Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón

Resumen

El estándar de oro en cardiología para experimentos funcionales celulares y moleculares son los cardiomiocitos. Este artículo describe adaptaciones a la técnica no Langendorff para aislar cardiomiocitos de ratón.

Resumen

La necesidad de métodos reproducibles pero técnicamente simples que produzcan cardiomiocitos de alta calidad es esencial para la investigación en biología cardíaca. Los experimentos funcionales celulares y moleculares (por ejemplo, contracción, electrofisiología, ciclo de calcio, etc.) en cardiomiocitos son el estándar de oro para establecer los mecanismos de la enfermedad. El ratón es la especie de elección para experimentos funcionales y la técnica descrita es específicamente para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón. Los métodos anteriores que requerían un aparato de Langendorff requieren altos niveles de entrenamiento y precisión para la canulación aórtica, lo que a menudo resulta en isquemia. El campo se está desplazando hacia métodos de aislamiento sin Langendorff que son simples, son reproducibles y producen miocitos viables para la adquisición de datos fisiológicos y el cultivo. Estos métodos disminuyen en gran medida el tiempo de isquemia en comparación con la canulación aórtica y dan como resultado cardiomiocitos obtenidos de manera confiable. Nuestra adaptación al método sin Langendorff incluye una perfusión inicial con solución de limpieza helada, el uso de una plataforma estabilizadora que garantiza una aguja estable durante la perfusión y pasos de digestión adicionales para garantizar la obtención confiable de cardiomiocitos para su uso en mediciones funcionales y cultivo. Este método es simple y rápido de realizar y requiere poca habilidad técnica.

Introducción

Durante décadas, una idea esencial en la literatura de biología cardíaca es el mecanismo de acción molecular. El mecanismo de acción debe establecerse para publicar estudios confiables. Una estrategia bien establecida para determinar el mecanismo molecular son los estudios aislados de cardiomiocitos, que requieren cardiomiocitos de alta calidad para obtener datos confiables. Los experimentos celulares y moleculares realizados en cardiomiocitos para determinar el mecanismo de acción son el estándar de oro para investigar la contracción¹, electrofisiología², calcio (^Ca 2+) ciclo³, miofilamento Ca²⁺ sensibilidad⁴, citoesqueleto⁵, metabolismo⁶, efectos de las hormonas⁷, moléculas de señalización⁸, estudios farmacológicos⁹ etc. El ratón se ha convertido en la especie de elección para la mayoría de los experimentos de biología cardíaca debido a la facilidad de manipulación genética, su pequeño tamaño, su vida útil relativamente corta, bajo costo, etc.¹⁰. Sin embargo, el aislamiento confiable de cardiomiocitos de ratón de alta calidad no es trivial con las técnicas actuales.

Los laboratorios han estado aislando cardiomiocitos durante casi 70 años¹¹. Prácticamente todas las técnicas para aislar cardiomiocitos se basan en la digestión del corazón a través de varias enzimas (colagenasa, proteasa, tripsina, etc.). En los primeros períodos (1950-1960), se empleó el método de trozos, que consistía en extraer el corazón, cortar en trozos mucho más pequeños e incubar en solución con colagenasa / proteasa / tripsina¹². En la década de 1970, los laboratorios implementaron el método mejorado "Langendorff"¹³, que aisló cardiomiocitos utilizando una técnica de aislamiento basada en la perfusión de la arteria coronaria (perfusión retrógrada con enzima a través del aparato de Langendorff); Esta técnica sigue siendo el método dominante de aislamiento de miocitos en el campo hoy en día, ~ 50 años después^14,15,16. El trabajo reciente se ha desplazado a la canulación del corazón in vivo para limitar el tiempo de hipoxia y el daño isquémico, lo que resulta en aislamientos de cardiomiocitos superiores (mejores rendimientos y mayor calidad)¹⁷. Recientemente, esto ha evolucionado para realizar perfusiones cardíacas in vivo sin Langendorff 18,19,20,21,22. Hemos evolucionado la técnica de aislamiento de cardiomiocitos sin Langendorff basada en la técnica de Ackers-Johnson et ^al.18 y hemos adaptado varios componentes de las muchas técnicas de aislamiento anteriores. Estas adaptaciones clave incluyen la inyección de un tampón de limpieza helada y la incorporación de una plataforma de soporte para estabilizar la aguja, lo que permite una menor manipulación del corazón. También se detalla en esta técnica el control de la temperatura de los tampones inyectados (37 °C), lo que disminuyó el tiempo entre la inyección in vivo y la digestión debido a una menor perfusión de EDTA como se publicó anteriormente¹⁸. Al disminuir la manipulación del corazón y, por lo tanto, minimizar el tamaño del sitio de punción, se obtiene una perfusión completa y constante de las arterias coronarias. También refinamos la técnica con un método secundario de digestión de trozos, la cantidad de EDTA en el tampón de limpieza inyectado y cambiamos el pH. Nuestra técnica descrita es más confiable, más eficiente y no requiere el entrenamiento / práctica extensiva en comparación con el uso del aparato de Langendorff (Tabla 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio de acuerdo con las pautas de los NIH.

1. Preparación de la solución

NOTA: Consulte la Tabla 2 para conocer las concentraciones de tampón.

1. Preaislamiento (hasta 2 semanas antes del aislamiento de miocitos)
   1. Base tampón de perfusión: Preparar 1 L de base tampón de perfusión (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, glucosa y BDM) en 1 L de 18,2 MΩ·cm H₂O. Ajustar a pH_7,4 antes de la filtración estéril de 0,22 μm. Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento.
   2. Tampón de limpieza: Prepare 1 L de tampón de limpieza (NaCl, KCl, NaH 2PO 4, HEPES, glucosa, EDTA y BDM) en 1 L de ultrapuro 18.2 MΩ·cm H₂O. Ajuste a pH_7.4 antes de la filtración estéril de 0.22 μm. Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento.
   3. Solución madre de CaCl 2 de 100 mM: Pesar 1,11 g de CaCl 2 y disolver en 100 ml de 18,2 MΩ·cm_H2O. ultrapuro hasta el día del aislamiento.
   4. Alícuotas de liberasa: Disuelva 5 mg de enzimas digestivas en 5 ml de agua estéril sin RNasa. Preparar 0,8 ml de alícuotas y almacenar a -20 °C hasta el día del aislamiento.
   5. Laminar los platos: Aplicar 100 μL de laminina de ratón de 40 μg/ml a placas de Petri estériles de 30 ml con fondo de vidrio. Dejar reposar durante 30 min y eliminar el exceso de laminina. Coloque la laminina en una placa de Petri con incubación UV a temperatura ambiente durante 30 min. Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento (las placas de Petri laminadas pueden utilizarse hasta 2 semanas).
   6. Medios DMEM: En un gabinete de bioseguridad, agregue 2.5 ml de FBS, 0.5 ml de penicilina-estreptomicina (50 U/mL-50 μg) y 1 ml de 500 mM BDM a 46 ml de DMEM. Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento (el medio puede utilizarse hasta 2 semanas).
   7. Medios M199: Prepare 1 L de medio M199 (NaHCO₃, HEPES, L-glutatión, M199, BDM y BSA) en 1 L de 18.2 MΩ·cm H₂O. Ajuste a pH 7.4 antes de la filtración estéril (filtro de 0.22 μm). Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento.
   8. 500 mM BDM stock: Añadir 0,5 g de BDM a 10 mL de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H₂O. Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento.
   9. Creación de plataforma estabilizadora: Moldee plastilina alrededor de la base de la aguja atornillada en la llave de paso Luer. Moldee la placa de Petri que contendrá el corazón y asegúrese de que la aguja esté a la altura adecuada para la inyección del ventrículo (~ 5 mm por encima del fondo del plato).
2. El día del aislamiento
   1. Tampón de perfusión: El día del aislamiento, añadir 9,5 mg de MgCl₂ a 100 ml de base tampón de perfusión. Deje mezclar completamente antes de retirar 30 ml de tampón de perfusión completo y colóquelo en una botella de vidrio limpia y de boca ancha de 100 ml con tapa de rosca (tampón de digestión).
      NOTA: Estas adiciones se pueden hacer el día del aislamiento sin ajustes adicionales de pH, ya que su adición altera insignificantemente el pH.
      1. Retire 12 ml de tampón de perfusión y colóquelo a un lado (tampón de parada). Vierta los 58 ml restantes de tampón de perfusión en otra botella de vidrio limpia y de boca ancha de 100 ml con tapa de rosca. Conservar el tampón de perfusión restante a 37 °C durante todo el aislamiento.
   2. Tampón de digestión: Añadir 7,5 μL de 100 mM CaCl₂ a 30 ml de tampón de perfusión para una concentración final de 25 μM. Inmediatamente antes del aislamiento, añadir 770 μL de Liberase al tampón de digestión para una concentración final de 26 μg/ml.
   3. Detener tampón: Disolver 240 mg de BSA en 12 ml de tampón de perfusión. Conservar a 37 °C durante todo el aislamiento.
   4. Tampón de limpieza: Prepare una jeringa de 3 ml de tampón de limpieza y limpie la aguja de burbujas. Almacenar en hielo hasta el aislamiento.

