Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Zusammenfassung

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca²⁺ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Zusammenfassung

Mitochondriales^Ca2+ spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der zytosolischen^{Ca2+-Pufferung,} des Energiestoffwechsels und der zellulären Signaltransduktion. Die Überlastung des mitochondrialen Ca²⁺ trägt zu verschiedenen pathologischen Zuständen bei, einschließlich Neurodegeneration und apoptotischem Zelltod bei neurologischen Erkrankungen. Hier stellen wir einen zelltypspezifischen und auf Mitochondrien abzielenden molekularen Ansatz für die mitochondriale Ca²⁺ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivovor. Wir konstruierten DNA-Plasmide, die für Mitochondrien kodieren, die auf genetisch kodierte Ca²⁺ Indikatoren (GECIs) GCaMP5G oder GCaMP6s (GCaMP5G/6s) mit astrozyten- und neuronenspezifischen Promotoren gfaABC1D und CaMKII und mitochondrien-Targeting-Sequenz (mito-) abzielen. Für die in vitro mitochondriale Ca²⁺ Bildgebung wurden die Plasmide in kultivierten Astrozyten und Neuronen transfiziert, um GCaMP5G/6s zu exprimieren. Für die in vivo mitochondriale Ca²⁺ Bildgebung wurden adeno-assoziierte virale Vektoren (AAVs) hergestellt und in das Gehirn der Maus injiziert, um GCaMP5G/6s in Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen zu exprimieren. Unser Ansatz bietet ein nützliches Mittel, um die mitochondriale^Ca2+-Dynamik in Astrozyten und Neuronen abzubilden, um die Beziehung zwischen zytosolischer und mitochondrialer^{Ca2+-Signalgebung} sowie Astrozyten-Neuronen-Interaktionen zu untersuchen.

Einleitung

Mitochondrien sind dynamische subzelluläre Organellen und gelten als Zellkraftwerke für die Energieproduktion. Auf der anderen Seite können Mitochondrien^Ca2+ in die Matrix aufnehmen, als Reaktion auf lokale oder zytosolische^Ca2+ Anstiege. Die mitochondriale^{Ca2+-Aufnahme} beeinflusst die mitochondriale Funktion, einschließlich Stoffwechselprozesse wie Reaktionen im Tricarbonsäurezyklus (TCA) und oxidative Phosphorylierung, und reguliert^{Ca2+-empfindliche}Proteine unter physiologischen^{Bedingungen 1,2,3,4}

Protokoll

Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Missouri-Columbia genehmigt.

1. Aufbau von DNA-Plasmiden

HINWEIS: Für die In-vitro- und In-vivo-Bildgebung werden DNA-Plasmide konstruiert, die für GCaMP5G/6s mit Astrozyten- und Neuronen-spezifischen Promotoren und mitochondrialen Targeting-Sequenzen kodieren.

1. Einfügen der mitochondrialen Matrix (MM)-Targeting-Sequenz (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG¹⁷ in die Klonierungs....

Ergebnisse

Ziel dieser Studie war es, eine Methodik zur Abbildung mitochondrialer Ca^2+-Signale unter Verwendung von GECIs in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivo bereitzustellen. Ergebnisse der in vitro und in vivo mitochondrialen Ca²⁺ Bildgebung werden hier vorgestellt.

In vitro mitochondriale Ca²⁺ Signalisierung in kultivierten Astrozyten und Neuronen

Diskussion

In diesem Artikel stellen wir eine Methode und ein Protokoll zur Abbildung mitochondrialer Ca^2+-Signale in Astrozyten und Neuronen zur Verfügung. Wir implementierten Mitochondria-Targeting- und zelltypspezifische Strategien, um GECI GCaMP5G/6s zu exprimieren. Um GCaMP5G/6s in Mitochondrien anzugreifen, haben wir eine Mitochondrien-Targeting-Sequenz in die Plasmide aufgenommen. Um GCaMP5G/6s in Astrozyten und Neuronen in vivo zu exprimieren,haben wir einen Astrozyten-spezifischen Promotor gfaABC1D und.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight