一种持续分离小鼠心肌细胞的简单有效的方法

摘要

心脏病学细胞和分子功能实验的金标准是心肌细胞。本文介绍了对非朗根道夫技术分离小鼠心肌细胞的适应性。

摘要

对产生高质量心肌细胞的可重复但技术上简单的方法的需求对于心脏生物学研究至关重要。心肌细胞的细胞和分子功能实验（例如收缩、电生理学、钙循环等）是建立疾病机制的金标准。小鼠是功能实验的首选物种，所描述的技术专门用于分离小鼠心肌细胞。以前需要朗根道夫器械的方法需要高水平的训练和主动脉插管的精度，通常会导致缺血。该领域正在转向无Langendorff的分离方法，这些方法简单，可重复，并产生用于生理数据采集和培养的活肌细胞。与主动脉插管相比，这些方法大大减少了缺血时间，并导致可靠地获得心肌细胞。我们对无Langendorff方法的适应包括使用冰冷的清除溶液进行初始灌注，使用稳定平台以确保灌注过程中针头稳定，以及额外的消化步骤，以确保可靠地获得用于功能测量和培养的心肌细胞。这种方法简单快捷，几乎不需要技术技能。

引言

几十年来，心脏生物学文献中的一个重要思想是分子作用机制。必须建立作用机制才能发表可靠的研究。确定分子机制的成熟策略是分离的心肌细胞研究，这需要高质量的心肌细胞才能获得可靠的数据。对心肌细胞进行的细胞和分子实验以确定作用机制是研究收缩¹、电生理学²、钙 （Ca 2+） 循环³、肌纤维^{Ca 2+} 敏感性⁴、细胞骨架⁵、代谢⁶、激素的影响⁷、信号分子⁸、药物研究⁹ 的金标准等。小鼠因其易于基因操作、体积小、寿命相对较短、成本低等优点，成为大多数心脏生物学实验的首选物种¹⁰。然而，高质量小鼠心肌细胞的可靠分离在目前的技术中并非易事。

实验室分离心肌细胞已有近70年的历史¹¹。几乎所有分离心肌细胞的技术都依赖于通过各种酶（胶原酶、蛋白酶、胰蛋白酶等）对心脏的消化。在早期（1950 年代至 1960 年代），....

研究方案

本研究中执行的所有程序均由俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会根据NIH指南批准。

1. 溶液制备

注意：缓冲液浓度请参见 表2 。

1. 预隔离（最多在肌细胞分离前 2 周）
   1. 灌注缓冲液基质：在 1 L 超纯 18.2 MΩ·cm H 2 O 中制备 1L 灌注缓冲液碱（NaCl、KCl、NaH₂PO 4、HEPES、葡萄糖和 BDM），在 0.22 μm 无菌过滤之前调节至 pH_7.4。储存在4°C直至隔离日。
   2. 清除缓冲液：在 1 L 超纯 18.2 MΩ·cm H 2 O 中制备 1L 清除缓冲液（NaCl、KCl、NaH₂PO 4、HEPES、葡萄糖、EDTA 和 BDM），在 0.22 μm 无菌过滤之前调节至 pH_7.4。储存在4°C直至隔离日。
   3. 100 mM CaCl 2储备溶液：称取1.11 g CaCl 2，溶解到100 mL超纯18.2 MΩ·cm H₂ O中，室温储存至分离之日。
   4. 自由酶等分试样：将 5 毫克消化酶溶解在 5 毫升无菌、无 RN....

结果

在确定隔离是否成功时，有几个要素需要检查。首先，心肌细胞必须是杆状的，没有膜泡，例如 图1中分离的细胞。典型的分离将产生~80%的肌细胞呈杆状。如果分离产生的杆状细胞低于50%，则认为分离不成功，不使用心肌细胞。最后，心肌细胞应该是静止的。自发收缩的肌细胞表现出 Ca2+ 不耐受，并且会产生不可靠的数据。在使用上述技术进行的所有分离中，几乎所有分离?.......

讨论

我们的无朗根多夫心肌细胞分离技术的主要优点是，它不需要插管朗根道夫器械，从而限制缺氧和缺血时间。与经典的朗根道夫技术不同，通常需要几分钟才能去除，清洁和悬挂心脏，通常会导致心肌细胞缺血性损伤，我们的方法包括通过冰冷的清除溶液进行体内血液清除。冰冷的清除缓冲液含有乙二胺四乙酸（EDTA），不可逆地螯合二价阳离子以有效去除钙，使其成为极好的抗凝剂.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815