Tri cellulaire activé par fluorescence - Tissu traité par radioligand (FACS-RTT) pour déterminer l’origine cellulaire du signal radioactif

Résumé

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) est un outil puissant pour étudier le rôle de la protéine translocatrice 18 kDa ou de l’expression du récepteur 5HT_2A de la sérotonine dans la maladie d’Alzheimer à l’échelle cellulaire. Ce protocole décrit l’application ex vivo de FACS-RTT dans le modèle de rat TgF344-AD.

Résumé

Les cellules gliales ont probablement une implication considérable dans la physiopathologie des troubles neurodégénératifs, tels que la maladie d’Alzheimer (MA). Leurs altérations sont peut-être associées à un état pro-inflammatoire. La souche de rat TgF344-AD a été conçue pour exprimer les gènes humains APP et PS1_ΔE9 humains, codant pour les protéines amyloïdes Aβ-40 et Aβ-42 et présente une pathologie amyloïde et des déficits cognitifs avec le vieillissement. Le modèle de rat TgF344-AD est utilisé dans cette étude pour évaluer l’origine cellulaire de la liaison à la protéine translocatrice de 18 kDa (TSPO, un marqueur de l’activation des cellules gliales) et les niveaux du récepteur 5HT_2A (5HT_2AR) de la sérotonine qui sont éventuellement perturbés dans la MA. La technique présentée ici est le tri cellulaire activé par fluorescence sur les tissus traités par radioligand (FACS-RTT), une technique quantitative spécifique au type cellulaire complémentaire aux techniques d’autoradiographie in vivo TEP ou TEMP ou ex vivo /in vitro . Il quantifie le même traceur radiomarqué utilisé auparavant pour l’imagerie, en utilisant un compteur de γ après le tri cellulaire de cytométrie. Cela permet de déterminer l’origine cellulaire de la protéine radiomarquée avec une spécificité et une sensibilité cellulaires élevées. Par exemple, des études avec FACS-RTT ont montré que (i) l’augmentation de la liaison tSPO était associée à la microglie dans un modèle de rat de neuroinflammation induite par les lipopolysaccharides (LPS), (ii) une augmentation de la liaison au TSPO à 12 et 18 mois était d’abord associée aux astrocytes, puis à la microglie chez les rats TgF344-AD par rapport aux rats de type sauvage (WT), et (iii) à la densité striatale de 5HT_2A R diminue dans les astrocytes à 18 mois dans le même modèle de MA de rat. Fait intéressant, cette technique peut être étendue à pratiquement tous les radiotraceurs.

Introduction

Les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer (MA), se caractérisent par une perte neuronale associée à une augmentation des symptômes. La MA, la cause la plus fréquente de démence, représentant 60% à 70% des cas, touche environ 50 millions de personnes dans le monde¹. Au niveau neuropathologique, les deux principales caractéristiques de la MA sont l’accumulation de plaques extracellulaires de β amyloïde (Aβ) et d’enchevêtrements neurofibrillaires tau intracellulaires. Des altérations des cellules gliales ont également été associées à la^{MA 2} et à la perturbation possible de plusieurs systèmes de neurotransmetteurs ^3,4.

La lignée de rats TgF344-AD a été modifiée pour modéliser la MA en exprimant les transgènes humains APP et PS1_ΔE9, conduisant à l’expression soluble et insoluble d’Aβ-40 et d’Aβ-42 et à la formation de plaque amyloïde⁵. Il présente également l’accumulation de formes hyperphosphorylées de la protéine Tau conduisant à la tauopathie. À partir de l’âge de 9 à 24 mois, les rats développent progressivement les caractéristiques pathologiques de la MA et une déficience cognitive 5,6,7,8,9.

La tomographie par émission de positons (TEP), la tomographie par émission monophotonique (TEMP) et l’autoradiographie sont des techniques basées sur l’émission et la quantification de rayons γ. Les radiotraceurs sont quantifiés soit in vivo (TEP et TEMP), soit ex vivo/in vitro (autoradiographie). Ces techniques sensibles ont contribué à la compréhension des mécanismes de plusieurs maladies du cerveau, telles que la MA. En effet, en termes de neuroinflammation, il existe de nombreuses études évaluant la protéine translocatrice 18 kDa (TSPO), un marqueur de neuroinflammation in vivo, avec des traceurs radiomarqués tels que [¹¹C]-(R)-PK11195 ou [¹¹C]PBR28 (pour examen voir¹⁰). En outre, les altérations des systèmes de neurotransmetteurs ont été étudiées à l’aide de radiotraceurs ^11,12,13.

Cependant, ces techniques ne déterminent pas l’origine cellulaire du signal radioactif. Cela pourrait entraver l’interprétation des fondements biologiques de l’altération de la liaison d’un radioligand dans la TEP/TEMP. Par exemple, dans le cas des études TSPO sur la neuroinflammation, il est d’une importance primordiale de comprendre si l’augmentation ou la diminution de la TSPO est due à des changements astrocytaires ou microgliaux. La technique FACS-RTT (Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue) a été développée pour contourner ces problèmes, permettant l’évaluation de la liaison radioligand dans chaque type de cellule séparément et la quantification de la densité protéique cible par cellule. Cette technique innovante est donc complémentaire et hautement compatible avec l’imagerie TEP et TEMP.

Ici, cette technique a été appliquée selon deux axes: l’étude de la neuroinflammation à l’aide de radioligands spécifiques de TSPO et l’évaluation du système sérotoninergique. Sur le premier axe, l’objectif était de comprendre l’origine cellulaire du signal TSPO en réponse à une réaction inflammatoire aiguë. Par conséquent, FACS-RTT a été utilisé sur les tissus cérébraux de rats après l’induction de la neuroinflammation par injection de lipopolysaccharide (LPS) et à la suite d’une étude d’imagerie in vivo [¹²⁵I]CLINDE SPECT. De plus, la même imagerie et le même protocole FACS-RTT ont été appliqués sur des rats TgF344-AD âgés de 12 et 24 mois et sur des rats de type sauvage (WT) correspondants. Le deuxième axe visait à déterminer l’origine des altérations du système sérotoninergique dans ce modèle de rat par l’évaluation ex vivo de la densité 5-HT_2AR par type de cellule.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été menées en accord avec le Comité d’éthique pour l’expérimentation humaine et animale du canton de Genève, la Commission cantonale d’éthique de la recherche (CCER) et la Direction générale de la santé du canton de Genève (Suisse), respectivement. Les données sont rapportées conformément aux lignes directrices de Recherche animale : Rapports d’expériences in vivo (ARRIVE).

1. Préparation et étalonnage de la caméra SPECT

1. Allumez l’appareil photo, chargez le logiciel d’exploitation (voir Tableau des matériaux). Cliquez sur le bouton Home XYZ Stage pour effectuer le homing.
2. Configurez l’expérience composée d’une acquisition de scan de 10 minutes. Réglez le mode Pas sur Fine et le mode Acquisition sur Listmode (pour enregistrer l’ensemble du spectre d’émission).
3. Installez le lit et assurez-vous que le système de réchauffement, le capteur respiratoire et l’anesthésie sont fonctionnels et sécurisés (Figure 1A-D). Ensuite, placez un fantôme (c.-à-d. 2 mL d’une concentration connue de ¹²⁵I dans un tube de microfuge de 2 mL) où la tête de l’animal sera positionnée (centrée sur la zone, figure 1E).
4. Définissez la zone de numérisation en faisant glisser les curseurs pour les trois dimensions à l’aide des trois images dans la partie inférieure de l’écran. Assurez-vous que le volume de balayage du fantôme et de l’animal est le même.
5. Démarrez l’analyse fantôme pour un étalonnage ultérieur avec les paramètres établis aux étapes 1.2-1.4.

2. Configuration de l’espace de travail pour l’imagerie SPECT

1. Nettoyez l’espace de travail avec du virucide désinfectant et placez des papiers souples sur toutes les surfaces.
2. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’isoflurane et d’oxygène dans leurs réservoirs respectifs.
3. Préparez un cathéter de 24 G en coupant les ailettes du cathéter papillon pour avoir une vue plus claire de la veine de la queue du rat.
4. Enduire le cathéter en le remplissant complètement de solution d’héparine (25000 U/mL) après avoir retiré l’aiguille. Ensuite, replacez l’aiguille dedans pour éviter la formation de caillots sanguins après l’insertion du cathéter.

3. [¹²⁵I]Synthèse du radiotraceur CLINDE

ATTENTION : La radioactivité peut avoir suffisamment d’énergie ionisante pour affecter les atomes des cellules vivantes et endommager leur matériel génétique (ADN).

1. S’assurer de travailler dans un environnement approprié, autorisé pour les expériences impliquant de la radioactivité.
   REMARQUE: Portez l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié pour la manipulation de la radioactivité, y compris les dosimètres des doigts et du corps. Essayez de rester à une distance sécuritaire de toute source de radioactivité.
2. Incuber 100 μg de précurseur de tributyline dans 100 μL d’acide acétique avec de l’iodure de sodium (Na¹²⁵I) (voir tableau des matériaux) et 5 μL d’acide peracétique à 37 % à 70 °C pendant 20 min dans un thermocycleur placé dans une boîte à gants.
3. Diluer la réaction à l’aide de 50 % d’acétonitrile (ACN) dans l’eau pour atteindre un volume de 500 μL. Injecter les 500 μL de la réaction diluée sur une colonne en phase inverse (voir Tableau des matériaux).
4. Isolez le [¹²⁵I]CLINDE avec une CLHP à gradient linéaire de 5 % à 95 % d’ACN dans 7 mM H₃PO₄ pendant 10 min. Diluer l’isolat dans_H2O pour atteindre un volume final de 10 mL, puis injecter la réaction diluée sur une colonne de concentration (voir Tableau des matériaux).
5. Éluez le [¹²⁵I]CLINDE de la colonne avec 300 μL d’éthanol absolu, puis évaporez l’éthanol en l’incubant dans une centrifugeuse à vide à RT pendant 40 min.
6. Diluer le résidu contenant le [¹²⁵I]CLINDE dans 300 μL de solution saline stérile pour créer une solution mère.
7. Après avoir mesuré sa radioactivité, diluer la solution mère dans une solution saline stérile pour obtenir une solution de 0,037 MBq dans 500 μL.
8. Purifier le traceur par CLHP (chromatographie liquide à haute performance). Déterminez le temps d’élution à l’aide d’un étalonnage standard à 450 nm et isolez le pic radioactif unique. Effectuer la courbe d’étalonnage standard en utilisant sept concentrations étalons de CLINDE froid (non radioactif) (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg et 5 μg dans 400 μL d’une solution de 50% ACN). Établir la pureté radiochimique en mesurant un seul pic en radio TLC (chromatographie sur couche mince). Assurez-vous que la pureté du produit radiochimique est supérieure à 60%.
9. Vérifier l’activité spécifique du radioligand mesurant l’absorbance ultraviolette à 450 nm et les courbes d’étalonnage établies avec des composés de référence à froid. Assurez-vous que l’activité spécifique est supérieure à 1000 GBq/μmol.

4. [¹²⁵I]R91150 synthèse de radiotraceurs

REMARQUE : Assurez-vous de suivre les mêmes règles de sécurité que celles mentionnées dans la section synthèse CLINDE.

1. Mélanger 300 μg de précurseur R91150 dans une solution de 3 μL d’éthanol absolu, 3 μL d’acide acétique glacial, 15 μL de Na¹²⁵I sans support (voir tableau des matériaux) (10 mCi) dans 0,05 M NaOH et 3 μL de 30 %_H2O₂. Incuber pendant 30 min dans une boîte à gants.
2. Injecter la réaction entière dans une colonne de phase inverse (voir Tableau des matériaux).
3. Isoler [¹²⁵I]R91150 par HPLC isocratique (ACN/eau 50/50, tampon d’acide acétique de 10 mM) avec un débit de 3 mL/min.
4. Diluer [¹²⁵I]R91150 dans H₂O pour un volume final de 10 mL.
5. Injecter 10 mL de la réaction diluée sur une colonne de concentration (voir tableau des matériaux).
6. Elute [¹²⁵I]R91150 de la colonne avec 300 μL d’éthanol absolu.
7. Évaporer l’éthanol en l’incubant dans une centrifugeuse à vide à RT pendant 40 min.
8. Diluer le résidu contenant [¹²⁵I]R91150 dans 300 μL de solution saline.
9. Purifier le traceur par HPLC. Déterminer le temps d’élution à l’aide d’un étalonnage standard à 450 nm et isoler le pic radioactif unique. Établir la pureté radiochimique en mesurant un seul pic dans le TLC radio. Assurez-vous que la pureté du produit radiochimique est supérieure à 98%.

5. Préparation des animaux

1. Peser et anesthésier le rat TgF344-AD (mâle ou femelle, âgé de 2 à 24 mois) dans une chambre d’induction contenant 3% d’isoflurane. Une fois profondément anesthésié, abaissez le débit d’isoflurane à 2% (0,4 L / min, 100% O2) dans la chambre.
2. Placez l’animal sur un lit préchauffé équipé d’une nosecone d’anesthésie. Maintenir l’isoflurane à 2 % (0,4 L/min, 100 % O₂).
3. Appliquer un lubrifiant de gel oculaire dans les yeux de l’animal et confirmer la profondeur de l’anesthésie par surveillance respiratoire; ajuster l’anesthésie si nécessaire.
4. Effectuez l’insertion du cathéter 24 G dans la veine caudale.

6. Acquisition de SPECT

1. Transférez l’animal sur le lit de la caméra équipé d’un coussin chauffant à température contrôlée réglé à 38 °C (Figure 1E).
2. Fixez la tête de l’animal sur la barre de morsure et fixez les supports de la tête.
3. Configurez l’expérience sur un scan de 60 min constituant 60 images de 1 min. Réutilisez tous les autres paramètres configurés à l’étape 1. Cliquez sur le bouton Mettre à jour l’image pour mettre à jour la position de l’animal.
4. Définissez la zone de numérisation en faisant glisser les curseurs à l’aide des trois images dans la partie inférieure de l’écran pour les trois dimensions.
5. Injecter 500 μL du radiotraceur radioactif ([¹²⁵I]CLINDE ou [¹²⁵I]R91150), puis rincer le tube avec 300 μL de NaCl stérile à 0,9 %. Cliquez simultanément sur Démarrer l’acquisition pour lancer l’analyse.
6. Pendant la période de balayage, assurez-vous de maintenir l’animal sous anesthésie constante avec surveillance de la fréquence respiratoire. Ajustez le débit d’isoflurane si nécessaire.
7. Une fois le scan terminé, euthanasiez rapidement l’animal anesthésié par décapitation.

7. Reconstruction de numérisation

1. Ouvrez le logiciel de reconstruction de l’analyse (voir Table des matériaux), puis ouvrez l’ensemble de données, à la recherche du fichier [filename].parameters, créé dans le dossier de l’analyse.
2. Sélectionnez l’isotope qui vous intéresse. Notez que le paramètre Listmode permet la sélection de plusieurs isotopes à cette étape.
3. Sélectionnez les paramètres suivants : taille Voxel de 0,4 mm, 4 sous-ensembles (POS-EM), 6 itérations (équivalent 24ME-EM), pas de post-filtre et la correction de désintégration correspondante à l’isotope. Sélectionnez le format de sortie vers NIfTI, puis sélectionnez Démarrer la reconstruction SPECT .

8. Extraction cérébrale de rats

1. Dans le même cas anesthésique que la procédure de balayage et après avoir assuré l’état d’anesthésie profonde de l’animal en surveillant sa fréquence respiratoire, procédez à la décapitation par guillotine et transférez rapidement la tête sur le banc de dissection.
2. Avec des ciseaux, coupez soigneusement la peau sur le dessus de la tête de l’arrière vers l’avant jusqu’au milieu des yeux.
3. Coupez les muscles en excès autour de la base du crâne et des vertèbres cervicales.
4. Ensuite, placez soigneusement une lame des ciseaux dans le trou à l’arrière du crâne, le foramen magnum, et retirez la partie arrière du crâne avec une pince chirurgicale.
5. Ensuite, avec une pince chirurgicale, retirez soigneusement la partie supérieure du crâne. Le crâne des vieux rats mâles peut être épais, enlevé en petits morceaux pour éviter d’endommager le cerveau.
6. Coupez soigneusement les méninges avec des ciseaux. Les méninges peuvent endommager le cerveau pendant le processus d’extraction; retirez-le par précaution.
7. Après avoir retiré la partie supérieure du crâne, tournez la tête de l’animal et, avec une petite spatule plate, retirez soigneusement le cerveau en coupant les nerfs optique et trijumeau.
8. Transférez soigneusement le cerveau sur une surface de verre plane et propre pour la dissection sur la glace.
9. Utilisez une spatule métallique plate et une lame de rasoir pour disséquer les régions d’intérêt du cerveau. Placer les tissus dans un tube centrifuge de 2 mL et peser le tissu obtenu. Utilisez la section du cerveau directement pour l’isolement cellulaire ou congelez-la rapidement dans de l’azote liquide pour une utilisation ultérieure.

9. Isolement cellulaire

1. Assurez-vous de travailler dans un environnement propre et stérile. Il est conseillé de travailler sous une armoire de biosécurité de classe II (ESB). Assurez-vous que les gants et chaque pièce d’équipement introduite dans le BSC sont stériles.
2. Pour préparer les cellules au tri cellulaire, suivez le protocole de Jaclyn M. Schwarz¹⁴.
   REMARQUE: Dans cette expérience, un kit de dissociation neuronale disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux) a été utilisé pour la préparation des cellules.
   1. Mettez les échantillons dans un tube centrifuge de 2 mL avec 1 mL de HBSS (sans Ca et Mg), puis centrifugez (300 x g, 2 min, température ambiante = RT) et retirez le surnageant sans perturber la pastille.
   2. Ajouter 1900 μL de mélange d’enzymes-1 et l’incuber pendant 15 min à 37 °C tout en agitant les tubes par inversion toutes les 5 min.
   3. Ajouter 30 μL de mélange d’enzymes 2, agiter doucement avec la pipette 1 (voir tableau des matériaux) d’avant en arrière 30 fois. Ensuite, incuber pendant 15 min à 37 °C tout en agitant les tubes par inversion toutes les 5 min.
   4. Mélanger doucement d’avant en arrière avec la pipette 2, puis pipeter 3 avant d’incuber pendant 10 min à 37 °C pour dissocier les tissus.
   5. Filtrer les cellules avec une passoire cellulaire de 80 μm, ajouter 10 mL de HBSS (sans Ca et Mg). Centrifuger (300 x g, 10 min, RT) et retirer le surnageant sans perturber la pastille.
   6. Pour l’épuisement de la myéline, remettez en suspension la pastille avec 400 μL de tampon d’élimination de la myéline (voir tableau des matériaux), puis ajoutez 100 μL de billes d’élimination de myéline (voir tableau des matériaux), avant d’incuber pendant 15 min à 4 °C.
   7. Ajouter 5 mL de tampon d’élimination de la myéline, centrifuger (300 x g, 10 min, RT), et retirer le surnageant sans perturber la pastille.
   8. Ajouter 500 μL de tampon d’élimination de la myéline et placer le tube dans la colonne de champ magnétique. Lavez la colonne avec 1 mL de tampon d’élimination de la myéline quatre fois.
   9. Centrifuger (300 x g, 2 min, RT) et retirer le surnageant sans perturber la pastille. Vortex brièvement (2 s) pour dissocier les cellules et ajouter 5 μL de bloc Fc CD32. Vortex à nouveau et incubation pendant 5 min à 4 °C.
   10. Ajouter 100 μL du mélange d’anticorps primaires d’intérêt; incuber pendant 20 min à 4 °C.
   11. Centrifuger (350 x g, 5 min, 4 °C) et retirer le surnageant sans perturber la pastille. Épongez les tubes à l’envers sur du papier souple.
   12. Après un bref vortex (2 s), ajouter 100 μL du mélange d’anticorps secondaires et incuber pendant 15 min à 4 °C.
   13. Ajouter 2 mL de tampon d’élimination de la myéline, centrifuger (350 x g, 5 min, 4 °C) et retirer le surnageant sans perturber la pastille. Épongez les tubes à l’envers sur du papier souple. Resuspendez les cellules dans 250 μL de PBS stérile et procédez directement au tri cellulaire.

10. Tri des cellules

1. Préparer le tube de microfuge avec 500 μL de PBS stérile pour la collecte des cellules triées.
2. Ajouter 10 μL de Hoechst par 1000 μL de solution cellulaire pour colorer les noyaux des cellules vivantes et les distinguer des cellules mortes.
3. Transférer les cellules dès que possible à la machine de tri des cellules à 4 °C.
4. Tout d’abord, triez les cellules par dispersion vers l’avant et latéralement, puis triez les cellules positives de Hoechst. Ensuite, triez les cellules en fonction des anticorps d’intérêt. Collectez séparément les cellules colorées positivement. Assurez-vous de distinguer les cellules positives des cellules autofluorescentes.
5. Comptez le nombre de cellules triées pour chaque pool d’intérêt.

11. Comptage gamma

1. Étalonner le système de comptage γ avec 10 μL de la même solution fantôme utilisée pour l’étalonnage SPECT, mais le diluer dans 1 mL d’eau.
   REMARQUE: La solution fantôme est diluée en raison de la précision accrue du système de comptage γ.
2. Placez le tube des cellules triées dans le système de comptage γ et procédez au comptage γ selon le protocole du fabricant.

Résultats

Les rats WT ont subi un balayage TEMP in vivo avec le radiotraceur [¹²⁵I]CLINDE après une injection unilatérale de LPS (Figure 2). Ce scan (utilisant des données additionnées provenant d’images de 45 à 60 minutes après l’injection de radiotraceur) a montré une liaison plus élevée de [¹²⁵I]CLINDE dans le site de l’injection de LPS (Figure 2A) que dans la région controlatérale du cerveau (Figure ...

Discussion

À notre connaissance, cette technique a été la première à décrire une approche qui permet de mieux comprendre les altérations de liaison in vivo d’un radiotraceur au niveau cellulaire. Le protocole décrit une méthode multi-échelle pour quantifier la liaison des radiotraceurs au niveau cellulaire en utilisant [¹²⁵I]CLINDE (TSPO) ou [¹²⁵I]R91150 (5HT_2AR) comme exemples.

Cette technique est suffisamment robuste et sensible pour détecter avec ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
BioVet	BioVet		Software for vitals check
Bondclone C18 reverse-phase column	Phenomenex, Schlieren, Switzerland
Des-Sur	University Hospital of Geneva		Virucide
Fc Block / anti-CD32	BD Biosciences	BDB550270	Reactivity for rat
FITC-conjugated anti-rat CD90	Biolegend	202504	Reactivity for rat
Heparin	B. Braun	B01AB01
HPLC	Knauer
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm	BD Biosciences	321312	24 G catheter
Isoflurane	Baxter	ZDG9623
Lacryvisc	Alcon	2160699
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Micropore soft tape	3M	F51DA01
MILabs-Uspect II	MILabs		Software for SPECT Camera
MoFlo Astrios	Beckman Coulter		Cell sorter
Myelin Removal Beads II	Miltenyi Biotec	130-096-733	Contains beads and myelin removal buffer.
NaCl 0.9% Sterile solution	B. Braun	395202
Neural Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.
Nylon Mesh Sheet	Amazon	CMN-0074-10YD	40 inch width, 80 micron size mesh
Peracetic acid	Sigma-Aldrich
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
R91150 précursor	CERMN
Sep-Pak C18 Column	Waters		Concentration column
Sodium iodide Na125	PerkinElmer
Tributylin precursor	CERMN
U-SPECT Rec2.38c	MILabs	Version Rec2.38c	Software for SPECT images reconstruction
USPECT II	MILabs		Spect Camera
Wizard 3"	PerkinElmer		Gamma counter