Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme

Özet

Bu proktokol, astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo mitokondriyal Ca²⁺ görüntüleme için bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

Özet

Mitokondriyal Ca^2+, sitozolitik Ca²⁺ arabelleğe alma, enerji metabolizması ve hücresel sinyal transdüksiyonunu kontrol etmede kritik bir rol oynar. Mitokondriyal Ca^2+'nın aşırı yüklenmesi, nörolojik hastalıklarda nörodejenerasyon ve apoptotik hücre ölümü de dahil olmak üzere çeşitli patolojik durumlara katkıda bulunur. Burada astrositlerde ve nöronlarda mitokondriyal Ca²⁺ görüntüleme için moleküler yaklaşımı hedefleyen hücre tipi spesifik ve mitokondriler in vitro ve in vivo sunuyoruz. Genetik olarak kodlanmış Ca²⁺ göstergelerini (GECI'ler) GCaMP5G veya GCaMP6'ları (GCaMP5G/6s) astrosit ve nörona özgü promotörler gfaABC1D ve CaMKII ve mitokondri hedefleme dizisi (mito-) ile kodlayan DNA plazmidleri inşa ettik. İn vitro mitokondriyal Ca²⁺ görüntüleme için plazmidler GCaMP5G/6'ları ifade etmek için kültürlü astrositlerde ve nöronlarda transkripsiyon edildi. In vivo mitokondriyal Ca²⁺ görüntüleme için adeno ilişkili viral vektörler (AAV' ler) hazırlandı ve astrositlerde ve nöronlarda mitokondrilerde GCaMP5G/6'ları ifade etmek için fare beyinlerine enjekte edildi. Yaklaşımımız, astrosit ve nöronlardaki mitokondriyal Ca²⁺ dinamiklerini, sitosolik ve mitokondriyal Ca²⁺ sinyallerinin yanı sıra astrosit-nöron etkileşimleri arasındaki ilişkiyi incelemek için yararlı bir araç sağlar.

Giriş

Mitokondriler dinamik hücre altı organellerdir ve enerji üretimi için hücre güç merkezleri olarak kabul edilir. Öte yandan, mitokondriler lokal veya sitozolitik Ca²⁺ yükselmelerine yanıt olarak Ca^2+'yı matrise alabilir. Mitokondriyal Ca²⁺ alımı, trikarboksilik asit (TCA) döngüsündeki reaksiyonlar ve oksidatif fosforilasyon gibi metabolik süreçler de dahil olmak üzere mitokondriyal fonksiyonu etkiler ve fizyolojik koşullar altında Ca²⁺duyarlı proteinleri düzenler 1^,2,3,4. Mitokondriyal Ca²⁺

Protokol

Hayvanları içeren prosedürler Missouri-Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. DNA plazmidlerinin yapımı

NOT: İn vitro ve in vivo görüntüleme için, Astrosit ve nörona özgü promotörler ve mitokondriyal hedefleme dizileri ile GCaMP5G/6'ları kodlayan DNA plazmidleri oluşturulur.

1. Mitokondriyal matris (MM)- hedefleme sırası (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGGGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG^17'yi klona ekleyin adeno ilişkili virüs (AAV) plazmid pZac2.1....

Sonuçlar

Bu çalışmanın amacı astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivoolarak GECI'ler kullanarak mitokondriyal Ca²⁺ sinyallerinin görüntülenerek bir metodoloji sağlamaktı. Hem in vitro hem de in vivo mitokondriyal Ca²⁺ görüntüleme sonuçları burada sunulmuştur.

Kültürlü astrositlerde ve nöronlarda in vitro mitokondriyal Ca²⁺ sinyali.......

Tartışmalar

Bu yazıda astrosit ve nöronlarda mitokondriyal Ca²⁺ sinyallerinin görüntülenmesi için bir yöntem ve protokol sunuyoruz. GECI GCaMP5G/6'ları ifade etmek için mitokondri hedefleme ve hücre tipine özgü stratejiler uyguladık. Mitokondrilerde GCaMP5G/6'ları hedeflemek için plazmidlere mitokondri hedefleme dizisi dahil ettik. GCaMP5G/6'ları astrositlerde ve nöronlarda ifadeetmek için in vivo , plazmidlere astrositlere özgü bir promotör gfaABC1D ve nörona özgü promotör CaMKII yerleş.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight