Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)

Resumo

Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca²⁺ em astrócitos e neurônios.

Resumo

Mitocondrial Ca²⁺ desempenha um papel crítico no controle do tampão citosolico Ca^2+, metabolismo energético e transdução de sinal celular. A sobrecarga do Ca²⁺ mitocondrial contribui para várias condições patológicas, incluindo neurodegeneração e morte celular apoptótica em doenças neurológicas. Aqui apresentamos um tipo celular específico e mitocôndrias visando abordagem molecular para imagem mitocondrial Ca²⁺ em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo. Construímos plasmídeos de DNA codificando mitocôndrias com alvo genético de indicadores Ca²⁺ codificados geneticamente (GECIs) GCaMP5G ou GCaMP6s (GCaMP5G/6s) com promotores específicos de astrócitos e neurônios gfaABC1D e CaMKII e sequência de alvo de mitocôndrias (mito-). Para imagens mitocondriais in vitro Ca^2+, os plasmídeos foram transfectados em astrócitos e neurônios cultivados para expressar GCaMP5G/6s. Para imagens in vivo mitocondrial Ca^2+, vetores virais associados a Adeno (AAVs) foram preparados e injetados nos cérebros do camundongo para expressar GCaMP5G/6s em mitocôndrias em astrócitos e neurônios. Nossa abordagem fornece um meio útil para a imagem mitocondrial Ca²⁺ dinâmica em astrócitos e neurônios para estudar a relação entre a sinalização citosolic e mitocondrial Ca^2+, bem como interações astrócito-neurônio.

Introdução

Mitocôndrias são organelas subcelulares dinâmicas e são consideradas como potências celulares para produção de energia. Por outro lado, as mitocôndrias podem levar o Ca²⁺ à matriz em resposta aos aumentos locais ou citosóicos ca^2+. A absorção mitocondrial Ca²⁺ afeta a função mitocondrial, incluindo processos metabólicos como reações no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e fosforilação oxidativa, e regula as proteínas sensíveis ca²⁺em condições fisiológicas^1,2,3,4. A sobrecarga mitocondrial Ca²⁺ também é determinante para a morte celular, incluindo necrose e apoptose em vários distúrbios cerebrais^5,6,7. Causa a abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTPs) e a liberação do cofator caspase, que iniciam a morte celular apoptótica. Por isso, é importante estudar melhor a dinâmica mitocondrial ca²⁺ e o manuseio em células vivas para entender melhor a fisiologia celular e a patologia.

Mitocôndrias mantêm a matriz Ca²⁺ homeostase através de um equilíbrio entre a absorção de Ca²⁺ e o efflux. A captação mitocondrial Ca²⁺ é mediada principalmente por semportadores mitocondriais Ca²⁺ (MCUs), enquanto o efflux Mitocondrial Ca²⁺ é mediado pelos trocadores Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ (NCLXs) e pelos trocadores H⁺/Ca²⁺ (mHCXs)⁸. O equilíbrio pode ser perturbado através da estimulação de receptores acoplados de proteína G (GPCRs)⁹. Mitocondrial Ca²⁺ homeostasis também é afetada pelo tampão mitocondrial pela formação de complexos insolúveis xCa²⁺-xPO₄x-xOH⁸.

Alterações intracelulares e mitocondriais na concentração de Ca²⁺ ([Ca²⁺]) podem ser avaliadas por indicadores fluorescentes ou luminescentes Ca^2+. A vinculação ca²⁺ aos indicadores causa modificações espectrais, permitindo o registro de celular gratuito [Ca²⁺] em tempo real em células ao vivo. Atualmente, dois tipos de sondas estão disponíveis para monitorar as alterações do Ca^2+nas células: indicadores químicos orgânicos e indicadores ca²⁺ (GECIs) codificados geneticamente. Geralmente, diferentes variantes com diferentes afinidades ca²⁺ (baseadas em K_d),propriedades espectrais (comprimentos de onda de excitação e emissão), faixas dinâmicas e sensibilidades estão disponíveis para as questões biológicas sob investigação. Embora muitos indicadores orgânicos sintéticos Ca²⁺ tenham sido utilizados para imagens citosócidas Ca^{2+, apenas} alguns podem ser carregados seletivamente na matriz mitocondrial para imagem mitocondrial Ca^2+, sendo Rhod-2 o mais utilizado (para revisões ver^10,11). No entanto, o Rhod-2 tem uma grande desvantagem de vazamento durante experimentos de longo curso; além disso, é particionada entre mitocôndrias, outras organelas e o citosol, dificultando as medições absolutas em diferentes subcomentamentos. Em contraste, usando promotores específicos do tipo celular e sequências de segmentação de compartimentos subcelulares, os GECIs podem ser expressos em diferentes tipos de células e compartimentos subcelulares para imagens Ca²⁺ específicas para células e compartimentos in vitro ou in vivo. Os indicadores GCaMP Ca²⁺ baseados em intensidade de comprimento único surgiram recentemente como principais GECIs^{12,13,14,15,16}. Neste artigo, fornecemos um protocolo para a segmentação de mitocôndrias e expressão específica do tipo celular de GCaMP5G e GCaMP6s (GCaMP5G/6s) em astrócitos e neurônios, e a absorção mitocondrial ca²⁺ de imagem nesses tipos de células. Usando este protocolo, a expressão de GCaMP6G/6s em mitocôndrias individuais pode ser revelada, e a absorção do Ca²⁺ em resolução mitocondrial única pode ser alcançada em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo.

Protocolo

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Missouri-Columbia.

1. Construção de plasmídeos de DNA

NOTA: Para imagens in vitro e in vivo, plasmídeos de DNA codificam GCaMP5G/6s com promotores específicos de astrócitos e neurônios e sequências de alvo mitocondrial.

1. Inserir matriz mitocondrial (MM)-targeting sequence (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG¹⁷ no clon sites de regência EcoRI e BamHI na espinha dorsal do vírus associado ao adeno (AAV) plasmídeo pZac2.1 para obter plasmídeos contendo gfaABC₁D promotor astrocítico ou promotor neuronal caMKII^18,19,20.
2. Subclone GCaMP5G/6s nos locais de clonagem BamH I e Não 1 nos plasmídeos acima para obter novos plasmids pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5 G/6s e pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s que visam a expressão transgênica em mitocôndrias em astrócitos e neurônios^20,21 (Figura 1A).
3. Prepare os plasmídeos de DNA pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s para transfecção para estudo in vitro (Seção 2). Produzir vetores AAV com sorotipo 5 para astrócitos e sorotipo 9 para neurônios para o estudo in vivo ¹⁸ (Seção 3).

2. Imagem mitocondrial in vitro Ca²⁺ em astrócitos e neurônios

1. Prepare os astrócitos primários do córtex de camundongos neonatais P1 e neurônios primários do córtex dos embriões E15-16^18,22,23,24, e cultue-os em deslizamento de vidro de 12 mm de diâmetro em placas de 24 poços usando o DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e meio basal neuronal (NBM) contendo 2% de B27, respectivamente.
2. Transfeito astrócitos maduros e neurônios com pZac-gfaABC1D-GCaMP6s e pZac-CaMKII-GCaMP5G plasmídeos usando reagente de transfecção à base de lipídio para expressar GCaMP6s nas mitocôndrias de astrócitos e GCaMP5G nas mitocôndrias dos neurônios^18,20,21. Transfectar células em cada poço com 0,5 μg de DNA, e alterar o meio 6 h depois.
   NOTA: Os astrócitos e neurônios estão prontos para a imagem 1-2 dias após a transfecção.
3. Realize imagens in vitro mitocondrial Ca²⁺ 1-2 dias após a transfecção.
   1. Transfira as tampas de vidro cultivadas com astrócitos ou neurônios para a câmara de perfusão PH-1 sob uma epifluorescência ou dois microscópios de fótons.
   2. Estimule a absorção mitocôndrial ac²⁺ com 100 μM ATP em ACSF, ou estimule mitocôndrias neuronais com 100 μM de glutamato/10 μM glycina^20,25 (Figura 2 e Figura 3).
      NOTA: As alterações de solução do ACSF para o ACSF contendo GLinato/glinato/glico são controladas por um sistema de perfusão ALA-VM8²¹. A velocidade da mudança da solução é controlada a 1-2 mL/min ajustando uma válvula.

3. In vivo mitocondrial Ca²⁺ imagem em astrócitos e neurônios

1. Preparações AAV.
   1. Prepare os seguintes vetores de vírus adeno associados à adenina (rAAV) usando os plasmídeos de DNA preparados na seção 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vetores.
      NOTA: Neste experimento, os vetores rAAV do sorotipo 5 foram preparados para expressar GCaMP5G em mitocôndrias em astrócitos e vetores rAAV do sorotipo 9 foram preparados para expressar GCaMP6s em mitocôndrias em neurônios.
2. Injeção de AAV estereutribicic.
   1. Anestesiar o rato com 3% de isoflurano.
      NOTA: Mais tarde, durante a cirurgia, os níveis de isoflurane são reduzidos para 2%.
   2. Depois que o camundongo atinge um nível cirúrgico de anestesia, conforme determinado por pinça de cauda e dedo do pé, raspe o cabelo sobre o local da cirurgia, córtex motor ou somatosensorial, com um aparador de cabelo.
   3. Posicione o mouse no dispositivo estereotaxic do mouse e fixe a cabeça com barras de ouvido. Aplique pomada oftalmológica nos olhos para protegê-los durante a cirurgia. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C durante toda a cirurgia.
      NOTA: Realizar cirurgia utilizando procedimentos assépticos. Todas as ferramentas cirúrgicas precisam ser esterilizadas por autoclaving ou por um esterilizador de contas quentes.
   4. Depois que o mouse é montado no dispositivo estereotaxico, esterilize o couro cabeludo com esfoliação alternada à base de iodo e 70% de etanol três vezes. Faça uma incisão no meio do couro cabeludo para expor o local da injeção.
   5. Corte a pele no eixo bregma-lamda e crie um orifício de rebarba de ~1 mm de diâmetro com uma broca de alta velocidade no local de injeção pretendido do motor ou córtex somatosensorial.
   6. Use uma seringa Hamilton de 33 G contendo vírus associado ao adeno (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G vetores [1 x 10¹¹ GC] ou rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vetores [1 x 10¹¹ GC]) para injetar até 1 μL de vírus na área alvo.
      NOTA: Por exemplo, para o parto viral cortical, injete a solução do vírus em duas profundidades em várias etapas. Primeiro, insira a agulha a uma profundidade de 1 mm da dura e deixe 5 minutos para o cérebro se recuperar. Em seguida, mova a agulha até ~700 μm de profundidade e injete 500 nL da solução do vírus a uma velocidade de injeção de 10 nL/s usando uma seringa hamilton controlada por um controlador de bomba de microsinga. Depois que a injeção for concluída, espere 5 minutos para permitir que o vírus se difunda no cérebro. Em seguida, mova a agulha até o segundo local de injeção a uma profundidade de 300 μm. Aqui, injete mais 500 nL da solução do vírus. Espere 10 minutos para permitir que o vírus se difunda no cérebro.
   7. Feche o couro cabeludo e a pele usando um adesivo de tecido. Deixe os ratos se recuperarem na almofada de aquecimento. Mande ratos de volta para a instalação animal após a recuperação.
3. Intstallação de janela cranial e imagem in vivo de dois fótons (2-P) de sinais mitocondriais Ca^2+.
   NOTA: A implantação da janela craniana é feita 3 semanas após a injeção de AAV sobre o córtex motor ou somatosensorial^26,27,28,29. O carprofeno (10 mg/kg) é injetado subcutâneamente para aliviar a dor potencial antes da cirurgia. Os procedimentos cirúrgicos da janela craniana são idênticos aos procedimentos cirúrgicos de injeção de AAV e são realizados em condições assépticas.
   1. Anestesiar o rato com 3% de isoflurano.
      NOTA: Esta é a dose inicial e reduza para 2% para a cirurgia mais tarde. Durante a imagem, uma injeção intraperitoneal (IP) de 130 mg de cetamina/10 mg de xilazína/kg de peso corporal dissolvido em ACSF é usada para anestesia.
   2. Posicione o mouse no dispositivo estereotaxic do mouse e fixe a cabeça com barras de ouvido. Aplique pomada oftálmica aos olhos. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C durante toda a cirurgia.
      NOTA: Todas as ferramentas cirúrgicas precisam ser esterilizadas.
   3. Faça uma incisão de 5-8 mm de comprimento na linha média do couro cabeludo e remova uma aba de pele usando um par de tesouras.
   4. Após a exposição do crânio, realize craniotomia de 2,0-3,0 mm de diâmetro usando uma broca de alta velocidade sobre a área injetada pelo vírus (ou seja, córtex motor ou córtex somatosensorial, Figura 1B). Primeiro, faça quatro pequenos furos, e depois faça um círculo conectando os buracos. Em seguida, levante e remova o osso com uma tesoura afiada e retire. A dura-máter exposta pode ser removida ou mantida intacta para impantação da janela craniana.
   5. Coloque uma tampa de vidro de 3-5 mm de diâmetro carregando um silicone transparente sobre a craniotomia. Use um palito para empurrar a janela craniana suavemente para a superfície do cérebro. Em seguida, sele a borda com uma pequena quantidade de adesivo de silicone.
      NOTAs: Alternativamente, em vez de disco de silicone, 1,2% de baixo gel de ponta de fusão pode ser usado entre o vidro de cobertura e o tecido cerebral.
   6. Por fim, sele as bordas do deslizamento com cimento dental. Tome cuidado para aplicar o cimento ligeiramente na borda da janela craniana para uma ligação forte. Coloque uma placa de metal personalizada no crânio com cimento dental.
      NOTA: A placa metálica é usada para fixar a cabeça do mouse ao estágio do microscópio 2-P durante a sessão de imagem(Figura 1C).
   7. Adicione 0,5 mL de solução ACSF sobre o deslizamento de cobertura na janela craniana para imersão de água durante a imagem.
   8. Realize o time-lapse in vivo 2-P de imagem de mito-GCaMP5G em astrócitos e mito-GCaMP6s em neurônios com comprimento de onda de 910 nm através da janela craniana(Figura 1C)^18,20,27.
      NOTA: Durante a imagem, os ratos estão na almofada de aquecimento para manter a temperatura fisiológica. Os ratos serão sacrificados imediatamente após a sessão de imagem ser concluída.
   9. Rotular astrócitos in vivo com sulforhodamina 101 (SR101) quando for necessário determinar a colocalização.
      1. Ao final da etapa 3.3.4, aplique 100 μL de 100 μM SR101 em ACSF na superfície cortical por 1-5 min.
      2. Enxágüe a superfície com ACSF para lavar o SR101 desvinculado. Utilizando imagens 2-P, a co-rotulagem de mito-GCaMP5G e SR101 em astrócitos pode ser observada 45-60 min depois(Figura 4A).

Resultados

O objetivo deste estudo foi fornecer uma metodologia para a imagem mitocondrial Ca²⁺ sinais utilizando GECIs em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo. Os resultados das imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca²⁺ são apresentados aqui.

Sinalização mitocondrialin vitro Ca²⁺ em astrócitos e neurônios cultivados
A absorção mitocondria...

Discussão

Neste artigo, fornecemos um método e protocolo para imagens mitocondrial Ca²⁺ sinais em astrócitos e neurônios. Implementamos estratégias específicas de segmentação de mitocôndrias e tipo celular para expressar GECI GCaMP5G/6s. Para atingir GCaMP5G/6s em mitocôndrias, incluímos uma sequência de metas de mitocôndrias nos plasmídeos. Para expressar GCaMP5G/6s em astrócitos e neurônios in vivo,inserimos um promotor específico de astrócito gfaABC1D e promotor específico de neurônios CaM...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight