Un metodo semplice ed efficace per isolare in modo coerente i cardiomiociti di topo

Riepilogo

Il gold standard in cardiologia per esperimenti funzionali cellulari e molecolari sono i cardiomiociti. Questo articolo descrive gli adattamenti alla tecnica non-Langendorff per isolare i cardiomiociti di topo.

Abstract

La necessità di metodi riproducibili ma tecnicamente semplici che producano cardiomiociti di alta qualità è essenziale per la ricerca in biologia cardiaca. Gli esperimenti funzionali cellulari e molecolari (ad esempio, contrazione, elettrofisiologia, ciclo del calcio, ecc.) sui cardiomiociti sono il gold standard per stabilire i meccanismi della malattia. Il topo è la specie di scelta per gli esperimenti funzionali e la tecnica descritta è specifica per l'isolamento dei cardiomiociti del topo. I metodi precedenti che richiedevano un apparato Langendorff richiedono alti livelli di allenamento e precisione per l'incannulamento aortico, spesso con conseguente ischemia. Il campo si sta spostando verso metodi di isolamento privi di Langendorff che sono semplici, sono riproducibili e producono miociti vitali per l'acquisizione e la coltura di dati fisiologici. Questi metodi riducono notevolmente il tempo di ischemia rispetto all'incannulamento aortico e si traducono in cardiomiociti ottenuti in modo affidabile. Il nostro adattamento al metodo Langendorff-free include una perfusione iniziale con soluzione di pulizia ghiacciata, l'uso di una piattaforma stabilizzante che garantisce un ago stabile durante la perfusione e ulteriori fasi di digestione per garantire cardiomiociti ottenuti in modo affidabile per l'uso in misurazioni funzionali e coltura. Questo metodo è semplice e veloce da eseguire e richiede poca abilità tecnica.

Introduzione

Per decenni, un'idea essenziale nella letteratura di biologia cardiaca è il meccanismo molecolare d'azione. Il meccanismo d'azione deve essere stabilito al fine di pubblicare studi affidabili. Una strategia consolidata per determinare il meccanismo molecolare sono gli studi isolati sui cardiomiociti, che richiedono cardiomiociti di alta qualità per ottenere dati affidabili. Gli esperimenti cellulari e molecolari eseguiti sui cardiomiociti per determinare il meccanismo d'azione sono il gold standard per studiare la contrazione¹, l'elettrofisiologia², il calcio (Ca 2+) il ciclo³, il miofilamento Ca ²⁺ la sensibilità⁴, il citoscheletro 5, il metabolismo 6, gli effetti degli ormoni⁷, le molecole di segnalazione⁸, gli studi farmacologici⁹ and so on. Il topo è diventato la specie di scelta per la maggior parte degli esperimenti di biologia cardiaca a causa della facilità di manipolazione genetica, delle sue piccole dimensioni, della sua durata relativamente breve, del basso costo, ecc¹⁰. Tuttavia, l'isolamento affidabile dei cardiomiociti di topo di alta qualità non è banale con le tecniche attuali.

I laboratori hanno isolato cardiomiociti per quasi 70 anni¹¹. Praticamente tutte le tecniche per isolare i cardiomiociti si basano sulla digestione del cuore attraverso vari enzimi (collagenasi, proteasi, tripsina, ecc.). Nei primi periodi (1950-1960), è stato impiegato il metodo del pezzo, che prevedeva la rimozione del cuore, il taglio in pezzi molto più piccoli e l'incubazione in soluzione con collagenasi / proteasi / tripsina¹². Nel 1970 i laboratori implementarono il metodo migliorato "Langendorff"¹³, che isolava i cardiomiociti usando una tecnica di isolamento basata sulla perfusione coronarica (perfusione retrograda con enzima attraverso l'apparato di Langendorff); Questa tecnica rimane il metodo dominante di isolamento dei miociti nel campo oggi, ~ 50 anni dopo^14,15,16. Recenti lavori si sono spostati sull'incannulamento del cuore in vivo per limitare il tempo di ipossia e il danno ischemico con conseguente isolamento cardiomiocitario superiore (rese migliori e qualità superiore)¹⁷. Recentemente, questo si è evoluto nell'esecuzione in vivo, perfusioni cardiache prive di Langendorff 18,19,20,21,22. Abbiamo sviluppato la tecnica di isolamento dei cardiomiociti liberi da Langendorff basata sulla tecnica Ackers-Johnson et ^al.18 e adattato vari componenti dalle molte tecniche di isolamento precedenti. Questi adattamenti chiave includono l'iniezione di un tampone di compensazione ghiacciato e l'incorporazione di una piattaforma di supporto per stabilizzare l'ago, consentendo una riduzione della manipolazione del cuore. Anche dettagliato in questa tecnica è il controllo della temperatura dei tamponi iniettati (37 °C), che ha ridotto il tempo tra l'iniezione in vivo e la digestione a causa della minore perfusione EDTA come precedentemente pubblicato¹⁸. Diminuendo la manipolazione del cuore e quindi riducendo al minimo le dimensioni del sito di puntura, si ottiene una perfusione completa e costante delle arterie coronarie. Abbiamo anche perfezionato la tecnica con un metodo di digestione secondario a pezzi, la quantità di EDTA nel tampone di compensazione iniettato e cambiato il pH. La nostra tecnica descritta è più affidabile, più efficiente e non richiede l'addestramento / pratica estensiva rispetto all'uso dell'apparato Langendorff (Tabella 1).

Protocollo

Tutte le procedure eseguite in questo studio sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso la Ohio State University in conformità con le linee guida NIH.

1. Preparazione della soluzione

NOTA: vedere la Tabella 2 per le concentrazioni tampone.

1. Pre-isolamento (fino a 2 settimane prima dell'isolamento dei miociti)
   1. Base tampone di perfusione: preparare 1 L di base tampone di perfusione (NaCl, KCl, NaH 2 PO4, HEPES, Glucosio e BDM) in 1 L di ultrapuro 18,2 MΩ·cm H₂O. Regolare a pH_7,4 prima della filtrazione sterile di 0,22 μm. Conservare a 4 °C fino al giorno dell'isolamento.
   2. Tampone di pulizia: preparare 1 L di tampone di compensazione (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, glucosio, EDTA e BDM) in 1 L di ultrapuro 18,2 MΩ·cm H₂O. Regolare a pH_7,4 prima della filtrazione sterile di 0,22 μm. Conservare a 4 °C fino al giorno dell'isolamento.
   3. Soluzione_{madre di} CaCl 2 100 mM: pesare 1,11 g di CaCl 2 e sciogliere in 100 ml di 18,2 MΩ·cm H₂ O. Conservare a temperatura ambiente fino al giorno dell'isolamento.
   4. Aliquote liberate: sciogliere 5 mg di enzimi digestivi in 5 ml di acqua sterile, priva di RNasi. Preparare 0,8 mL di aliquote e conservare a -20 °C fino al giorno dell'isolamento.
   5. Laminare i piatti: applicare 100 μL di laminina di topo da 40 μg/mL su piastre di Petri sterili da 30 ml con fondo di vetro. Lasciare riposare per 30 minuti e rimuovere la laminina in eccesso. Impostare la laminina su una piastra di Petri con incubazione UV a temperatura ambiente per 30 minuti. Conservare a 4 °C fino al giorno dell'isolamento (le piastre di Petri laminate possono essere utilizzate per un massimo di 2 settimane).
   6. Supporti DMEM: In un armadio di biosicurezza, aggiungere 2,5 ml di FBS, 0,5 ml di penicillina-streptomicina (50 U / mL-50 μg) e 1 ml di 500 mM BDM a 46 ml di DMEM. Conservare a 4 °C fino al giorno dell'isolamento (il supporto può essere utilizzato per un massimo di 2 settimane).
   7. Terreni M199: preparare 1 L di terreno M199 (NaHCO₃, HEPES, L-glutatione, M199, BDM e BSA) in 1 L di ultrapuro 18,2 MΩ·cm H₂O. Regolare a pH 7,4 prima della filtrazione sterile (filtro da 0,22 μm). Conservare a 4 °C fino al giorno dell'isolamento.
   8. 500 mM di brodo BDM: aggiungere 0,5 g di BDM a 10 ml di 18,2 MΩ·cm H₂O. Conservare a 4 °C fino al giorno dell'isolamento.
   9. Creazione della piattaforma stabilizzatrice: modellare la pasta da gioco attorno alla base dell'ago avvitata nel rubinetto Luer. Modellare la capsula di Petri che conterrà il cuore e assicurarsi che l'ago sia all'altezza corretta per l'iniezione del ventricolo (~ 5 mm sopra il fondo del piatto).
2. Il giorno dell'isolamento
   1. Tampone di perfusione: il giorno dell'isolamento, aggiungere 9,5 mg di MgCl₂ a 100 ml di base tampone di perfusione. Lasciare mescolare completamente prima di rimuovere 30 ml di tampone di perfusione completato e mettere in un flacone di vetro pulito, a bocca larga, da 100 mL con coperchio a vite (tampone di digestione).
      NOTA: Queste aggiunte possono essere effettuate il giorno dell'isolamento senza ulteriori aggiustamenti del pH poiché la loro aggiunta altera trascurabilmente il pH.
      1. Rimuovere 12 mL di tampone di perfusione e metterlo da parte (stop buffer). Versare i restanti 58 ml di tampone di perfusione in un'altra bottiglia di vetro pulita, a bocca larga, da 100 ml, con coperchio a vite. Conservare il tampone di perfusione rimanente a 37 °C durante l'isolamento.
   2. Tampone di digestione: aggiungere 7,5 μL di 100 mM CaCl₂ a 30 mL di tampone di perfusione per una concentrazione finale di 25 μM. Immediatamente prima dell'isolamento, aggiungere 770 μL di Liberase al tampone di digestione per una concentrazione finale di 26 μg/mL.
   3. Tampone di arresto: sciogliere 240 mg di BSA in 12 ml di tampone di perfusione. Conservare a 37 °C per tutta la durata dell'isolamento.
   4. Tampone di pulizia: preparare una siringa da 3 ml di tampone di compensazione e pulire l'ago dalle bolle. Conservare in ghiaccio fino all'isolamento.

2. Preparazione del collettore

1. Eliminare il collettore a temperatura controllata con tampone di perfusione appena preparato, facendo attenzione a non rimanere bolle. Utilizzando un connettore Luer lock, avvitare un ago da 27 G e liberare le bolle. Un collettore eliminato è essenziale per un isolamento di successo.

3. Preparazione degli animali

1. Iniettare il topo per via intraperitoneale con 100 mg/kg di ketamina e 20 mg/kg di xilazina in base al peso corporeo immediatamente prima dell'isolamento. Questa procedura ha utilizzato un topo maschio C57Bl/6 di 4 mesi.
2. Se necessario, posizionare il mouse su un tampone chirurgico riscaldato per incoraggiare la sedazione. Tenda le braccia del topo e fissa gli arti e la base della coda a un pannolino da laboratorio blu. Assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato dal ritiro del riflesso del pizzico della punta. Applicare un drappo sterile intorno all'area chirurgica.

4. Procedura di isolamento cardiomiocitario

1. Esporre lo sterno del topo e, lateralmente alla linea mediana, tagliare prossimalmente attraverso le costole e all'ascella. Tagliare delicatamente completamente attraverso il diaframma, assicurando tagli superficiali per evitare il cuore. Bloccare lo sterno con un emostatico e piegare le costole all'indietro per esporre la cavità toracica.
2. Rimuovere delicatamente il pericardio dal cuore e tagliare completamente attraverso la vena cava inferiore, immediatamente distale al cuore. Utilizzare una siringa da 3 ml con un ago da 27 G per iniettare rapidamente 3 ml di tampone di pulizia ghiacciato nel ventricolo destro del cuore nell'arco di 1 minuto.
3. Tenere delicatamente il cuore con una pinzetta e allontanarsi dal corpo, esponendo il più possibile l'aorta. Usando un emostato, bloccare l'aorta ascendente, facendo attenzione a non bloccare gli atri e asportare il cuore dal torace.
4. Trasferire rapidamente il cuore bloccato sul coperchio di una capsula di Petri in polipropilene con circa 10 ml di tampone di perfusione caldo. Posizionare il cuore bloccato nella piattaforma di supporto e utilizzare un ago stabilizzato da 27 G collegato al collettore per iniettare 10 ml di tampone di perfusione a temperatura controllata a 37 °C nel ventricolo sinistro nell'arco di 5 minuti.
5. Trasferire il cuore bloccato e la piattaforma di supporto in una capsula di Petri con circa 5 ml di tampone di digestione. Sostituire le siringhe di ingresso con una siringa da 50 ml con 25 ml di tampone digestivo.
6. Eliminare il collettore da eventuali bolle e dal tampone di perfusione rimanente prima dell'iniezione. Riposizionare con cautela l'ago nella stessa posizione dell'ago nell'apice ventricolare sinistro.
7. Utilizzare una pompa di perfusione per iniettare tampone di digestione a temperatura controllata a 37 °C nel ventricolo sinistro per 15 minuti utilizzando una siringa da 50 ml. Controllare la temperatura della soluzione con una camicia d'acqua precedentemente calibrata per espellere la soluzione a 37 °C all'estremità dell'ago.
8. Rimuovere i ventricoli dagli atri e trasferirli in un becher da 10 ml. Aggiungere 3 ml di tampone digestivo al becher e, usando forbici affilate, tagliare i ventricoli in grandi pezzi. Coprire il becher con un foglio di alluminio e metterlo in un bagno d'acqua agitante preriscaldato a 37 °C per 5 minuti.
9. Scartare il surnatante, facendo attenzione ad evitare di rimuovere eventuali pezzi di tessuto. Risospendere i pezzi di tessuto in 3 ml di tampone digestivo e triturare per circa 4 minuti o fino a ottenere una miscela omogenea.
10. Filtrare le celle attraverso un filtro di nylon da 70 μm in un tubo di polipropilene da 50 ml.
11. Riportare il filtrato in un tubo di polipropilene a fondo tondo da 14 ml e centrifugare per 1 minuto a 100 giri/min. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di tampone di arresto.
12. Aggiungere 54 μL di 100 mM di stock di CaCl 2 alle celle risospese per una concentrazione finale di CaCl₂ di 1,8 mM. Questo passaggio può anche essere eseguito gradualmente per aumentare la resa cellulare.
13. Lasciare che le cellule vive si depositino per gravità per 10 minuti prima di rimuovere il surnatante contenente cellule morte. Risospendere il pellet in soluzione di stoccaggio (soluzione di perfusione con 200 μM CaCl₂). Queste cellule possono ora essere utilizzate per esperimenti funzionali (ad esempio, imaging / contrazione del calcio, patch clamp, ecc.), Coltura, ecc.
    NOTA: Le cellule possono anche essere risospese in soluzioni dipendenti dal laboratorio o dall'esperimento.

5. Coltura cellulare

1. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un conteggio della vista sul campo utilizzando un foglietto di copertura a griglia. Poiché i miociti sono molto grandi, il conteggio con un emocitometro non è sempre accurato. Questo è usato per avere un'idea di quante cellule sono state ottenute dall'isolamento.
2. Diluire le cellule a ~ 25.000 cellule / ml con mezzi DMEM. Aggiungere 1 mL di soluzione cellulare a ciascun pozzetto.
3. Incubare a 37 °C, 95% O 2, 5% CO 2 per₂ ore.
4. Aspirare delicatamente il fluido DMEM da ciascun pozzetto e aggiungere 2 mL di materiale M199.
5. Incubare a 37 °C, 95% O 2, 5% CO₂ fino a 24 ore.

Risultati

Ci sono alcuni elementi da esaminare quando si determina il successo di un isolamento. In primo luogo, i cardiomiociti devono essere a forma di bastoncello senza macchie di membrana, come le cellule isolate nella Figura 1. Un tipico isolamento produrrà ~ 80% dei miociti a forma di bastoncello. Se l'isolamento produce meno del 50% di cellule a forma di bastoncello, allora è considerato un isolamento non riuscito e i cardiomiociti non vengono utilizzati. Infine, i cardiomiociti dovrebbero es...

Discussione

Il vantaggio principale della nostra tecnica di isolamento cardiomiocitario senza Langendorff è che limita l'ipossia e il tempo ischemico non richiedendo l'incannulamento a un apparato Langendorff. In alternativa alle classiche tecniche Langendorff che richiedono diversi minuti per rimuovere, pulire e appendere il cuore, spesso con conseguente danno ischemico al miocita, il nostro metodo include una pulizia del sangue in vivo tramite una soluzione di pulizia ghiacciata. Il tampone di compensazione ghia...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815