使用遗传编码的Ca2 + 指示剂（GECI）对星形胶质细胞和神经元中的线粒体Ca2 + 摄取进行成像

摘要

该proctocol旨在为星形胶质细胞和神经元 中的体外 和 体内 线粒体Ca^{2 +} 成像提供一种方法。

摘要

线粒体Ca²⁺在控制细胞质Ca²⁺缓冲、能量代谢和细胞信号转导中起着关键作用。线粒体Ca^{2 +}超载导致各种病理状况，包括神经变性和神经系统疾病中的凋亡细胞死亡。在这里，我们提出了一种细胞类型特异性和线粒体靶向分子方法，用于体外和体内星形胶质细胞和神经元中的线粒体Ca^{2 +}成像。我们构建了编码线粒体靶向的Ca^{2 +}指示素（GECIs）GCaMP5G或GCaMP6s（GCaMP5G / 6s）的DNA质粒，具有星形胶质细胞和神经元特异性启动子gfaABC1D和CaMKII以及线粒体靶向序列（mito-）。对于体外线粒体Ca^{2 +}成像，质粒在培养的星形胶质细胞和神经元中转染以表达GCaMP5G / 6s。对于体内线粒体Ca^{2 +}成像，制备腺相关病毒载体（AAV）并将其注射到小鼠大脑中，以在星形胶质细胞和神经元的线粒体中表达GCaMP5G / 6s。我们的方法提供了一种有用的方法来成像星形胶质细胞和神经元中的线粒体Ca^{2 +}动力学，以研究细胞质和线粒体Ca^{2 +}信号传导之间的关系，以及星形胶质细胞 - 神经元相互作用。

引言

线粒体是动态的亚细胞器，被认为是能量产生的细胞动力源。另一方面，线粒体可以响应局部或胞质Ca^{2 +}上升而吸收基质中的Ca^{2 +。}线粒体Ca²⁺摄取影响线粒体功能，包括代谢过程，如三羧酸（TCA）循环的反应和氧化磷酸化，并在生理条件下调节Ca^{2 +}敏感蛋白^{1，2，3，4。}线粒体Ca^{2 +}超载也是细胞死亡的决定因素，包括各种脑部疾病^5，6，7中的坏死和凋亡。它导致线粒体通透性过渡孔（mPTPs）的打开和半胱天冬酶辅因子的释放，从而引发凋亡细胞死亡。因此，研究活细胞中的线粒体Ca^{2 +}动力学和处理非常重要，以更好地了解细胞生理学和病理学。

线粒体通过Ca²⁺摄取和流出之间的平衡来维持基质Ca^{2 +}稳态。线粒体Ca^{2 +}摄取主要由线粒体Ca^{2 +}单转运体（MCU）介导，而线粒体Ca^{2 +}外排由Na⁺-Ca^{2 +}-Li⁺交换子（NCLXs）和H⁺/ Ca^{2 +}交换子（mHCXs）8介导。平衡可以通过刺激G蛋白偶联受体（GPCRs）^{来干扰9。}线粒体Ca^{2 +}稳态也受线粒体缓冲的影响，形成不溶性xCa^{2 +}-xPO₄x-xOH复合物⁸。

细胞内和线粒体中Ca²⁺浓度（[Ca^2+]）的变化可以通过荧光或发光Ca²⁺指示剂进行评估。Ca²⁺与指示剂的结合导致光谱修饰，允许在活细胞中实时记录游离细胞[Ca^2+]。目前有两种类型的探针可用于监测细胞中的Ca^{2 +}变化:有机化学指示剂和遗传编码的Ca^{2 +}指示剂（GECI）。通常，对于所研究的生物学问题，可以使用具有不同Ca^{2 +}亲和力（基于K_d），光谱特性（激发和发射波长），动态范围和灵敏度的不同变体。虽然许多合成的有机Ca²⁺指示剂已被用于胞质Ca²⁺成像，但只有少数可以选择性地加载到线粒体基质中用于线粒体Ca²⁺成像，其中Rhod-2是使用最广泛的（评论见10，11）。然而，Rhod-2在长时间的实验中存在泄漏的主要缺点;此外，它在线粒体，其他细胞器和细胞质基质之间分配，使得不同亚部门的绝对测量变得困难。相反，通过使用细胞型特异性启动子和亚细胞区室靶向序列，GECI可以在不同的细胞类型和亚细胞区室中表达，以便在体外或体内进行细胞和区室特异性Ca^{2 +}成像。基于单波长荧光强度的GCaMP Ca²⁺指标最近成为GECIs^{的主要指标12、13、14、15、16。}在本文中，我们提供了星形胶质细胞和神经元中GCaMP5G和GCaMP6s（GCaMP5G / 6s）的线粒体靶向和细胞类型特异性表达的方案，以及成像这些细胞类型中的线粒体Ca^{2 +}摄取。使用该协议，可以揭示单个线粒体中GCaMP6G / 6s的表达，并且可以在体外和体内的星形胶质细胞和神经元中实现单个线粒体分辨率中的Ca^{2 +}摄取 。

研究方案

涉及动物的程序已获得密苏里大学哥伦比亚分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. DNA质粒的构建

注意:对于 体外 和 体内 成像，构建编码GCaMP5G / 6s的DNA质粒与星形胶质细胞和神经元特异性启动子以及线粒体靶向序列。

1. 将线粒体基质（MM）靶向序列（mito-）插入ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCCCAA GATCCATTCG^{TTG 17}到腺相关病毒（AAV）质粒pZac2.1骨架中的克隆位点EcoRI和BamHI中，以获得含有星形细胞gfaABC₁D启动子或神经元CaMKII启动子^18，19，20的质粒。
2. 亚克隆GCaMP5G/6s进入克隆位点BamH I和Not 1中的上述质粒，得到新的质粒pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s和pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s，靶向星形胶质细胞和神经元中线粒体中的转基因表达^20，21（图1A）。
3. 制备pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G和pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA质粒用于 体外 研究转染（第2节）。产生AAV载体，血清型5用于星形胶质细胞，血清型9用于神经元，用于 体内 研究^18（ 第3节）。

2. 星形胶质细胞和神经元中的 体外 线粒体Ca²⁺ 成像

1. 准备来自P1新生小鼠皮层的原代星形胶质细胞和来自E15-16胚胎^{18，22，23，24}皮层的原代神经元^，并使用含有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改性鹰培养基（DMEM）和含有2%B27的神经元基础培养基（NBM）在24孔板中培养它们， 分别。
2. 使用基于脂质的转染试剂，用pZac-gfaABC1D-GCaMP6s和pZac-CaMKII-GCaMP5G质粒转染成熟的星形胶质细胞和神经元，以表达星形胶质细胞线粒体中的GCaMP6s和神经元线粒体中的GCaMP5G 18，20，21。用0.5μgDNA转染每个孔中的细胞，并在6小时后更换培养基。
   注意:星形胶质细胞和神经元在转染后1-2天准备好进行成像。
3. 转染后^1-2天进行体外线粒体Ca 2 +成像。
   1. 将用星形胶质细胞或神经元培养的玻璃盖玻片转移到落射荧光或两个光子显微镜下的PH-1灌注室。
   2. 在ACSF中用100μM ATP刺激星形细胞线粒体Ca^{2 +}摄取，或用100μM谷氨酸/ 10μM甘氨酸^20，25刺激神经元线粒体（图2和图3）。
      注:溶液从ACSF到ATP-和谷氨酸/含甘氨酸的ACSF的变化由ALA-VM8灌注系统²¹控制。通过调节阀门，溶液变化的速度控制在1-2 mL / min。

3. 星形胶质细胞和神经元中的 体内 线粒体Ca²⁺ 成像

1. AAV准备工作。
   1. 使用第1节中制备的DNA质粒制备以下重组腺相关病毒（rAAV）载体:rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G和rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s载体。
      注意:在本实验中，制备了血清型5的rAAV载体以在星形胶质细胞的线粒体中表达GCaMP5G，并且制备了血清型9的rAAV载体以在神经元的线粒体中表达GCaMP6s。
2. 立体定位 AAV 注入。
   1. 用3%异氟醚麻醉小鼠。
      注意:在手术后期，异氟醚水平降低到2%。
   2. 在小鼠达到手术麻醉水平后，如尾巴和脚趾捏合所决定的那样，用修剪器将毛发剃除在手术部位，运动或躯体感觉皮层上。
   3. 将鼠标放在鼠标立体定位设备上，并用耳杆固定头部。在手术过程中将眼药膏涂抹在眼睛上以保护眼睛。在整个手术过程中，使用加热垫将小鼠的体温保持在37°C。
      注意:使用无菌程序进行手术。所有手术工具都需要通过高压灭菌或热珠灭菌器进行灭菌。
   4. 将鼠标安装在立体定位装置上后，用交替的碘基磨砂膏和70%乙醇对头皮进行消毒三次。在头皮中线做一个切口，露出注射部位。
   5. 在bregma-lamda轴上切开皮肤，并在电机或躯体感觉皮层的预期注射位置用高速钻头创建一个〜1mm直径的毛刺孔。
   6. 使用含有腺相关病毒（rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G 载体 [1 x 10¹¹ GC] 或 rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s 载体 [1 x 10 11 GC]）的³³ G Hamilton 注射器在靶区注射多达 1 μL 病毒。
      注意:例如，对于皮质病毒递送，分多个步骤在两个深度注射病毒溶液。首先，将针头插入距硬脑膜1毫米的深度，并允许5分钟让大脑恢复。然后，将针头向上移动至~700μm深度，并使用由微注射器泵控制器控制的汉密尔顿注射器以10 nL / s的注射速度注入500 nL病毒溶液。注射完成后，等待5分钟，让病毒扩散到大脑中。然后，将针头向上移动到深度为300μm的第二个注射位置。在这里，再注射500 nL的病毒溶液。等待10分钟，让病毒扩散到大脑中。
   7. 使用组织粘合剂关闭头皮和皮肤。让小鼠在加热垫上恢复。恢复后将小鼠送回动物设施。
3. 线粒体Ca 2+信号的颅窗安装和 体内双光子^（2-P） 成像。
   注意:颅窗植入在AAV注射后3周在运动或躯体感觉皮层26，27，28，29上进行。卡洛芬（10mg / kg）皮下注射，以缓解手术前的潜在疼痛。颅窗外科手术与AAV注射外科手术相同，并且在无菌条件下进行。
   1. 用3%异氟醚麻醉小鼠。
      注意:这是初始剂量，以后的手术减少到2%。在成像过程中，腹膜内注射130mg氯胺酮/ 10mg木屈嗪/ kg体重溶解在ACSF中用于麻醉。
   2. 将鼠标放在鼠标立体定位设备上，并用耳杆固定头部。将眼药膏涂抹在眼睛上。在整个手术过程中，使用加热垫将小鼠的体温保持在37°C。
      注意:所有手术工具都需要消毒。
   3. 在头皮中线做一个5-8毫米长的切口，用一把剪刀去除皮瓣。
   4. 颅骨暴露后，使用高速钻头在病毒注射区域（即运动皮层或躯体感觉皮层， 图1B）上进行直径2.0-3.0毫米的开颅手术。首先，做四个小孔，然后沿着连接孔的圆圈钻孔。然后，用锋利的剪刀抬起并取出骨头并移除。暴露的硬脑膜可以被移除或保持完整，以插入颅窗。
   5. 将直径为3-5毫米的玻璃盖玻片放在开颅手术上，并在开颅手术上携带透明硅胶。用牙签将颅窗轻轻推到大脑表面。然后，用少量硅胶粘合剂密封边缘。
      注意:或者，可以在盖玻片和脑组织之间使用1.2%的低熔点琼脂糖凝胶代替硅胶盘。
   6. 最后，用牙胶密封盖玻片的边缘。小心将水泥稍微涂抹在颅窗的边缘，以牢固粘合。用牙胶将定制的金属头板连接到颅骨上。
      注:金属板用于在成像过程中将鼠标头部固定在2-P显微镜的载物台上（图1C）。
   7. 在颅窗的盖玻片上加入0.5 mL ACSF溶液，以便在成像过程中浸入水中。
   8. 在星形胶质细胞中对丝裂-GCaMP5G和丝裂GCaMP6s中的神经元进行延时2-P成像，波长为910nm，通过颅窗（图1C）18，20，27。
      注意:在成像过程中，小鼠在加热垫上以保持生理温度。小鼠将在成像过程结束后立即被处死。
   9. 当需要确定共定位时，用磺酰罗达明101（SR101） 在体内 标记星形胶质细胞。
      1. 在步骤3.3.4结束时，在皮质表面上将100μL100μM SR101在ACSF中施用1-5分钟。
      2. 用ACSF冲洗表面，洗去未绑定的SR101。使用2-P成像，可以在45-60分钟后观察到星形胶质细胞中mito-GCaMP5G和SR101的共同标记（图4A）。

结果

本研究的目的是提供一种方法，在体外和体内使用星形胶质细胞和神经元中的GECI对线粒体Ca^{2 +}信号进行成像。本文给出了体外和体内线粒体Ca^{2 +}成像的结果。

培养的星形胶质细胞和神经元中的体外线粒体Ca^{2 +}信号传导
星形胶质细胞中的线粒体Ca^{2 +}摄取可以通...

讨论

在本文中，我们提供了一种用于成像星形胶质细胞和神经元中线粒体Ca^{2 +}信号的方法和方案。我们实施了线粒体靶向和细胞类型特异性策略来表达GECI GCaMP5G / 6s。为了靶向线粒体中的GCaMP5G / 6s，我们在质粒中加入了线粒体靶向序列。为了在体内星形胶质细胞和神经元中表达GCaMP5G/6s，我们将星形胶质细胞特异性启动子gfaABC1D和神经元特异性启动子CaMKII插入质粒中。星形胶质细胞和神经?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight