Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Zusammenfassung

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca²⁺ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Zusammenfassung

Mitochondriales^Ca2+ spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der zytosolischen^{Ca2+-Pufferung,} des Energiestoffwechsels und der zellulären Signaltransduktion. Die Überlastung des mitochondrialen Ca²⁺ trägt zu verschiedenen pathologischen Zuständen bei, einschließlich Neurodegeneration und apoptotischem Zelltod bei neurologischen Erkrankungen. Hier stellen wir einen zelltypspezifischen und auf Mitochondrien abzielenden molekularen Ansatz für die mitochondriale Ca²⁺ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivovor. Wir konstruierten DNA-Plasmide, die für Mitochondrien kodieren, die auf genetisch kodierte Ca²⁺ Indikatoren (GECIs) GCaMP5G oder GCaMP6s (GCaMP5G/6s) mit astrozyten- und neuronenspezifischen Promotoren gfaABC1D und CaMKII und mitochondrien-Targeting-Sequenz (mito-) abzielen. Für die in vitro mitochondriale Ca²⁺ Bildgebung wurden die Plasmide in kultivierten Astrozyten und Neuronen transfiziert, um GCaMP5G/6s zu exprimieren. Für die in vivo mitochondriale Ca²⁺ Bildgebung wurden adeno-assoziierte virale Vektoren (AAVs) hergestellt und in das Gehirn der Maus injiziert, um GCaMP5G/6s in Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen zu exprimieren. Unser Ansatz bietet ein nützliches Mittel, um die mitochondriale^Ca2+-Dynamik in Astrozyten und Neuronen abzubilden, um die Beziehung zwischen zytosolischer und mitochondrialer^{Ca2+-Signalgebung} sowie Astrozyten-Neuronen-Interaktionen zu untersuchen.

Einleitung

Mitochondrien sind dynamische subzelluläre Organellen und gelten als Zellkraftwerke für die Energieproduktion. Auf der anderen Seite können Mitochondrien^Ca2+ in die Matrix aufnehmen, als Reaktion auf lokale oder zytosolische^Ca2+ Anstiege. Die mitochondriale^{Ca2+-Aufnahme} beeinflusst die mitochondriale Funktion, einschließlich Stoffwechselprozesse wie Reaktionen im Tricarbonsäurezyklus (TCA) und oxidative Phosphorylierung, und reguliert^{Ca2+-empfindliche}Proteine unter physiologischen^{Bedingungen 1,2,3,4}. Mitochondriale Ca^{2+ Überlastung} ist auch eine Determinante für den Zelltod, einschließlich Nekrose und Apoptose bei verschiedenen Hirnerkrankungen^5,6,7. Es verursacht die Öffnung von mitochondrialen Permeabilitätsübergangsporen (mPTPs) und die Freisetzung von Caspase-Cofaktor, die den apoptotischen Zelltod einleiten. Daher ist es wichtig, die mitochondriale^Ca2+-Dynamik und -Handhabung in lebenden Zellen zu untersuchen, um die zelluläre Physiologie und Pathologie besser zu verstehen.

Mitochondrien erhalten die Matrix^Ca2+ Homöostase durch ein Gleichgewicht zwischen Ca²⁺ Aufnahme und Efflux. Die mitochondriale^{Ca2+-Aufnahme} wird hauptsächlich durch mitochondriale^{Ca2+-Uniporter} (MCUs) vermittelt, während der mitochondriale^Ca2+-Efflux durch die Na+-Ca2+-Li+-Austauscher (NCLXs) und die^{H+/Ca2+-Austauscher}(mHCXs)⁸vermittelt wird. Das Gleichgewicht kann durch die Stimulation von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gestört werden⁹. Mitochondriale^Ca2+ Homöostase wird auch durch mitochondriale Pufferung durch die Bildung von unlöslichen^xCa2+-xPO₄x-xOH-Komplexen^{beeinflusst 8}.

