Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón

Resumen

El estándar de oro en cardiología para experimentos funcionales celulares y moleculares son los cardiomiocitos. Este artículo describe adaptaciones a la técnica no Langendorff para aislar cardiomiocitos de ratón.

Resumen

La necesidad de métodos reproducibles pero técnicamente simples que produzcan cardiomiocitos de alta calidad es esencial para la investigación en biología cardíaca. Los experimentos funcionales celulares y moleculares (por ejemplo, contracción, electrofisiología, ciclo de calcio, etc.) en cardiomiocitos son el estándar de oro para establecer los mecanismos de la enfermedad. El ratón es la especie de elección para experimentos funcionales y la técnica descrita es específicamente para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón. Los métodos anteriores que requerían un aparato de Langendorff requieren altos niveles de entrenamiento y precisión para la canulación aórtica, lo que a menudo resulta en isquemia. El campo se está desplazando hacia métodos de aislamiento sin Langendorff que son simples, son reproducibles y producen miocitos viables para la adquisición de datos fisiológicos y el cultivo. Estos métodos disminuyen en gran medida el tiempo de isquemia en comparación con la canulación aórtica y dan como resultado cardiomiocitos obtenidos de manera confiable. Nuestra adaptación al método sin Langendorff incluye una perfusión inicial con solución de limpieza helada, el uso de una plataforma estabilizadora que garantiza una aguja estable durante la perfusión y pasos de digestión adicionales para garantizar la obtención confiable de cardiomiocitos para su uso en mediciones funcionales y cultivo. Este método es simple y rápido de realizar y requiere poca habilidad técnica.

Introducción

Durante décadas, una idea esencial en la literatura de biología cardíaca es el mecanismo de acción molecular. El mecanismo de acción debe establecerse para publicar estudios confiables. Una estrategia bien establecida para determinar el mecanismo molecular son los estudios aislados de cardiomiocitos, que requieren cardiomiocitos de alta calidad para obtener datos confiables. Los experimentos celulares y moleculares realizados en cardiomiocitos para determinar el mecanismo de acción son el estándar de oro para investigar la contracción¹, electrofisiología², calcio (^Ca 2+) ciclo³, miofila....

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio de acuerdo con las pautas de los NIH.

1. Preparación de la solución

NOTA: Consulte la Tabla 2 para conocer las concentraciones de tampón.

1. Preaislamiento (hasta 2 semanas antes del aislamiento de miocitos)
   1. Base tampón de perfusión: Preparar 1 L de base tampón de perfusión (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, glucosa y BDM) en 1 L de 18,2 MΩ·cm H₂O. Ajustar a pH_7,4 antes de la filt....

Resultados

Hay algunos elementos a examinar al determinar el éxito de un aislamiento. En primer lugar, los cardiomiocitos deben tener forma de bastón sin ampollas de membrana, como las células aisladas en la Figura 1. Un aislamiento típico producirá ~ 80% de los miocitos en forma de bastón. Si el aislamiento produce menos del 50% de células en forma de bastón, entonces se considera un aislamiento fallido y no se utilizan cardiomiocitos. Por último, los cardiomiocitos deben estar inactivos. Los.......

Discusión

La principal ventaja de nuestra técnica de aislamiento de cardiomiocitos sin Langendorff es que limita la hipoxia y el tiempo isquémico al no requerir canulación a un aparato de Langendorff. Alternativamente a las técnicas clásicas de Langendorff que tardan varios minutos en extraer, limpiar y colgar el corazón, lo que a menudo resulta en daño isquémico al miocito, nuestro método incluye una limpieza in vivo de la sangre a través de una solución de limpieza helada. El tampón de limpieza hela.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815