Fluorescência-Ativada Célula Desarmamento-Radiolige Tecido Tratado (FACS-RTT) para determinar a origem celular do sinal radioativo

Resumo

Fluorescência-Ativada Célula-Radioliging tecido tratado (FACS-RTT) é uma ferramenta poderosa para estudar o papel da proteína translocador de 18 kDa ou expressão de receptor de serotonina 5HT_2A na doença de Alzheimer em escala celular. Este protocolo descreve a aplicação ex-vivo do FACS-RTT no modelo de rato TgF344-AD.

Resumo

As células gliais provavelmente têm uma implicação considerável na fisiopatologia de distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (DA). Suas alterações talvez estejam associadas a um estado pró-inflamatório. A linhagem de ratos TgF344-AD foi projetada para expressar genes humanos app e humanos PS1_ΔE9 , codificando proteínas amiloides Aβ-40 e Aβ-42 e exibe patologia amiloide e déficits cognitivos com envelhecimento. O modelo de rato TgF344-AD é usado neste estudo para avaliar a origem celular da ligação de 18 kDa translocator protein (TSPO, um marcador de ativação celular gliana) e os níveis de receptor de serotonina 5HT_2A receptor (5HT_2AR) que são possivelmente interrompidos em DDA. A técnica aqui apresentada é Fluorescência-Ativada Classificação celular para Radioligand Tecido Tratado (FACS-RTT), uma técnica quantitativa específica do tipo celular complementar às técnicas in vivo PET ou SPECT ou ex vivo/in vitro autoradiography. Ele quantifica o mesmo rastreador radiolabeled usado antes para a imagem, usando um contador de γ após a triagem de células de citometria. Isso permite determinar a origem celular da proteína radiolabeled com alta especificidade celular e sensibilidade. Por exemplo, estudos com FACS-RTT mostraram que (i) o aumento da ligação TSPO estava associado à microglia em um modelo de ratinaide de lipopolysacarídeo (LPS)-induzido neuroinflamação, (ii) um aumento na ligação TSPO em 12 e 18 meses foi associado primeiro com astrócitos, e depois microglia nos ratos TgF344-AD em comparação com ratos do tipo selvagem (WT) e (iii) a densidade estriatal de 5HT_2A R diminui em astrócitos aos 18 meses no mesmo modelo de AD de rato. Curiosamente, essa técnica pode ser estendida a praticamente todos os radiotracers.

Introdução

Doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer (DA), são caracterizadas por uma perda neuronal associada ao aumento dos sintomas. AD, a causa mais comum de demência, representando 60%-70% dos casos, afeta cerca de 50 milhões de pessoas em todo o mundo¹. Em um nível neuropatológico, as duas principais características da DA são o acúmulo de placas extracelulares amilóide-β (Aβ) e emaranhados neurofibrilaris Tau intracelulares. Alterações celulares gliais também foram associadas à AD² e possível interrupção de vários sistemas neurotransmissores ^3,4.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética para Experimentação Humana e Animal do Cantão de Genebra, a Comissão Cantonnal de Ética em Pesquisa (CCER) e a Direção Geral da Saúde do Cantão de Genebra (Suíça), respectivamente. Os dados são relatados seguindo as diretrizes da Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE).

1. Preparação e calibração da câmera SPECT

1. Ligue a câmera, carregue o software operacional (ver Tabela de Materiais). Clique no botão Home XYZ Stage para executar o homing.
2. Configure o experimento composto por um....

Resultados

Ratos WT experimentaram in vivo SPECT scan com [¹²⁵I]RADIOtracer CLINDE após uma injeção unilateral de LPS (Figura 2). Esta varredura (utilizando dados somados de imagens de 45-60 min de injeção pós-radiotracer) mostrou maior ligação de [¹²⁵I]CLINDE no local da injeção de LPS (Figura 2A) do que na região contralateral do cérebro (Figura 2B). As amostras ex vivo que foram submetidas.......

Discussão

Para nosso conhecimento, essa técnica foi a primeira a descrever uma abordagem que permite uma melhor compreensão das alterações in vivo de ligação de um radiotracer no nível celular. O protocolo descreve um método multiescala para quantificar a ligação radiotracer no nível celular usando [¹²⁵I]CLINDE (TSPO) ou [¹²⁵I]R91150 (5HT_2AR) como exemplos.

Esta técnica é robusta e sensível o suficiente para detectar precisamente a origem celular d.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
BioVet	BioVet		Software for vitals check
Bondclone C18 reverse-phase column	Phenomenex, Schlieren, Switzerland
Des-Sur	University Hospital of Geneva		Virucide
Fc Block / anti-CD32	BD Biosciences	BDB550270	Reactivity for rat
FITC-conjugated anti-rat CD90	Biolegend	202504	Reactivity for rat
Heparin	B. Braun	B01AB01
HPLC	Knauer
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm	BD Biosciences	321312	24 G catheter
Isoflurane	Baxter	ZDG9623
Lacryvisc	Alcon	2160699
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Micropore soft tape	3M	F51DA01
MILabs-Uspect II	MILabs		Software for SPECT Camera
MoFlo Astrios	Beckman Coulter		Cell sorter
Myelin Removal Beads II	Miltenyi Biotec	130-096-733	Contains beads and myelin removal buffer.
NaCl 0.9% Sterile solution	B. Braun	395202
Neural Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.
Nylon Mesh Sheet	Amazon	CMN-0074-10YD	40 inch width, 80 micron size mesh
Peracetic acid	Sigma-Aldrich
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
R91150 précursor	CERMN
Sep-Pak C18 Column	Waters		Concentration column
Sodium iodide Na125	PerkinElmer
Tributylin precursor	CERMN
U-SPECT Rec2.38c	MILabs	Version Rec2.38c	Software for SPECT images reconstruction
USPECT II	MILabs		Spect Camera
Wizard 3"	PerkinElmer		Gamma counter