הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

Summary

פרוקטוקול זה נועד לספק שיטה במבחנה ובהדמיה של ויוו מיטוכונדריאלי Ca²⁺ באסטרוציטים ונוירונים.

Abstract

Mitochondrial Ca²⁺ ממלא תפקיד קריטי בשליטה על אגירה ציטסולית Ca²⁺ , חילוף חומרים של אנרגיה, טרנסדוקציה של אותות הסלולר. עומס יתר של Ca² + מיטוכונדריאלי תורם למצבים פתולוגיים שונים, כולל ניוון עצבי ומוות תאים אפופטוטיים במחלות נוירולוגיות. כאן אנו מציגים סוג תא ספציפי ומיטוכונדריה מיקוד גישה מולקולרית עבור הדמיה מיטוכונדריאלית Ca^{2 +} אסטרוציטים נוירונים במבחנה ו in vivo. בנינו פלסמידים DNA קידוד מיטוכונדריה מיקוד גנטית מקודדים גנטית Ca^{2 +} אינדיקטורים (GECIs) GCaMP5G או GCaMP6s (GCaMP5G/6s) עם אסטרוציטים- נוירון ספציפיים ליזמים gfaABC1D ו- CaMKII ורצף מיקוד mitochondria (mito-). עבור הדמיה מיטוכונדריאלית במבחנה Ca²⁺ , הפלסמידים הועברו לאסטרוציטים ונוירונים מתורבתים כדי לבטא GCaMP5G/6s. עבור הדמיה מיטוכונדריאלית Ca²⁺ ב- vivo, וקטורים ויראליים הקשורים לאדנו (AAVs) הוכנו והוזרקו למוחות העכבר כדי לבטא GCaMP5G/6s במיטוכונדריה באסטרוציטים ונוירונים. הגישה שלנו מספקת אמצעי שימושי כדי לדמיין דינמיקה מיטוכונדריאלית Ca²⁺ אסטרוציטים נוירונים כדי ללמוד את הקשר בין איתות ציטוטוסולי ומיטוכונדריאלי Ca^{2 +} , כמו גם אינטראקציות אסטרוציטים-נוירונים.

Introduction

המיטוכונדריה הם אברונים תת-תאיים דינמיים ונחשבים למוקדי הכוח של התא לייצור אנרגיה. מצד שני, המיטוכונדריה יכולה לקחת את Ca²⁺ למטריקס בתגובה מקומי או ציטוסולי Ca^{2 +} עולה. ספיגת ספיגת Ca²⁺ מיטוכונדריאלית משפיעה על תפקוד מיטוכונדריאלי, כולל תהליכים מטבוליים כגון תגובות במחזור חומצה טריקרבוקסילית (TCA) וזרחן חמצוני, ומסדירה Ca^{2 +}חלבונים רגישים בתנאים פיזיולוגיים^1,2,3,4. מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} עומס יתר הוא גם דטרמיננטה למוות תאים, כולל נמק ואפופטוזיס בהפרעות מוחיות שונות^5,6,7. זה גורם לפתיחה של נקבוביות מעבר חדורות מיטוכונדריאליות (mPTPs) ושחרור של קופקטור caspase, אשר ליזום מוות תא אפופטוטי. לכן, חשוב ללמוד דינמיקה מיטוכונדריאלית Ca²⁺ וטיפול בתאים חיים כדי להבין טוב יותר את הפיזיולוגיה והפתולוגיה התאית.

המיטוכונדריה שומרת על מטריצה Ca²⁺ הומאוסטזיס באמצעות איזון בין ספיגת Ca²⁺ לשפכים. ספיגת קיקיון מיטוכונדריאלי Ca²⁺ מיושר בעיקר על ידי uniporters מיטוכונדריאלי^{2 +} (MCUs), בעוד Ca^{2 +} שפכים מיטוכונדריאליים הוא בתיווך Na⁺-Ca^{2 +}- Li⁺ מחליפים (NCLXs) ואת H⁺/ Ca^{2 +} מחליפים (mHCXs)⁸. האיזון יכול להיות מוטרד באמצעות גירוי של קולטנים מצמידים חלבון G (GPCRs)⁹. מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} הומאוסטזיס מושפע גם על ידי אגירה מיטוכונדריאלית על ידי היווצרות של xCa^{מסיס 2 +}-xPO₄x-xOH מתחמים⁸.

שינויים תאיים ומיטוכונדריאליים בריכוז Ca²⁺ ([Ca²⁺]) ניתן להעריך על ידי אינדיקטורים פלורסנט או זוהר Ca²⁺ . Ca²⁺ איגוד אינדיקטורים גורם לשינויים ספקטרליים, המאפשר הקלטה של תאים חינם [Ca²⁺] בזמן אמת בתאים חיים. שני סוגים של בדיקות זמינים כעת לניטור שינויים Ca²⁺ בתאים: אינדיקטורים כימיים אורגניים ומחווני Ca²⁺ מקודדים גנטית (GECIs). בדרך כלל, גרסאות שונות עם זיקות שונות של Ca²⁺ (בהתבסס על K_d),תכונות ספקטרליות (עירור ואורכי גל פליטה), טווחים דינמיים ורגישויות זמינים לשאלות הביולוגיות הנחקרות. למרות אינדיקטורים אורגניים סינתטיים רבים Ca^{2 +} שימשו עבור הדמיה ציטוטוסולי Ca^{2 +} , רק כמה ניתן לטעון באופן סלקטיבי במטריצה המיטוכונדריאלית עבור הדמיה מיטוכונדריאלית Ca^{2 +} , עם רוד-2 להיות הנפוץ ביותר (עבור ביקורות לראות^10,11). עם זאת, לרוד-2 יש חיסרון גדול של דליפה במהלך ניסויים ארוכים; בנוסף, הוא מחולק בין המיטוכונדריה, אברונים אחרים ואת cytosol, מה שהופך מדידות מוחלטות subcompartments שונים קשה. לעומת זאת, באמצעות מקדמים ספציפיים מסוג תא ורצפי פילוח תאים תת-תאיים, GECIs יכולים לבוא לידי ביטוי בסוגי תאים ותאים תת-תאיים שונים להדמיית Ca²⁺ ספציפי לתאים ולאדר במבחנה או ב- vivo. מדדי GCaMP Ca²⁺ מבוססי עוצמת פלואורסצנטיות באורך גל אחד התגלו לאחרונה כמדדי GECIs גדולים^{12,13,14,15,16}. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור מיטוכונדריה-פילוח וביטוי ספציפי סוג התא של GCaMP5G ו- GCaMP6s (GCaMP5G/6s) אסטרוציטים נוירונים, הדמיה ספיגת Ca²⁺ מיטוכונדריאלי בסוגי תאים אלה. באמצעות פרוטוקול זה, הביטוי של GCaMP6G/6s במיטוכונדריה בודדת ניתן לגלות, ו ספיגת Ca^{2 +} ברזולוציה מיטוכונדריאלית אחת ניתן להשיג אסטרוציטים נוירונים במבחנה ו in vivo.

Protocol

נהלים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטת מיזורי-קולומביה.

1. בניית פלסמידים DNA

הערה: עבור דימות במבחנה ובהדמיית ויוו, נבנים פלסמידים DNA המקודדים GCaMP5G/6s עם מקדמים ספציפיים לאסטרוציטים ונוירונים ורצפי פילוח מיטוכונדריאליים.

1. Insert מטריצה מיטוכונדריאלית (MM)-targeting sequence (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG¹⁷ לתוך אתרי שיבוט EcoRI ו BamHI בעמוד השדרה של וירוס הקשורים אדנו (AAV) plasmid pZac2.1 כדי להשיג plasmids המכילים מקדם אסטרוציטי gfaABC₁D או מקדם CaMKII עצבי^18,19,20.
2. תת-קלון GCaMP5G/6s לאתרי השיבוט BamH I ולא 1 ב plasmids לעיל כדי להשיג פלסמידים חדשים pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s ו pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s המתמקדים בביטוי טרנסג'נדריה במיטוכונדריה באסטרוציטים ונוירונים^20,21 (איור 1A).
3. הכן pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G ו pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA plasmids עבור transfection למחקר במבחנה (סעיף 2). הפיקו וקטורים AAV עם סרוטיפ 5 עבור אסטרוציטים וסרוטיפ 9 עבור נוירונים למחקר ויוו ¹⁸ (סעיף 3).

2. אין ויטרו מיטוכונדריאלי Ca²⁺ הדמיה אסטרוציטים ונוירונים

1. הכן אסטרוציטים ראשוניים מקליפת המוח של עכברי יילודים P1 ונוירונים ראשוניים מקליפת המוח של עוברים E15-16^18,22,23,24, ותרבות אותם על כיסויי זכוכית בקוטר 12 מ"מ בצלחות 24-well באמצעות מדיום הנשר המותנה של Dulbecco (DMEM) המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS), ובינוני בזאלי עצבי (NBM) המכיל 2% B27, בהתאמה.
2. תות-תולה אסטרוציטים בוגרים ונוירונים עם pZac-gfaABC1D-GCaMP6s ו pZac-CaMKII-GCaMP5G plasmids באמצעות ריאגנט טרנספקטציה על בסיס שומנים בדם כדי לבטא GCaMP6s במיטוכונדריה של אסטרוציטים ו- GCaMP5G במיטוכונדריה של נוירונים^18,20,21. מעבירים תאים בכל באר עם 0.5 מיקרוגרם של דנ"א, ומשנים את המדיום 6 שעות מאוחר יותר.
   הערה: האסטרוציטים והנוירונים מוכנים להדמיה 1-2 ימים לאחר ההדבקה.
3. לבצע במבחנה מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} הדמיה 1-2 ימים לאחר transfection.
   1. העבר את כיסויי הזכוכית עם אסטרוציטים או נוירונים לתא זלוף PH-1 תחת אפיפלואורסצנטיות או שני מיקרוסקופ פוטון.
   2. לעורר ספיגת מיטוכונדריאלי אסטרוציטי Ca²⁺ עם 100 μM ATP ב- ACSF, או לעורר מיטוכונדריה עצבית עם 100 גלוטמט מיקרומטר / 10 μM גליצין^20,25 (איור 2 ואיור 3).
      הערה: שינויי פתרון מ- ACSF ל- ATP- ו- ACSF המכיל גלוטמט / גליצין נשלטים על ידי מערכת זלוף ALA-VM8²¹. המהירות של שינוי הפתרון נשלטת ב 1-2 מ"ל / דקה על ידי התאמת שסתום.

3. In vivo מיטוכונדריאלי Ca²⁺ הדמיה אסטרוציטים נוירונים

1. הכנות AAV.
   1. הכן את הווקטורים הבאים הקשורים לאדנו (rAAV) באמצעות פלסמידים DNA שהוכנו בסעיף 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G ו- rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
      הערה: בניסוי זה, וקטורים rAAV של סרוטיפ 5 היו מוכנים לבטא GCaMP5G במיטוכונדריה אסטרוציטים ו vectors rAAV של סרוטיפ 9 היו מוכנים לבטא GCaMP6s במיטוכונדריה בנוירונים.
2. הזרקת AAV סטריאוטקסית.
   1. תירדים את העכבר עם 3% איזופלוריין.
      הערה: מאוחר יותר במהלך הניתוח, רמות איזופלוראן מופחתות ל 2%.
   2. לאחר שהעכבר מגיע לרמה כירורגית של הרדמה, כפי שנקבע על ידי צביטת זנב ובוהן, לגלח את השיער מעל אתר הניתוח, קליפת המוח המוטורית או הסומטו-סנסורית, עם גוזם שיער.
   3. מקם את העכבר בהתקן הסטריאוטקסי של העכבר ותקן את הראש באמצעות מוטות אוזניים. החל משחה עיניים על העיניים כדי להגן עליהם במהלך הניתוח. השתמש כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר ב 37 °C (50 °F) לאורך כל הניתוח.
      הערה: בצע ניתוח באמצעות הליכים אספטיים. כל הכלים הכירורגיים צריכים להיות מעוקרים או על ידי autoclaving או מחטא חרוז חם.
   4. לאחר העכבר מותקן על המכשיר סטריאוטקסי, לחטא את הקרקפת עם לשפשף על בסיס יוד לסירוגין ו 70% אתנול שלוש פעמים. לעשות חתוך בקו האמצע של הקרקפת כדי לחשוף את אתר ההזרקה.
   5. חותכים את העור בציר ברגמה-למדה ויוצרים חור בר בקוטר ~ 1 מ"מ עם מקדחה במהירות גבוהה במיקום ההזרקה המיועד של המנוע או קליפת המוח הסומטו-סנסורית.
   6. השתמש במזרק 33 G המילטון המכיל וירוס הקשור לאדנו (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G וקטורים [1 x 10¹¹ GC] או rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 10¹¹ GC]) כדי להזריק עד 1 μL של וירוס באזור היעד.
      הערה: לדוגמה, עבור משלוח ויראלי קליפת המוח, להזריק את פתרון הווירוס בשני עומקים בשלבים מרובים. ראשית, הכנס את המחט לעומק של 1 מ"מ מהדורה ואפשר 5 דקות למוח להתאושש. לאחר מכן, להזיז את המחט עד ~ 700 עומק מיקרומטר ולהזריק 500 nL של פתרון הנגיף במהירות הזרקה של 10 nL / s באמצעות מזרק המילטון נשלט על ידי בקר משאבת מיקרו מזרק. לאחר השלמת ההזרקה, המתן 5 דקות כדי לאפשר לווירוס לפזר לתוך המוח. לאחר מכן, להזיז את המחט עד למיקום הזריקה השנייה בעומק של 300 מיקרומטר. כאן, להזריק 500 nL נוספים של פתרון הווירוס. המתן 10 דקות כדי לאפשר לווירוס לפזר לתוך המוח.
   7. סגור את הקרקפת ואת העור באמצעות דבק רקמה. תן לעכברים להתאושש על כרית החימום. שלח עכברים בחזרה למתקן החיות לאחר ההחלמה.
3. הדמיה של חלון גולגולתי והדמיה של שני פוטון (2-P) של אותות מיטוכונדריאליים Ca^2+.
   הערה: השתלת חלון הגולגולת נעשית 3 שבועות לאחר הזרקת AAV מעל המנוע או קליפת המוח הסומטוסנסורית^26,27,28,29. Carprofen (10 מ"ג/ק"ג) מוזרק תת עורית כדי לספק הקלה מכאב פוטנציאלי לפני הניתוח. הניתוחים הכירורגיים של חלון הגולגולת זהים להליכים כירורגיים בהזרקת AAV ומבוצעים בתנאים אספטיים.
   1. תירדים את העכבר עם 3% איזופלוריין.
      הערה: זוהי המינון הראשוני ולהפחית ל 2% עבור הניתוח מאוחר יותר. במהלך ההדמיה, הזרקה תוך-פריתוניאלית (IP) של 130 מ"ג קטמין/10 מ"ג קסילאצין/ק"ג משקל גוף מומס ב- ACSF משמשת להרדמה.
   2. מקם את העכבר בהתקן הסטריאוטקסי של העכבר ותקן את הראש באמצעות מוטות אוזניים. יש למרוח משחה עיניים על העיניים. השתמש כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר ב 37 °C (50 °F) לאורך כל הניתוח.
      הערה: כל הכלים הכירורגיים צריכים להיות מעוקרים.
   3. לעשות חתוך של 5-8 מ"מ אורך בקו האמצע של הקרקפת ולהסיר דש של העור באמצעות זוג מספריים.
   4. לאחר חשיפת הגולגולת, בצעו גולגולת בקוטר 2.0-3.0 מ"מ באמצעות מקדחה במהירות גבוהה מעל האזור המוזרק לווירוס (כלומר, קליפת המוח המוטורית או קליפת המוח הסומטו-סנסורית, איור 1B). ראשית, לעשות ארבעה חורים קטנים, ולאחר מכן לקדוח יחד במעגל המחבר את החורים. לאחר מכן, להרים ולהסיר את העצם עם מספריים חדים ולהסיר. ניתן להסיר או לשמור את דורה מאטר חשוף ללא פגע לתשין החלון הגולגולתי.
   5. מניחים כיסוי זכוכית בקוטר 3-5 מ"מ הנושא סיליקון שקוף מעל הגולגולת. השתמש בקיסם כדי לדחוף את חלון הגולגולת בעדינות על פני השטח של המוח. לאחר מכן, לאטום את הקצה עם כמות קטנה של דבק סיליקון.
      הערות: לחלופין, במקום דיסק סיליקון, 1.2% נקודת התכה נמוכה אגרוז ג'ל יכול לשמש בין זכוכית הכיסוי לבין רקמת המוח.
   6. לבסוף, לאטום את הקצוות של כיסוי עם מלט דנטלי. יש להצטמר להחיל מעט את הבטון בקצה חלון הגולגולת לצורך מליטה חזקה. חבר צלחת ראש מתכת בהתאמה אישית לגולגולת עם מלט דנטלי.
      הערה: לוח המתכת משמש לתיקון ראש העכבר לשלב של מיקרוסקופ 2-P במהלך מפגש ההדמיה (איור 1C).
   7. הוסף 0.5 מ"ל של פתרון ACSF מעל כיסוי על חלון הגולגולת לטבילת מים במהלך הדמיה.
   8. בצע זמן לשגות ב vivo 2-P הדמיה של מיטו-GCaMP5G אסטרוציטים ו mito-GCaMP6s בתאי עצב עם אורך גל 910 ננומטר דרך החלון הגולגולתי (איור 1C)^18,20,27.
      הערה: במהלך ההדמיה, עכברים נמצאים על כרית החימום כדי לשמור על הטמפרטורה הפיזיולוגית. העכברים יוקרבו מיד לאחר סיום פגישת ההדמיה.
   9. תווית אסטרוציטים ב vivo עם גופריתודמין 101 (SR101) כאשר יש צורך לקבוע colocalization.
      1. בסוף שלב 3.3.4, להחיל 100 μL של 100 μM SR101 ב ACSF על פני קליפת המוח במשך 1-5 דקות.
      2. יש לשטוף את המשטח עם ACSF כדי לשטוף את ה-SR101 הלא מאוגד. באמצעות הדמיה 2-P, תיוג משותף של מיטו-GCaMP5G ו- SR101 באסטרוציטים ניתן לראות 45-60 דקות מאוחר יותר(איור 4A).

תוצאות

מטרת מחקר זה הייתה לספק מתודולוגיה לדמות אותות מיטוכונדריאליים Ca^{2 +} באמצעות GECIs באסטרוציטים ונוירונים במבחנה וב- in vivo. תוצאות של הדמיה במבחנה ו in vivo mitochondrial Ca²⁺ מוצגים כאן.

אין ויטרו מיטוכונדריאלי Ca²⁺ א...

Discussion

במאמר זה, אנו מספקים שיטה ופרוטוקול להדמיה של אותות מיטוכונדריאליים Ca²⁺ באסטרוציטים ונוירונים. יישמנו אסטרטגיות מיטוכונדריה-פילוח וסוג תאים כדי לבטא GECI GCaMP5G/6s. כדי למקד GCaMP5G/6s במיטוכונדריה, כללנו רצף מיטוכונדריה מיקוד ב plasmids. כדי לבטא GCaMP5G/6s אסטרוציטים נוירונים ב vivo, הכנסנו מקדם ס...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight