是痴呆症最常见的原因，占病例的60%-70%，影响全球约5000万人¹。在神经病理学水平上，AD的两个主要特征是细胞外淀粉样蛋白β（Aβ）斑块和细胞内Tau神经原纤维缠结的积累。神经胶质细胞改变也与AD² 和几种神经递质系统的可能破坏有关^3，4。

TgF344-AD大鼠品系通过表达人APP和PS1_ΔE9 转基因来模拟AD，导致可溶性和不溶性Aβ-40和Aβ-42表达以及淀粉样蛋白斑块形成⁵。它还呈现Tau蛋白的高磷酸化形式的积累，导致tau病。从9-24个月大，大鼠逐渐发展AD的病理标志和认知障碍^{5，6，7，8，9}。

正电子发射断层扫描（PET），单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和放射自显影是基于γ射线发射和定量的技术。放射性示踪剂在体内（PET和SPECT）或离体/体外（放射自显影）进行定量。这些敏感的技术有助于理解几种脑部疾病的机制，如AD。事实上，在神经炎症方面，有很多研究评估18 kDa易位蛋白（TSPO），一种体内神经炎症标志物，放射性标记的示踪剂，如[¹¹C]-（R）-PK11195或[¹¹C]PBR28（综述见¹⁰）。此外，已经使用放射性示踪剂11^，12，13研究了神经递质系统的改变。

然而，这些技术并不能确定放射性信号的细胞来源。这可能会妨碍对PET / SPECT中放射性配体结合改变的生物学基础的解释。例如，在TSPO神经炎症研究的情况下，了解TSPO的增加或减少是由于星细胞还是小胶质细胞的变化至关重要。荧光活化细胞分选为放射性配体处理组织（FACS-RTT）技术是为了解决这些问题而开发的，允许分别评估每种细胞类型中的放射性配体结合并量化每个细胞的靶蛋白密度。因此，这种创新技术与PET和SPECT成像相辅相成且高度兼容。

在这里，该技术沿两个轴应用:使用TSPO特异性放射性配体研究神经炎症和评估5-羟色胺能系统。在第一个轴上，目的是了解TSPO信号响应急性炎症反应的细胞起源。因此，在通过脂多糖（LPS）注射诱导神经炎症后，以及在 体内 [¹²⁵I]CLINDE SPECT成像研究之后，FACS-RTT用于大鼠的脑组织。此外，对12个月和24个月大的TgF344-AD大鼠和匹配的野生型（WT）大鼠应用相同的成像和FACS-RTT方案。第二轴旨在通过按细胞类型 进行离体 5-HT_2AR密度评估来确定该大鼠模型中5-羟色胺能系统改变的起源。

研究方案

所有实验程序均分别与日内瓦州人类和动物实验伦理委员会，州研究伦理委员会（CCER）和日内瓦州（瑞士）健康总方向达成协议。数据按照动物研究报告:报告 体内 实验（ARRIVE）指南。

1. SPECT相机的准备和校准

1. 打开相机，加载操作软件（参见 材料表）。单击" 主 XYZ 舞台 "按钮以执行归位。
2. 设置由一个10分钟的扫描采集组成的实验。将" 步进 "模式设置为 "精细 "，将 "采集 "模式设置为 "列表模式 "（以记录整个发射光谱）。
3. 设置床并确保加温系统，呼吸传感器和麻醉功能正常且安全（图1A-D）。然后，将幻影（即，在2 mL微量离心管中放置2 mL已知浓度为¹²⁵I的微量离心管）放置在动物头部的位置（以该区域为中心，图1E）。
4. 通过在屏幕底部的三个图像的帮助下滑动三个维度的光标来设置扫描区域。确保幻像和动物的扫描体积相同。
5. 使用步骤 1.2-1.4 中建立的参数启动幻像扫描以进行后续校准。

2. SPECT成像的工作空间设置

1. 用杀毒剂清洁工作空间，并在所有表面上放置软纸。
2. 确保在各自的储罐中有足够的异氟醚和氧气。
3. 通过切断蝴蝶导管的鳍来准备24G导管，以更清晰地看到大鼠尾静脉。
4. 取出针头后，通过用肝素溶液（25000 U / mL）完全填充导管来涂覆导管。然后，将针头放回其中，以避免导管插入后形成血凝块。

3. [¹²⁵I]克林德放射性示踪剂合成

注意:放射性物质可能具有足够的电离能来影响活细胞的原子并损害其遗传物质（DNA）。

1. 确保在适当的环境中工作，授权用于涉及放射性的实验。
   注意:穿戴适当的个人防护装备（PPE）进行放射性处理，包括手指和身体剂量计。尽量与任何放射性源保持安全距离。
2. 将100μg三丁基素前体与碘化钠（Na¹²⁵I）（参见 材料表）和5μL37%过氧乙酸在70°C下在手套箱中的热循环器中孵育20分钟。
3. 使用50%乙腈（ACN）在水中稀释反应以达到500μL的体积，将500μL稀释的反应注入反相柱上（参见 材料表）。
4. 用线性梯度分离[¹²⁵I]CLINDE HPLC，从5%-95%ACN在7mM H₃PO₄ 中运行10分钟。将分离物在H₂O中稀释至最终体积10mL，然后将稀释的反应注入浓度柱（参见 材料表）。
5. 用300μL无水乙醇从柱中洗脱[¹²⁵I]CLINDE，然后通过在室温下在真空离心机中孵育乙醇40分钟来蒸发乙醇。
6. 将含有[¹²⁵I]CLINDE的残留物在300μL无菌盐水中稀释，以产生储备溶液。
7. 测量其放射性后，在无菌盐水中稀释储备溶液，以获得500μL中0.037 MBq的溶液。
8. 通过HPLC（高效液相色谱法）纯化示踪剂。使用450nm处的标准校准确定洗脱时间，并分离单个放射性峰。使用七种标准浓度的冷（非放射性）CLINDE（0.1μg，0.5μg，0.75μg，1μg，1μg，1.5μg，2μg和5μg）在400μL的50%ACN溶液中执行标准校准曲线。通过测量放射性TLC（薄层色谱）中的单个峰来确定放射化学纯度。确保放射化学品的纯度在60%以上。
9. 检查测量450nm处紫外吸光度的放射性配体的比活性以及用冷参比化合物建立的校准曲线。确保比活性大于1000 GBq/μmol。

4. [¹²⁵I]R91150放射性示踪剂合成

注意:请确保遵循与 CLINDE 综合部分中提到的相同的安全规则。

1. 将300μgR91150前体在3μL无水乙醇，3μL冰醋酸，15μL无载体Na¹²⁵I（参见 材料表）（10mCi）的溶液中混合在0.05M NaOH和3μL30%H₂O₂中。在手套箱中孵育30分钟。
2. 将整个反应注入反相色谱柱（参见 材料表）。
3. 通过等度HPLC运行（ACN /水50/50，10 mM乙酸缓冲液）以3 mL / min的流速分离[¹²⁵I]R91150。
4. 在H 2 O中稀释[¹²⁵I]R91150，最终体积为10 mL。
5. 将10 mL稀释的反应注入浓缩柱（参见 材料表）。
6. 用300μL无水乙醇从色谱柱中洗脱[¹²⁵I]R91150。
7. 通过在室温下在真空离心机中孵育乙醇40分钟来蒸发乙醇。
8. 将含有[¹²⁵I]R91150的残留物稀释在300μL盐水中。
9. 用高效液相色谱纯化示踪剂。使用450nm处的标准校准确定洗脱时间并分离单个放射性峰。通过测量放射性TLC中的单个峰来确定放射化学纯度。确保放射化学品的纯度在98%以上。

5. 动物准备

1. 在具有3%异氟醚的诱导室中称重并麻醉TgF344-AD大鼠（雄性或雌性，2-24个月大）。深度麻醉后，将异氟醚在腔室中的流量降低至2%（0.4 L / min，100%O 2）。
2. 将动物放在装有麻醉鼻锥的预热床上。将异氟醚保持在2%（0.4升/分钟，100%O₂）。
3. 在动物的眼睛上涂抹眼部凝胶润滑剂，并通过呼吸监测确认麻醉深度;如有必要，调整麻醉。
4. 在尾静脉中进行24 G导管插入。

6. 光谱采集

1. 将动物转移到装有温度控制加热垫的摄像床上，加热垫设置为38°C（图1E）。
2. 将动物的头部固定在咬杆上，并固定头部支撑。
3. 在60分钟的扫描中设置实验，构成60帧1分钟。重用在步骤 1 中设置的所有其他参数。单击" 更新图像 "按钮以更新动物位置。
4. 通过借助屏幕底部的三个图像滑动光标来设置扫描区域。
5. 注入500μL放射性示踪剂（[¹²⁵I]CLINDE或[¹²⁵I]R91150），然后用300μL无菌0.9%NaCl冲洗管。同时单击" 开始采集" 以开始扫描。
6. 在扫描期间，确保通过呼吸速率监测将动物保持在恒定麻醉状态。如果需要，调整异氟醚的流量。
7. 扫描结束后，通过斩首快速对麻醉动物实施安乐死。

7. 扫描重建

1. 打开扫描重建软件（参见 材料表），然后打开数据集，查找在扫描文件夹中创建的 [filename].parameters 文件。
2. 选择感兴趣的同位素。请注意， Listmode 参数允许在此步骤中选择多个同位素。
3. 选择以下参数:0.4 mm 体素大小、4 个 （POS-EM） 子集、6 次迭代（相当于 24ME-EM）、无后置滤波器以及同位素对应的衰变校正。选择输出格式为 NIfTI，然后选择" 开始 SPECT 重建"。

8. 大鼠脑提取

1. 在与扫描程序相同的麻醉事件中，通过监测其呼吸频率确保动物的深度麻醉状态后，通过断头台进行斩首，并迅速将头部转移到解剖台上。
2. 用剪刀小心地将头顶的皮肤从后部到前面剪到眼睛中间。
3. 切除颅底和颈椎周围多余的肌肉。
4. 接下来，小心地将剪刀的一把刀片放在颅骨背面的孔中，孔大孔，并用手术钳取出颅骨的后部。
5. 然后，用手术钳小心地取下颅骨的顶部。老年雄性大鼠的头骨可以厚，取出小块，以免对大脑造成伤害。
6. 用剪刀小心地切开脑膜。脑膜在提取过程中会损害大脑;作为预防措施，请将其删除。
7. 取出颅骨顶部后，转动动物的头部，并用小扁平的刮刀，通过切除视神经和三叉神经小心地将大脑拉出。
8. 小心地将大脑转移到平坦，干净的玻璃表面上，以便在冰上进行解剖。
9. 使用扁平的金属刮刀和剃须刀片来剖析大脑感兴趣的区域。将组织放入2 mL离心管中并称重获得的组织。直接使用大脑部分进行细胞分离，或将其快速冷冻在液氮中供以后使用。

9. 细胞分离

1. 确保在干净无菌的环境中工作。建议在二级生物安全内阁（BSC）下工作。确保引入平衡计分卡的手套和每件设备都是无菌的。
2. 为了准备用于细胞分选的细胞，请遵循Jaclyn M. Schwarz^{14的实验方案}。
   注意:在该实验中，市售的神经解离试剂盒（见 材料表）用于细胞制备。
   1. 将样品放入装有1mL HBSS（无钙和无Mg）的2mL离心管中，然后离心（300× g，2分钟，室温= RT）并除去上清液而不干扰沉淀。
   2. 加入1900μL酶混合物-1，并在37°C下孵育15分钟，同时每5分钟通过倒置搅拌管。
   3. 加入30μL酶混合物-2，用移液器1（见 材料表）来回搅拌30次。然后，在37°C下孵育15分钟，同时每5分钟倒置搅拌一次管。
   4. 用移液器2轻轻来回混合，然后移液器3，然后在37°C下孵育10分钟以解离组织。
   5. 用80μm细胞过滤器过滤细胞，加入10mL HBSS（无钙和无镁）。离心机（300× g，10分钟，室温）并除去上清液而不干扰沉淀。
   6. 对于髓鞘消耗，用400μL髓鞘去除缓冲液（参见 材料表）重悬沉淀，然后加入100μL髓鞘去除珠（参见 材料表），然后在4°C下孵育15分钟。
   7. 加入5mL髓鞘去除缓冲液，离心（300× g，10分钟，室温），并在不干扰沉淀的情况下除去上清液。
   8. 加入500μL髓鞘去除缓冲液，并将管放入磁场柱中。用1mL髓鞘去除缓冲液洗涤色谱柱四次。
   9. 离心机（300× g，2分钟，室温）并除去上清液而不干扰沉淀。短暂涡旋（2 s）以解离细胞并加入5μLFc嵌段CD32。再次涡旋并在4°C下孵育5分钟。
   10. 加入100μL感兴趣的一抗混合物;在4°C下孵育20分钟。
   11. 离心（350× g，5分钟，4°C）并除去上清液而不干扰沉淀。在软纸上倒置印迹管。
   12. 短暂的涡旋（2秒）后，加入100μL二抗混合物，并在4°C下孵育15分钟。
   13. 加入2mL髓鞘去除缓冲液，离心（350× g，5分钟，4°C）并除去上清液而不干扰沉淀。在软纸上倒置印迹管。将细胞重悬于250μL无菌PBS中，并直接进行细胞分选。

10. 单元格排序

1. 用500μL无菌PBS制备微量离心管，以收集分选的细胞。
2. 每1000μL细胞溶液中加入10μLHoechst，对活细胞的细胞核进行着色，并将其与死细胞区分开来。
3. 在4°C下尽快将细胞转移到细胞分选机中。
4. 首先，按前向和侧散射对细胞进行排序，然后对Hoechst阳性细胞进行排序。接下来，根据感兴趣的抗体对细胞进行分类。分别收集阳性染色的细胞。确保将阳性细胞与自发荧光细胞区分开来。
5. 计算每个感兴趣池的已排序单元格的数量。

11. 伽玛计数

1. 使用 10 μL 用于 SPECT 校准的相同幻像溶液校准γ计数系统，但在 1 mL 水中稀释。
   注意:由于γ计数系统的精度提高，幻像溶液被稀释。
2. 将分拣的细胞管放入γ计数系统中，并根据制造商的协议进行γ计数。

结果

WT大鼠在单侧LPS注射后使用[¹²⁵I]CLINDE放射性示踪剂进行体内SPECT扫描（图2）。该扫描（使用放射性示踪剂注射后45-60分钟图像的汇总数据）显示LPS注射部位[¹²⁵I]CLINDE的结合（图2A）高于大脑对侧区域（图2B）。接受FACS-RTT的离体样品证实了这些结果，并显示仅在小胶质细胞中存在较多的[¹²⁵I]CLINDE...

讨论

据我们所知，该技术是第一个描述一种方法的方法，该方法可以更好地了解细胞水平上放射性示踪剂的体内结合改变。该协议描述了一种多尺度方法，以[125 I]CLINDE（TSPO）或[¹²⁵I]R91150（5HT_2AR）为例，在细胞水平上量化放射性示踪剂结合。

该技术足够强大且灵敏，可以精确检测广谱神经胶质细胞改变的细胞起源，从LPS诱导的强烈炎症反应到AD大鼠?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
BioVet	BioVet		Software for vitals check
Bondclone C18 reverse-phase column	Phenomenex, Schlieren, Switzerland
Des-Sur	University Hospital of Geneva		Virucide
Fc Block / anti-CD32	BD Biosciences	BDB550270	Reactivity for rat
FITC-conjugated anti-rat CD90	Biolegend	202504	Reactivity for rat
Heparin	B. Braun	B01AB01
HPLC	Knauer
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm	BD Biosciences	321312	24 G catheter
Isoflurane	Baxter	ZDG9623
Lacryvisc	Alcon	2160699
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Micropore soft tape	3M	F51DA01
MILabs-Uspect II	MILabs		Software for SPECT Camera
MoFlo Astrios	Beckman Coulter		Cell sorter
Myelin Removal Beads II	Miltenyi Biotec	130-096-733	Contains beads and myelin removal buffer.
NaCl 0.9% Sterile solution	B. Braun	395202
Neural Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.
Nylon Mesh Sheet	Amazon	CMN-0074-10YD	40 inch width, 80 micron size mesh
Peracetic acid	Sigma-Aldrich
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
R91150 précursor	CERMN
Sep-Pak C18 Column	Waters		Concentration column
Sodium iodide Na125	PerkinElmer
Tributylin precursor	CERMN
U-SPECT Rec2.38c	MILabs	Version Rec2.38c	Software for SPECT images reconstruction
USPECT II	MILabs		Spect Camera
Wizard 3"	PerkinElmer		Gamma counter