Intrazelluläre und mitochondriale Veränderungen der^{Ca2+-Konzentration ([Ca2+])}können durch fluoreszierende oder lumineszierende^{Ca2+-Indikatoren} bewertet werden. Die Bindung von Ca²⁺ an Indikatoren verursacht spektrale Modifikationen, die es ermöglichen, freie zelluläre [Ca²⁺] in Echtzeit in lebenden Zellen aufzuzeichnen. Derzeit stehen zwei Arten von Sonden zur Verfügung, um Ca^{2+-Veränderungen} in Zellen zu überwachen: organisch-chemische Indikatoren und genetisch kodierte^{Ca2+-Indikatoren} (GECIs). Im Allgemeinen stehen für die untersuchten biologischen Fragestellungen unterschiedliche Varianten mit unterschiedlichen^{Ca2+-Affinitäten} (basierend auf K_d),spektralen Eigenschaften (Anregungs- und Emissionswellenlängen), Dynamikbereichen und Sensitivitäten zur Verfügung. Obwohl viele synthetische organische Ca^{2+-Indikatoren} für die zytosolische^{Ca2+-Bildgebung} verwendet wurden, können nur wenige selektiv in die mitochondriale Matrix für die mitochondriale^{Ca2+-Bildgebung} geladen werden, wobei Rhod-2 am weitesten verbreitet ist (für Reviews siehe^10,11). Rhod-2 hat jedoch einen großen Nachteil der Leckage bei langen Zeitverlaufsexperimenten; Darüber hinaus ist es zwischen Mitochondrien, anderen Organellen und dem Zytosol aufgeteilt, was absolute Messungen in verschiedenen Unterkompartimenten erschwert. Im Gegensatz dazu können GECIs durch die Verwendung von zelltypspezifischen Promotoren und subzellulären Kompartiment-Targeting-Sequenzen in verschiedenen Zelltypen und subzellulären Kompartimenten für die zell- und kompartimentspezifische^{Ca2+-Bildgebung} in vitro oder in vivoexprimiert werden. Einwellenlängen-Fluoreszenzintensitäts-basierte GCaMP Ca²⁺ Indikatoren haben sich kürzlich als Haupt-GECIs^{12,13,14,15,16}herausgestellt. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für das Mitochondria-Targeting und die zelltypspezifische Expression von GCaMP5G und GCaMP6s (GCaMP5G/6s) in Astrozyten und Neuronen sowie die Abbildung der mitochondrialen Ca^2+-Aufnahme in diesen Zelltypen zur Verfügung. Mit diesem Protokoll kann die Expression von GCaMP6G/6s in einzelnen Mitochondrien aufgedeckt werden, und ca²⁺ Aufnahme in einzelner mitochondrialer Auflösung kann in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivoerreicht werden.

Protokoll

Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Missouri-Columbia genehmigt.

1. Aufbau von DNA-Plasmiden

HINWEIS: Für die In-vitro- und In-vivo-Bildgebung werden DNA-Plasmide konstruiert, die für GCaMP5G/6s mit Astrozyten- und Neuronen-spezifischen Promotoren und mitochondrialen Targeting-Sequenzen kodieren.

1. Einfügen der mitochondrialen Matrix (MM)-Targeting-Sequenz (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG¹⁷ in die Klonierungsstellen EcoRI und BamHI im Rückgrat des Adeno-assoziierten Virus (AAV) Plasmids pZac2.1, um Plasmide zu erhalten, die astrozytäre gfaABC₁D Promotor oder neuronalen CaMKII Promotor^18,19,20enthalten.
2. Subklone GCaMP5G/6s in die Klonierungsstellen BamH I und Not 1 in den oben genannten Plasmiden, um neue Plasmide zu erhalten pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s und pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s, die auf die Transgenexpression in Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen abzielen^20,21 (Abbildung 1A).
3. pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G und pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA-Plasmide für die Transfektion für in vitro Studien vorbereiten (Abschnitt 2). Herstellung von AAV-Vektoren mit Serotyp 5 für Astrozyten und Serotyp 9 für Neuronen für die In-vivo-Studie ¹⁸ (Abschnitt 3).

2. In vitro mitochondriale Ca²⁺ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen

1. Präpariere primäre Astrozyten aus dem Kortex von P1-Neugeborenenmäusen und primären Neuronen aus dem Kortex der E15-16-Embryonen^18,22,23,24und kulturiere sie auf Glasdecklippen mit einem Durchmesser von 12 mm in 24-Well-Platten unter Verwendung von Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% fetales Rinderserum (FBS) und neuronales Basalmedium (NBM) mit 2% B27 enthält. beziehungsweise.
2. Transfizieren Sie reife Astrozyten und Neuronen mit pZac-gfaABC1D-GCaMP6s und pZac-CaMKII-GCaMP5G-Plasmiden unter Verwendung von lipidbasiertem Transfektionsreagenz, um GCaMP6s in den Mitochondrien von Astrozyten und GCaMP5G in den Mitochondrien von Neuronen zu exprimieren^18,20,21. Transfizieren Sie Zellen in jeder Vertiefung mit 0,5 μg DNA und wechseln Sie das Medium 6 h später.
   HINWEIS: Die Astrozyten und Neuronen sind 1-2 Tage nach der Transfektion bereit für die Bildgebung.
3. Führen Sie in vitro mitochondriale Ca²⁺ Bildgebung 1-2 Tage nach der Transfektion durch.
   1. Übertragen Sie die mit Astrozyten oder Neuronen kultivierten Glasdeckgläser unter einem Epifluoreszenz- oder Zwei-Photonen-Mikroskop in die PH-1-Perfusionskammer.
   2. Stimulieren Sie die astrozytäre mitochondriale Ca²⁺ Aufnahme mit 100 μM ATP in ACSF oder stimulieren Sie neuronale Mitochondrien mit 100 μM Glutamat / 10 μM Glycin^20,25 (Abbildung 2 und Abbildung 3).
      HINWEIS: Lösungswechsel von ACSF zu ATP- und Glutamat/Glycin-haltigem ACSF werden durch ein ALA-VM8-Perfusionssystem²¹gesteuert. Die Geschwindigkeit des Lösungswechsels wird durch Einstellen eines Ventils mit 1-2 ml/min gesteuert.

3. In vivo mitochondriale Ca²⁺ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen

1. AAV-Vorbereitungen.
   1. Herstellung der folgenden rekombinanten Adeno-assoziierten Virusvektoren (rAAV) unter Verwendung der in Abschnitt 1 hergestellten DNA-Plasmide: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G und rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s-Vektoren.
      HINWEIS: In diesem Experiment wurden rAAV-Vektoren des Serotyps 5 hergestellt, um GCaMP5G in Mitochondrien in Astrozyten zu exprimieren, und rAAV-Vektoren des Serotyps 9 wurden hergestellt, um GCaMP6s in Mitochondrien in Neuronen zu exprimieren.
2. Stereotaxische AAV-Injektion.
   1. Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran.
      HINWEIS: Später während der Operation werden die Isofluranspiegel auf 2% reduziert.
   2. Nachdem die Maus ein chirurgisches Anästhesieniveau erreicht hat, das durch Schwanz- und Zehendrücken bestimmt wird, rasieren Sie die Haare mit einem Haarschneider über die Operationsstelle, den motorischen oder somatosensorischen Kortex.
   3. Positionieren Sie die Maus auf dem stereotaktischen Mausgerät und fixieren Sie den Kopf mit Ohrbügeln. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um sie während der Operation zu schützen. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Körpertemperatur der Maus während der gesamten Operation bei 37 ° C zu halten.
      HINWEIS: Führen Sie eine Operation mit aseptischen Verfahren durch. Alle chirurgischen Werkzeuge müssen entweder durch Autoklavieren oder einen Heißperlensterilisator sterilisiert werden.
   4. Nachdem die Maus auf dem stereotaktischen Gerät montiert ist, sterilisieren Sie die Kopfhaut dreimal mit abwechselnd jodbasiertem Peeling und 70% Ethanol. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut, um die Injektionsstelle freizulegen.
   5. Schneiden Sie die Haut in der Bregma-Lamda-Achse auf und erstellen Sie mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer ein ~ 1 mm Durchmessergratloch an der vorgesehenen Injektionsstelle des motorischen oder somatosensorischen Kortex.
   6. Verwenden Sie eine 33 G Hamilton-Spritze mit Adeno-assoziiertem Virus (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G-Vektoren [1 x 10¹¹ GC] oder rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s-Vektoren [1 x 10¹¹ GC]), um bis zu 1 μL Virus im Zielbereich zu injizieren.
      HINWEIS: Für die kortikale Virusabgabe injizieren Sie beispielsweise die Viruslösung in zwei Tiefen in mehreren Schritten. Führen Sie zuerst die Nadel bis zu einer Tiefe von 1 mm von der Dura ein und lassen Sie 5 Minuten für das Gehirn warten, um sich zu erholen. Bewegen Sie dann die Nadel bis zu ~ 700 μm Tiefe und injizieren Sie 500 nL der Viruslösung mit einer Injektionsgeschwindigkeit von 10 nL / s mit einer Hamilton-Spritze, die von einem Mikrospritzenpumpenregler gesteuert wird. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, warten Sie 5 Minuten, damit das Virus in das Gehirn diffundieren kann. Bewegen Sie dann die Nadel bis zur zweiten Injektionsstelle in einer Tiefe von 300 μm. Hier werden zusätzlich 500 nL der Viruslösung injiziert. Warten Sie 10 Minuten, damit das Virus in das Gehirn diffundieren kann.
   7. Schließen Sie die Kopfhaut und die Haut mit einem Gewebekleber. Lassen Sie die Mäuse sich auf dem Heizkissen erholen. Schicken Sie Mäuse nach der Genesung zurück in die Tiereinrichtung.
3. Kraniale Fensterintstallation und in vivo Zwei-Photonen (2-P) Bildgebung von mitochondrialen Ca²⁺ Signalen.
   HINWEIS: Die Kranialfensterimplantation erfolgt 3 Wochen nach der AAV-Injektion über den motorischen oder somatosensorischen Kortex^26,27,28,29. Carprofen (10 mg/kg) wird subkutan injiziert, um mögliche Schmerzen vor der Operation zu lindern. Die kranialen Fensterchirurgieverfahren sind identisch mit den chirurgischen Eingriffen der AAV-Injektion und werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
   1. Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran.
      HINWEIS: Dies ist die Anfangsdosis und reduzieren Sie sie auf 2% für die spätere Operation. Während der Bildgebung wird eine intraperitoneale (IP) Injektion von 130 mg Ketamin /10 mg Xylazin/kg Körpergewicht, gelöst in ACSF, zur Anästhesie verwendet.
   2. Positionieren Sie die Maus auf dem stereotaktischen Mausgerät und fixieren Sie den Kopf mit Ohrbügeln. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Körpertemperatur der Maus während der gesamten Operation bei 37 ° C zu halten.
      HINWEIS: Alle chirurgischen Werkzeuge müssen sterilisiert werden.
   3. Machen Sie einen Schnitt von 5-8 mm Länge in der Mittellinie der Kopfhaut und entfernen Sie einen Hautlappen mit einer Schere.
   4. Nachdem der Schädel freigelegt wurde, führen Sie eine Kraniotomie mit einem Durchmesser von 2,0-3,0 mm mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer über dem vom Virus injizierten Bereich (d. h. motorischer Kortex oder somatosensorischer Kortex, Abbildung 1B) durch. Machen Sie zuerst vier kleine Löcher und bohren Sie dann in einem Kreis entlang, der die Löcher verbindet. Heben und entfernen Sie dann den Knochen mit einer scharfen Schere und entfernen Sie ihn. Die freiliegende Dura mater kann entfernt oder intakt gehalten werden, um das Schädelfenster zu bewirken.
   5. Legen Sie einen Glasdecker von 3-5 mm Durchmesser mit einem transparenten Silikon über die Kraniotomie. Verwenden Sie einen Zahnstocher, um das Schädelfenster sanft auf die Oberfläche des Gehirns zu drücken. Versiegeln Sie dann die Kante mit einer kleinen Menge Silikonkleber.
      HINWEISE: Alternativ kann anstelle einer Silikonscheibe ein 1,2% iges Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt zwischen dem Deckglas und dem Hirngewebe verwendet werden.
   6. Zum Schluss versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Zahnzement. Achten Sie darauf, den Zement leicht am Rand des Schädelfensters aufzutragen, um eine starke Verklebung zu gewährleisten. Befestigen Sie eine maßgefertigte Kopfplatte aus Metall mit Zahnzement am Schädel.
      HINWEIS: Die Metallplatte wird verwendet, um den Kopf der Maus während der Bildgebungssitzung auf der Stufe des 2-P-Mikroskops zu fixieren (Abbildung 1C).
   7. Fügen Sie 0,5 ml ACSF-Lösung über den Deckglas am Schädelfenster hinzu, um während der Bildgebung in Wasser einzutauchen.
   8. Durchführung einer Zeitraffer-in-vivo-2-P-Bildgebung von Mito-GCaMP5G in Astrozyten und Mito-GCaMP6s in Neuronen mit 910 nm Wellenlänge durch das Schädelfenster (Abbildung 1C)^18,20,27.
      HINWEIS: Während der Bildgebung befinden sich Mäuse auf dem Heizkissen, um die physiologische Temperatur aufrechtzuerhalten. Die Mäuse werden unmittelbar nach Abschluss der Bildgebungssitzung geopfert.
   9. Markieren Sie Astrozyten in vivo mit Sulforhodamin 101 (SR101), wenn es notwendig ist, die Kolokalisation zu bestimmen.
      1. Am Ende von Schritt 3.3.4 tragen Sie 100 μL 100 μM SR101 in ACSF für 1-5 min auf die kortikale Oberfläche auf.
      2. Spülen Sie die Oberfläche mit ACSF ab, um den ungebundenen SR101 wegzuspülen. Mittels 2-P-Bildgebung kann die Co-Markierung von Mito-GCaMP5G und SR101 in Astrozyten 45-60 min später beobachtet werden (Abbildung 4A).

Ergebnisse

Ziel dieser Studie war es, eine Methodik zur Abbildung mitochondrialer Ca^2+-Signale unter Verwendung von GECIs in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivo bereitzustellen. Ergebnisse der in vitro und in vivo mitochondrialen Ca²⁺ Bildgebung werden hier vorgestellt.

In vitro mitochondriale Ca²⁺ Signalisierung in kultivierten Astrozyten und Neuronen

Diskussion

In diesem Artikel stellen wir eine Methode und ein Protokoll zur Abbildung mitochondrialer Ca^2+-Signale in Astrozyten und Neuronen zur Verfügung. Wir implementierten Mitochondria-Targeting- und zelltypspezifische Strategien, um GECI GCaMP5G/6s zu exprimieren. Um GCaMP5G/6s in Mitochondrien anzugreifen, haben wir eine Mitochondrien-Targeting-Sequenz in die Plasmide aufgenommen. Um GCaMP5G/6s in Astrozyten und Neuronen in vivo zu exprimieren,haben wir einen Astrozyten-spezifischen Promotor gfaABC1D und...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight