Fluorescência-Ativada Célula Desarmamento-Radiolige Tecido Tratado (FACS-RTT) para determinar a origem celular do sinal radioativo

Resumo

Fluorescência-Ativada Célula-Radioliging tecido tratado (FACS-RTT) é uma ferramenta poderosa para estudar o papel da proteína translocador de 18 kDa ou expressão de receptor de serotonina 5HT_2A na doença de Alzheimer em escala celular. Este protocolo descreve a aplicação ex-vivo do FACS-RTT no modelo de rato TgF344-AD.

Resumo

As células gliais provavelmente têm uma implicação considerável na fisiopatologia de distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (DA). Suas alterações talvez estejam associadas a um estado pró-inflamatório. A linhagem de ratos TgF344-AD foi projetada para expressar genes humanos app e humanos PS1_ΔE9 , codificando proteínas amiloides Aβ-40 e Aβ-42 e exibe patologia amiloide e déficits cognitivos com envelhecimento. O modelo de rato TgF344-AD é usado neste estudo para avaliar a origem celular da ligação de 18 kDa translocator protein (TSPO, um marcador de ativação celular gliana) e os níveis de receptor de serotonina 5HT_2A receptor (5HT_2AR) que são possivelmente interrompidos em DDA. A técnica aqui apresentada é Fluorescência-Ativada Classificação celular para Radioligand Tecido Tratado (FACS-RTT), uma técnica quantitativa específica do tipo celular complementar às técnicas in vivo PET ou SPECT ou ex vivo/in vitro autoradiography. Ele quantifica o mesmo rastreador radiolabeled usado antes para a imagem, usando um contador de γ após a triagem de células de citometria. Isso permite determinar a origem celular da proteína radiolabeled com alta especificidade celular e sensibilidade. Por exemplo, estudos com FACS-RTT mostraram que (i) o aumento da ligação TSPO estava associado à microglia em um modelo de ratinaide de lipopolysacarídeo (LPS)-induzido neuroinflamação, (ii) um aumento na ligação TSPO em 12 e 18 meses foi associado primeiro com astrócitos, e depois microglia nos ratos TgF344-AD em comparação com ratos do tipo selvagem (WT) e (iii) a densidade estriatal de 5HT_2A R diminui em astrócitos aos 18 meses no mesmo modelo de AD de rato. Curiosamente, essa técnica pode ser estendida a praticamente todos os radiotracers.

Introdução

Doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer (DA), são caracterizadas por uma perda neuronal associada ao aumento dos sintomas. AD, a causa mais comum de demência, representando 60%-70% dos casos, afeta cerca de 50 milhões de pessoas em todo o mundo¹. Em um nível neuropatológico, as duas principais características da DA são o acúmulo de placas extracelulares amilóide-β (Aβ) e emaranhados neurofibrilaris Tau intracelulares. Alterações celulares gliais também foram associadas à AD² e possível interrupção de vários sistemas neurotransmissores ^3,4.

A linha de ratos TgF344-AD foi modificada para modelar AD expressando transgenes humanos APP e PS1_ΔE9, levando à expressão solúvel e insolúvel Aβ-40 e Aβ-42 e formação de placa amiloide⁵. Também apresenta o acúmulo de formas hiperfosforilaladas da proteína Tau que levam à tauopatia. Dos 9 a 24 meses, os ratos desenvolvem progressivamente as características patológicas da DA e um comprometimento cognitivo^de 5,6,7,8,9.

Tomografia de Emissão de Pósitrons (PET), Tomografia computadorizada de emissão de fótons (SPECT) e autoradiografia são técnicas baseadas na emissão e quantificação de raios γ. Os radiotracers são quantificados tanto in vivo (PET e SPECT) quanto ex vivo/in vitro (autoradiografia). Essas técnicas sensíveis têm contribuído para a compreensão de mecanismos de várias doenças cerebrais, como a DA. De fato, em termos de neuroinflamação, há muitos estudos avaliando 18 kDa Translocator Protein (TSPO), um marcador de neuroinflamação in vivo, com rastreadores radiolabeled como [¹¹C]-(R)-PK11195 ou [¹¹C]PBR28 (para revisão ver¹⁰). Além disso, alterações nos sistemas neurotransmissores têm sido estudadas utilizando radiotracers 11,12,13.

No entanto, essas técnicas não determinam a origem celular do sinal radioativo. Isso poderia dificultar a interpretação dos fundamentos biológicos da alteração na vinculação de um radiolig e no PET/SPECT. Por exemplo, no caso de estudos tspo de neuroinflamação, entender se o aumento ou diminuição do TSPO é devido a alterações astróciticas ou microgliais é de suma importância. A técnica de Triagem celular ativada pela Fluorescência para Radioligand Tecido Tratado (FACS-RTT) foi desenvolvida para contornar esses problemas, permitindo a avaliação da radioligência e vinculação em cada tipo de célula separadamente e a quantificação da densidade de proteína-alvo por célula. Esta técnica inovadora é, consequentemente, complementar e altamente compatível com imagens PET e SPECT.

Aqui, essa técnica foi aplicada ao longo de dois eixos: o estudo da neuroinflamação utilizando radioligands específicos do TSPO e avaliação do sistema serotonérgico. No primeiro eixo, o objetivo era compreender a origem celular do sinal TSPO em resposta a uma reação inflamatória aguda. Portanto, o FACS-RTT foi utilizado nos tecidos cerebrais dos ratos após a indução da neuroinflamação por meio de uma injeção de lipopólise (LPS) e após um estudo de imagem in vivo [¹²⁵I]CLINDE SPECT. Além disso, o mesmo protocolo de imagem e FACS-RTT foram aplicados em ratos TgF344-AD de 12 e 24 meses de idade e ratos do tipo selvagem (WT) correspondentes. O segundo eixo visava determinar a origem das alterações do sistema serotoninérgico neste modelo de rato através da avaliação de densidade ex vivo 5-HT_2AR por tipo de célula.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética para Experimentação Humana e Animal do Cantão de Genebra, a Comissão Cantonnal de Ética em Pesquisa (CCER) e a Direção Geral da Saúde do Cantão de Genebra (Suíça), respectivamente. Os dados são relatados seguindo as diretrizes da Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE).

1. Preparação e calibração da câmera SPECT

1. Ligue a câmera, carregue o software operacional (ver Tabela de Materiais). Clique no botão Home XYZ Stage para executar o homing.
2. Configure o experimento composto por uma aquisição de 10 min. Defina o modo Passo para Multa e o modo De aquisição ao Listmode (para registrar todo o espectro de emissões).
3. Configure a cama e garanta que o sistema de aquecimento, o sensor de respiração e a anestesia sejam funcionais e seguros (Figura 1A-D). Em seguida, coloque um fantasma (ou seja, 2 mL de uma concentração conhecida de ¹²⁵I em um tubo de microfuge de 2 mL) onde a cabeça do animal será posicionada (centrada na área, Figura 1E).
4. Defina a área de varredura deslizando os cursores para as três dimensões com a ajuda das três imagens na parte inferior da tela. Certifique-se de que o volume de varredura do fantasma e do animal é o mesmo.
5. Inicie a varredura fantasma para calibração subsequente com os parâmetros estabelecidos nas etapas 1.2-1.4.

2. Configuração do espaço de trabalho para imagens SPECT

1. Limpe o espaço de trabalho com virucida desinfetante e coloque papéis macios em todas as superfícies.
2. Certifique-se de que há isoflurane suficiente e oxigênio em seus respectivos tanques.
3. Prepare um cateter de 24 G cortando as aletas do cateter borboleta para ter uma visão mais clara da veia da cauda do rato.
4. Cubra o cateter preenchendo-o completamente com a solução de heparina (25000 U/mL) depois de remover a agulha. Em seguida, coloque a agulha de volta nela para evitar a formação de coágulos sanguíneos após a inserção do cateter.

3. [¹²⁵I]Síntese de radiotraísis de radiotraísis CLINDE

ATENÇÃO: A radioatividade pode ter energia ionizante suficiente para afetar os átomos das células vivas e danificar seu material genético (DNA).

1. Certifique-se de trabalhar em um ambiente adequado, autorizado para experimentos envolvendo radioatividade.
   NOTA: Use os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, para manuseio de radioatividade, incluindo dosímetros de dedo e corpo. Tente ficar a uma distância segura de qualquer fonte de radioatividade.
2. Incubar 100 μg de precursor de tributílina em 100 μL de ácido acético com iodeto de sódio (Na¹²⁵I) (ver Tabela de Materiais) e 5 μL de ácido peracético de 37% a 70 °C por 20 min em um termociclador posicionado em uma caixa de luvas.
3. Diluir a reação usando 50% de acetonitrila (ACN) na água para atingir um volume de 500 μL. Injete os 500 μL da reação diluída em uma coluna de fase inversa (ver Tabela de Materiais).
4. Isole o [¹²⁵I]CLINDE com um gradiente linear HPLC executado de 5%-95% ACN em 7 mM H₃PO₄ por 10 min. Diluir o isolado em H₂O para atingir um volume final de 10 mL e, em seguida, injetar a reação diluída em uma coluna de concentração (ver Tabela de Materiais).
5. Elute o [¹²⁵I]CLINDE da coluna com 300 μL de etanol absoluto, e depois evaporar o etanol incubando-o em uma centrífuga de vácuo na RT por 40 minutos.
6. Diluir o resíduo contendo o [¹²⁵I]CLINDE em 300 μL de soro fisiológico estéril para criar uma solução de estoque.
7. Após medir sua radioatividade, dilui a solução de estoque em soro fisiológico estéril para obter uma solução de 0,037 MBq em 500 μL.
8. Purifique o rastreador por HPLC (cromatografia líquida de alto desempenho). Determine o tempo de eluição usando uma calibração padrão a 450 nm e isole o pico radioativo único. Realize a curva de calibração padrão utilizando sete concentrações padrão de frio (não radioativo) CLINDE (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg e 5 μg em 400 μL de uma solução de 50% ACN). Estabeleça a pureza radioquímica medindo um único pico no rádio TLC (Cromatografia de camada fina). Certifique-se de que a pureza do radioquímico está acima de 60%.
9. Verifique a atividade específica da radiolige medindo absorvância ultravioleta a 450 nm e as curvas de calibração estabelecidas com compostos de referência fria. Certifique-se de que a atividade específica seja superior a 1000 GBq/μmol.

4. [¹²⁵I]R91150 síntese de radiotracer

NOTA: Certifique-se de seguir as mesmas regras de segurança mencionadas na seção de síntese do CLINDE.

1. Misture 300 μg de R91150 precursor em uma solução de 3 μL de etanol absoluto, 3 μL de ácido acético glacial, 15 μL de na¹²⁵I sem portador (ver Tabela de Materiais) (10 mCi) em 0,05 M NaOH e 3 μL de 30% H₂O₂. Incubar por 30 minutos em um porta-luvas.
2. Injete toda a reação em uma coluna de fase inversa (ver Tabela de Materiais).
3. Isole [¹²⁵I]R91150 por hplc isocrático (ACN/água 50/50, 10 mM tampão de ácido acético) com uma taxa de fluxo de 3 mL/min.
4. Diluir [¹²⁵I]R91150 em H₂O para um volume final de 10 mL.
5. Injete 10 mL da reação diluída em uma coluna de concentração (ver Tabela de Materiais).
6. Elute [¹²⁵I]R91150 da coluna com 300 μL de etanol absoluto.
7. Evaporar o etanol incubando-o em uma centrífuga a vácuo na RT por 40 minutos.
8. Diluir o resíduo contendo [¹²⁵I]R91150 em 300 μL de soro fisiológico.
9. Purifique o rastreador pelo HPLC. Determine o tempo de eluição usando uma calibração padrão a 450 nm e isole o pico radioativo único. Estabeleça a pureza radioquímica medindo um único pico no rádio TLC. Certifique-se de que a pureza do radioquímico está acima de 98%.

5. Preparação animal

1. Pesar e anestesiar o rato TgF344-AD (masculino ou feminino, de 2 a 24 meses de idade) em uma câmara de indução com 3% de isoflurano. Uma vez profundamente anestesiado, reduza o fluxo de isoflurane para 2% (0,4 L/min, 100% O2) na câmara.
2. Posicione o animal em uma cama pré-aquecida equipada com um nariz de anestesia. Manter o isoflurane em 2% (0,4 L/min, 100% O₂).
3. Aplique lubrificante de gel ocular nos olhos do animal e confirme a profundidade da anestesia através do monitoramento respiratório; ajustar anestesia, se necessário.
4. Realize a inserção do cateter de 24 G na veia da cauda.

6. Aquisição da SPECT

1. Transfira o animal para o leito da câmera equipado com uma almofada de aquecimento controlada pela temperatura a 38°C (Figura 1E).
2. Fixar a cabeça do animal na barra de mordidas e fixar os suportes da cabeça.
3. Configure o experimento em uma varredura de 60 minutos constituindo 60 quadros de 1 min. Reutilize todos os outros parâmetros configurados na etapa 1. Clique no botão Atualizar imagem para atualizar a posição animal.
4. Defina a área de varredura deslizando os cursores com a ajuda das três imagens na parte inferior da tela para as três dimensões.
5. Injete 500 μL do radiotracer radioativo ([¹²⁵I]CLINDE ou [¹²⁵I]R91150), e depois lave o tubo com 300 μL de NaCl estéril de 0,9%. Clique simultaneamente em Iniciar Aquisição para iniciar a varredura.
6. Durante o tempo de varredura, certifique-se de manter o animal sob anestesia constante com monitoramento da taxa de respiração. Ajuste o fluxo de isoflurane, se necessário.
7. Uma vez que o exame termine, eutanásia rapidamente o animal anestesiado por decapitação.

7. Reconstrução de varredura

1. Abra o software de reconstrução de varredura (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, abra o conjunto de dados, procurando o arquivo [nome de arquivo].parâmetros, criado na pasta da varredura.
2. Selecione o isótopo de interesse. Observe que o parâmetro Listmode permite a seleção de isótopos múltiplos nesta etapa.
3. Selecione os seguintes parâmetros: tamanho Voxel de 0,4 mm, subconjuntos 4 (POS-EM), 6 iterações (equivalente 24ME-EM), sem pós-filtro e correção correspondente de decadência correspondente. Selecione o formato de saída para NIfTI e selecione Iniciar a reconstrução SPECT .

8. Extração cerebral de rato

1. No mesmo evento anestésico que o procedimento de varredura e depois de garantir o estado de anestesia profunda do animal, monitorando sua taxa respiratória, proceda à decapitação por guilhotina e transfira rapidamente a cabeça para o banco de dissecção.
2. Com a tesoura, corte cuidadosamente a pele em cima da cabeça da parte de trás para a frente até o meio dos olhos.
3. Corte os músculos em excesso ao redor da base do crânio e das vértebras cervicais.
4. Em seguida, coloque cuidadosamente uma lâmina da tesoura no orifício na parte de trás do crânio, o forame magnum, e remova a parte de trás do crânio com um alicate cirúrgico.
5. Em seguida, com alicates cirúrgicos, remova cuidadosamente a parte superior do crânio. O crânio de ratos machos velhos pode ser grosso, remover como pequenos pedaços para evitar danos ao cérebro.
6. Corte cuidadosamente as meninges com uma tesoura. Meninges podem danificar o cérebro durante o processo de extração; removê-lo como precaução.
7. Depois de remover a parte superior do crânio, gire a cabeça do animal ao redor, e com uma pequena espátula plana, puxe cuidadosamente o cérebro para fora cortando os nervos ópticos e trigeminais.
8. Transfira cuidadosamente o cérebro para uma superfície de vidro plana e limpa para dissecção no gelo.
9. Use uma espátula de metal plano e uma lâmina de barbear para dissecar as regiões de interesse do cérebro. Coloque os tecidos em um tubo de centrífuga de 2 mL e pese o tecido obtido. Use a seção cerebral diretamente para isolamento celular ou congele-a rapidamente em nitrogênio líquido para uso posterior.

9. Isolamento celular

1. Certifique-se de trabalhar em um ambiente limpo e estéril. Trabalhar sob um gabinete de biossegurança classe II (BSC) é aconselhável. Certifique-se de que as luvas e todos os equipamentos introduzidos no BSC são estéreis.
2. Para preparar as células para a triagem celular, siga o protocolo de Jaclyn M. Schwarz¹⁴.
   NOTA: Neste experimento, foi utilizado um kit de dissociação neural comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) para preparação celular.
   1. Coloque as amostras em um tubo de centrífuga de 2 mL com 1 mL de HBSS (Sem Ca e Mg), e depois centrífuga (300 x g, 2 min, temperatura ambiente = RT) e remova o supernatante sem perturbar a pelota.
   2. Adicione 1900 μL de enzima mix-1 e incuba-o por 15 min a 37 °C enquanto agita os tubos por inversão a cada 5 minutos.
   3. Adicione 30 μL de enzima mix-2, agitar suavemente com pipeta 1 (ver Tabela de Materiais) para frente e para trás 30 vezes. Em seguida, incubar por 15 min a 37 °C enquanto agita os tubos por inversão a cada 5 minutos.
   4. Misture suavemente para frente e para trás com pipeta 2 e, em seguida, pipeta 3 antes de incubar por 10 min a 37 °C para dissociar os tecidos.
   5. Filtre as células com um coador de células de 80 μm, adicione 10 mL de HBSS (Sem Ca e Mg). Centrífuga (300 x g, 10 min, RT) e remova o supernatante sem perturbar a pelota.
   6. Para esgotamento da mielina, resuspenque a pelota com 400 μL de tampão de remoção de mielina (ver Tabela de Materiais) e adicione 100 μL de contas de remoção de mielina (ver Tabela de Materiais), antes de incubar por 15 min a 4 °C.
   7. Adicione 5 mL de tampão de remoção de mielina, centrífuga (300 x g, 10 min, RT) e remova o sobrenatante sem perturbar a pelota.
   8. Adicione 500 μL de tampão de remoção de mielina e coloque o tubo na coluna do campo magnético. Lave a coluna com 1 mL de tampão de remoção de mielina quatro vezes.
   9. Centrífuga (300 x g, 2 min, RT) e remova o supernatante sem perturbar a pelota. Vórtice brevemente (2 s) para dissociar as células e adicionar 5 μL de Bloco FC CD32. Vórtice novamente e incubar por 5 min a 4 °C.
   10. Adicionar 100 μL da mistura de anticorpos primários de interesse; incubar por 20 min a 4 °C.
   11. Centrífuga (350 x g, 5 min, 4 °C) e remova o sobrenante sem perturbar a pelota. Borrida os tubos de cabeça para baixo em papel macio.
   12. Após um breve vórtice (2 s), adicione 100 μL da mistura de anticorpos secundários e incubar por 15 min a 4 °C.
   13. Adicione 2 mL de tampão de remoção de mielina, centrífuga (350 x g, 5 min, 4 °C) e remova o sobrenatante sem perturbar a pelota. Borrida os tubos de cabeça para baixo em papel macio. Resuspenque as células em 250 μL de PBS estéril e proceda diretamente para a classificação celular.

10. Classificação celular

1. Prepare o tubo de microfuge com 500 μL de PBS estéril para coletar as células classificadas.
2. Adicione 10 μL de Hoechst por 1000 μL de solução celular para colorir os núcleos das células vivas e distingui-las das células mortas.
3. Transfira as células o mais rápido possível para a máquina de classificação celular a 4 °C.
4. Primeiro, classifique as células por frente e lado dispersão, e depois classifique as células positivas hoechst. Em seguida, classifique as células baseadas nos anticorpos de interesse. Colete as células manchadas positivamente separadamente. Certifique-se de distinguir as células positivas das autofluorescentes.
5. Conte o número de células classificadas para cada grupo de interesse.

11. Contagem gama

1. Calibrar o sistema de contagem de γ com 10 μL da mesma solução fantasma usada para a calibração SPECT, mas diluí-lo em 1 mL de água.
   NOTA: A solução fantasma é diluída devido à precisão aprimorada do sistema de contagem de γ.
2. Coloque o tubo de células classificadas no sistema de contagem de γ e proceda com a contagem de γ de acordo com o protocolo do fabricante.

Resultados

Ratos WT experimentaram in vivo SPECT scan com [¹²⁵I]RADIOtracer CLINDE após uma injeção unilateral de LPS (Figura 2). Esta varredura (utilizando dados somados de imagens de 45-60 min de injeção pós-radiotracer) mostrou maior ligação de [¹²⁵I]CLINDE no local da injeção de LPS (Figura 2A) do que na região contralateral do cérebro (Figura 2B). As amostras ex vivo que foram submetidas...

Discussão

Para nosso conhecimento, essa técnica foi a primeira a descrever uma abordagem que permite uma melhor compreensão das alterações in vivo de ligação de um radiotracer no nível celular. O protocolo descreve um método multiescala para quantificar a ligação radiotracer no nível celular usando [¹²⁵I]CLINDE (TSPO) ou [¹²⁵I]R91150 (5HT_2AR) como exemplos.

Esta técnica é robusta e sensível o suficiente para detectar precisamente a origem celular d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
BioVet	BioVet		Software for vitals check
Bondclone C18 reverse-phase column	Phenomenex, Schlieren, Switzerland
Des-Sur	University Hospital of Geneva		Virucide
Fc Block / anti-CD32	BD Biosciences	BDB550270	Reactivity for rat
FITC-conjugated anti-rat CD90	Biolegend	202504	Reactivity for rat
Heparin	B. Braun	B01AB01
HPLC	Knauer
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm	BD Biosciences	321312	24 G catheter
Isoflurane	Baxter	ZDG9623
Lacryvisc	Alcon	2160699
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Micropore soft tape	3M	F51DA01
MILabs-Uspect II	MILabs		Software for SPECT Camera
MoFlo Astrios	Beckman Coulter		Cell sorter
Myelin Removal Beads II	Miltenyi Biotec	130-096-733	Contains beads and myelin removal buffer.
NaCl 0.9% Sterile solution	B. Braun	395202
Neural Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.
Nylon Mesh Sheet	Amazon	CMN-0074-10YD	40 inch width, 80 micron size mesh
Peracetic acid	Sigma-Aldrich
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
R91150 précursor	CERMN
Sep-Pak C18 Column	Waters		Concentration column
Sodium iodide Na125	PerkinElmer
Tributylin precursor	CERMN
U-SPECT Rec2.38c	MILabs	Version Rec2.38c	Software for SPECT images reconstruction
USPECT II	MILabs		Spect Camera
Wizard 3"	PerkinElmer		Gamma counter