2. Preparación del colector

1. Limpie el colector de temperatura controlada con tampón de perfusión recién preparado, teniendo cuidado de asegurarse de que no queden burbujas. Con un conector de bloqueo Luer, atornille una aguja de 27 G y limpie las burbujas. Un colector despejado es esencial para un aislamiento exitoso.

3. Preparación animal

1. Inyectar el ratón por vía intraperitoneal con 100 mg/kg de ketamina y 20 mg/kg de xilazina por peso corporal inmediatamente antes del aislamiento. Este procedimiento utilizó un ratón macho C57Bl/6 de 4 meses de edad.
2. Si es necesario, coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica calentada para estimular la sedación. Coloque los brazos del ratón y pegue las extremidades y la base de la cola a un pañal azul de laboratorio. Asegúrese de que el animal esté completamente anestesiado mediante la retirada del reflejo de pellizco del dedo del pie. Aplique una cortina estéril alrededor del área quirúrgica.

4. Procedimiento de aislamiento de cardiomiocitos

1. Exponer el esternón del ratón y, lateralmente a la línea media, cortar proximalmente a través de las costillas y a la axila. Corte suavemente completamente a través del diafragma, asegurando cortes poco profundos para evitar el corazón. Sujete el esternón con un hemostático y doble las costillas hacia atrás para exponer la cavidad torácica.
2. Retire suavemente el pericardio del corazón y corte completamente a través de la vena cava inferior, inmediatamente distal al corazón. Use una jeringa de 3 ml con una aguja de 27 g para inyectar rápidamente 3 ml de tampón de limpieza helada en el ventrículo derecho del corazón durante 1 minuto.
3. Sostenga suavemente el corazón con pinzas y aléjese del cuerpo, exponiendo la mayor cantidad posible de aorta. Usando un hemostático, sujete la aorta ascendente, teniendo cuidado de no sujetar las aurículas, y extirpe el corazón del pecho.
4. Transfiera rápidamente el corazón pinzado a la tapa de una placa de Petri de polipropileno con aproximadamente 10 ml de tampón de perfusión caliente. Coloque el corazón pinzado en la plataforma de soporte y use una aguja estabilizada de 27 G conectada al colector para inyectar 10 ml de tampón de perfusión de temperatura controlada a 37 °C en el ventrículo izquierdo durante 5 min.
5. Transfiera el corazón pinzado y la plataforma de soporte a una placa de Petri con aproximadamente 5 ml de tampón de digestión. Intercambie las jeringas de entrada por una jeringa de 50 ml con 25 ml de tampón de digestión.
6. Limpie el colector de cualquier burbuja y el tampón de perfusión restante antes de la inyección. Reemplace cuidadosamente la aguja en la misma posición de la aguja en el ápice ventricular izquierdo.
7. Use una bomba de perfusión para inyectar tampón de digestión de temperatura controlada a 37 °C en el ventrículo izquierdo durante 15 minutos usando una jeringa de 50 ml. Controle la temperatura de la solución con una camisa de agua previamente calibrada para expulsar una solución a 37 °C en el extremo de la aguja.
8. Retire los ventrículos de las aurículas y transfiéralos a un vaso de precipitados de 10 ml. Agregue 3 ml de tampón de digestión al vaso de precipitados y, con tijeras afiladas, corte los ventrículos en trozos grandes. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y colóquelo en un baño de agua agitante precalentado a 37 °C durante 5 min.
9. Deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de evitar eliminar trozos de tejido. Resuspender los trozos de tejido en 3 ml de tampón de digestión y triturar durante aproximadamente 4 minutos o hasta que se logre una mezcla homogénea.
10. Filtre las células a través de un filtro de células de nylon de 70 μm en un tubo de polipropileno de 50 ml.
11. Devolver el filtrado a un tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 ml y centrifugar durante 1 min a 100 rpm. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 ml de tope de parada.
12. Añadir 54 μL de material de CaCl 2 de 100 mM a las células resuspendidas para obtener una concentración final de CaCl₂ de 1,8 mM. Este paso también se puede realizar paso a paso para aumentar el rendimiento celular.
13. Deje que las células vivas se asienten por gravedad durante 10 minutos antes de retirar el sobrenadante que contiene células muertas. Resuspender el pellet en solución de almacenamiento (solución de perfusión con 200 μM CaCl₂). Estas células ahora se pueden usar para experimentos funcionales (es decir, imágenes / contracción de calcio, pinza de parche, etc.), cultivo, etc.
    NOTA: Las células también pueden ser resuspendidas en soluciones dependientes de laboratorio o experimento.

5. Cultivo celular

1. Cuente las células usando un hemocitómetro o por un conteo de vista de campo usando una cubierta cuadriculada. Como los miocitos son muy grandes, el conteo con un hemocitómetro no siempre es preciso. Esto se utiliza para tener una idea de aproximadamente cuántas células se obtuvieron del aislamiento.
2. Diluya las células a ~ 25,000 células / ml con medios DMEM. Agregue 1 ml de solución celular a cada pocillo.
3. Incubar a 37 °C, 95% O2, 5%_CO2 durante 2 h.
4. Aspire suavemente los medios DMEM de cada pocillo y agregue 2 ml de medios M199.
5. Incubar a 37 °C, 95% O2, 5%_CO2 durante un máximo de 24 h.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Hay algunos elementos a examinar al determinar el éxito de un aislamiento. En primer lugar, los cardiomiocitos deben tener forma de bastón sin ampollas de membrana, como las células aisladas en la Figura 1. Un aislamiento típico producirá ~ 80% de los miocitos en forma de bastón. Si el aislamiento produce menos del 50% de células en forma de bastón, entonces se considera un aislamiento fallido y no se utilizan cardiomiocitos. Por último, los cardiomiocitos deben estar inactivos. Los...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

La principal ventaja de nuestra técnica de aislamiento de cardiomiocitos sin Langendorff es que limita la hipoxia y el tiempo isquémico al no requerir canulación a un aparato de Langendorff. Alternativamente a las técnicas clásicas de Langendorff que tardan varios minutos en extraer, limpiar y colgar el corazón, lo que a menudo resulta en daño isquémico al miocito, nuestro método incluye una limpieza in vivo de la sangre a través de una solución de limpieza helada. El tampón de limpieza hela...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815