JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Золотым стандартом в кардиологии для клеточных и молекулярно-функциональных экспериментов являются кардиомиоциты. В этой статье описываются адаптации к методу Лангендорфа для выделения кардиомиоцитов мыши.

Аннотация

Потребность в воспроизводимых, но технически простых методах, дающих высококачественные кардиомиоциты, имеет важное значение для исследований в области биологии сердца. Клеточные и молекулярно-функциональные эксперименты (например, сокращение, электрофизиология, кальциевый цикл и т. д.) на кардиомиоцитах являются золотым стандартом для установления механизма (механизмов) заболевания. Мышь является предпочтительным видом для функциональных экспериментов, и описанная методика предназначена специально для выделения кардиомиоцитов мыши. Предыдущие методы, требующие аппарата Лангендорфа, требуют высокого уровня подготовки и точности для канюляции аорты, что часто приводит к ишемии. Область смещается в сторону методов выделения без Лангендорфа, которые просты, воспроизводимы и дают жизнеспособные миоциты для сбора физиологических данных и культивирования. Эти методы значительно сокращают время ишемии по сравнению с канюляцией аорты и приводят к надежно полученным кардиомиоцитам. Наша адаптация к методу без Лангендорфа включает в себя начальную перфузию ледяным очищающим раствором, использование стабилизирующей платформы, которая обеспечивает устойчивую иглу во время перфузии, и дополнительные этапы пищеварения для обеспечения надежно полученных кардиомиоцитов для использования в функциональных измерениях и посеве. Этот метод прост и быстр в исполнении и не требует особых технических навыков.

Введение

На протяжении десятилетий важной идеей в литературе по биологии сердца является молекулярный механизм действия. Механизм действия должен быть установлен, чтобы публиковать надежные исследования. Хорошо зарекомендовавшей себя стратегией определения молекулярного механизма являются изолированные исследования кардиомиоцитов, которые требуют высококачественных кардиомиоцитов для получения достоверных данных. Клеточные и молекулярные эксперименты, проводимые на кардиомиоцитах для определения механизма действия, являются золотым стандартом для исследования сокращения1, электрофизиологии2, цикла кальция (Ca2+)3, чувствительности миофиламентаCa 2+ 4, цитоскелета5, метаболизма6, эффектов гормонов7, сигнальных молекул8, исследований лекарств9 и так далее. Мышь стала предпочтительным видом для большинства экспериментов по биологии сердца из-за простоты генетических манипуляций, ее небольшого размера, относительно короткой продолжительности жизни, низкой стоимости и т. д.10. Тем не менее, надежное выделение высококачественных кардиомиоцитов мыши не является тривиальным с современными методами.

Лаборатории выделяют кардиомиоциты уже почти 70 лет11. Практически все методы выделения кардиомиоцитов основаны на переваривании сердца с помощью различных ферментов (коллагеназа, протеаза, трипсин и т. Д.). В ранние периоды (1950-1960-е годы) использовался метод кусков, который включал удаление сердца, разрезание на гораздо более мелкие кусочки и инкубацию в растворе с коллагеназой / протеазой / трипсином12. В 1970-х годах лаборатории внедрили улучшенный метод «Лангендорфа»13, который изолировал кардиомиоциты с использованием метода изоляции на основе перфузии коронарных артерий (ретроградная перфузия ферментом через аппарат Лангендорфа); Этот метод остается доминирующим методом выделения миоцитов в этой области сегодня, ~ 50 лет спустя14,15,16. Недавняя работа сместилась в сторону канюляции сердца in vivo для ограничения времени гипоксии и ишемического повреждения, что приводит к превосходному выделению кардиомиоцитов (лучшие выходы и более высокое качество)17. В последнее время это превратилось в выполнение in vivo, перфузии сердца без Лангендорфа 18,19,20,21,22. Мы разработали метод выделения кардиомиоцитов без Лангендорфа на основе метода Ackers-Johnson et al.18 и адаптировали различные компоненты из многих предыдущих методов выделения. Эти ключевые приспособления включают инъекцию ледяного очищающего буфера и включение поддерживающей платформы для стабилизации иглы, что позволяет уменьшить манипуляции с сердцем. Также в этом методе подробно описан контроль температуры вводимых буферов (37 ° C), что уменьшило время между инъекцией in vivo и перевариванием из-за меньшей перфузии ЭДТА, как было опубликованоранее 18. Уменьшая манипуляции с сердцем и, следовательно, минимизируя размер места прокола, достигается тщательная и постоянная перфузия коронарных артерий. Мы также усовершенствовали технику с помощью метода вторичного разложения кусков, количества ЭДТА в введенном буфере очистки и изменили pH. Описанная нами методика надежнее, эффективнее и не требует обширной подготовки/практики по сравнению с использованием аппарата Лангендорфа (табл. 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры, выполненные в этом исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете штата Огайо в соответствии с руководящими принципами NIH.

1. Приготовление раствора

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите таблицу 2 для буферных концентраций.

  1. Предварительная изоляция (за 2 недели до выделения миоцитов)
    1. Перфузионное буферное основание: Приготовьте 1 л перфузионного буферного основания (NaCl, KCl,2 PO 4, HEPES, глюкоза и BDM) в 1 л сверхчистого 18,2 МОм · см H2O. Отрегулируйте pH7,4 перед стерильной фильтрацией 0,22 мкм. Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции.
    2. Очищающий буфер: Приготовьте 1 л очищающего буфера (NaCl, KCl, 2 PO 4, HEPES, глюкоза, ЭДТА и BDM) в 1 л сверхчистого 18,2 МОм · см H2O. Отрегулируйте до pH7,4 перед стерильной фильтрацией 0,22 мкм. Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции.
    3. Исходный растворCaCl2 100 мМ: взвесьте 1,11 г CaCl 2 и растворите в 100 мл сверхчистого 18,2 МОм · см H2O. Хранить при комнатной температуре до дня изоляции.
    4. Аликвоты либерразы: растворите 5 мг пищеварительных ферментов в 5 мл стерильной воды, не содержащей РНКазы. Приготовьте аликвоты объемом 0,8 мл и храните при температуре -20 °C до дня изоляции.
    5. Ламинируйте посуду: нанесите 100 мкл 40 мкг/мл мышиного ламинина на стерильные чашки Петри со стеклянным дном объемом 30 мл. Оставьте на 30 минут и удалите излишки ламинина. Установите ламинин на чашку Петри с УФ-инкубацией при комнатной температуре на 30 мин. Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции (ламинированные чашки Петри можно использовать до 2 недель).
    6. Среда DMEM: В шкаф биобезопасности добавьте 2,5 мл FBS, 0,5 мл пенициллина-стрептомицина (50 ЕД/мл-50 мкг) и 1 мл 500 мМ BDM к 46 мл DMEM. Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции (среду можно использовать до 2 недель).
    7. Среда M199: Приготовьте 1 л среды M199 (NaHCO3, HEPES, L-глутатион, M199, BDM и BSA) в 1 л сверхчистой среды 18,2 МОм · см H2O. Отрегулируйте до pH 7,4 перед стерильной фильтрацией (фильтр 0,22 мкм). Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции.
    8. Запас 500 мМ BDM: добавьте 0,5 г BDM к 10 мл сверхчистого 18,2 МОм · см H2O. Хранить при температуре 4 °C до дня изоляции.
    9. Создание стабилизирующей платформы: Формовка пластилина вокруг основания иглы, ввинченной в запорный кран Луера. Приготовьте форму к чашке Петри, в которой будет находиться сердце, и убедитесь, что игла находится на правильной высоте для инъекции желудочка (~ 5 мм над дном чашки).
  2. День изоляции
    1. Перфузионный буфер: В день выделения добавьте 9,5 мг MgCl2к 100 мл перфузионного буферного основания. Дайте полностью перемешаться перед удалением 30 мл готового перфузионного буфера и поместите в чистую стеклянную бутылку объемом 100 мл с широким горлышком и крышкой с завинчивающейся крышкой (буфер для разложения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти добавки могут быть сделаны в день изоляции без дополнительной корректировки pH, так как их добавление незначительно изменяет pH.
      1. Извлеките 12 мл перфузионного буфера и отложите в сторону (стоп-буфер). Перелейте оставшиеся 58 мл перфузионного буфера в другую чистую стеклянную бутылку объемом 100 мл с широким горлышком и крышкой с завинчивающейся крышкой. Храните оставшийся буфер для перфузии при температуре 37 °C в течение всей изоляции.
    2. Буфер для разложения: добавьте 7,5 мкл 100 мМ CaClот 2 до 30 мл перфузионного буфера для конечной концентрации 25 мкМ. Непосредственно перед выделением добавьте 770 мкл либеразы в буфер для разложения для конечной концентрации 26 мкг/мл.
    3. Стоп-буфер: растворите 240 мг BSA в 12 мл перфузионного буфера. Хранить при температуре 37 °C во время изоляции.
    4. Очищающий буфер: Подготовьте шприц очищающего буфера объемом 3 мл и очистите иглу от пузырьков. Хранить на льду до изоляции.

2. Подготовка коллектора

  1. Очистите коллектор с регулируемой температурой свежеприготовленным буфером для перфузии, следя за тем, чтобы не осталось пузырьков. Используя соединитель замка Luer, вкрутите иглу 27 G и очистите от пузырьков. Очищенный коллектор необходим для успешной изоляции.

3. Подготовка животных

  1. Вводят мышам внутрибрюшинно 100 мг/кг кетамина и 20 мг/кг ксилазина по массе тела непосредственно перед выделением. В этой процедуре использовался 4-месячный самец мыши C57Bl / 6.
  2. При необходимости поместите мышь на нагретую хирургическую подушечку, чтобы стимулировать седативный эффект. Наденьте палатку на руки мыши и прикрепите конечности и основание хвоста к синему лабораторному подгузнику. Убедитесь, что животное полностью обезболито, сняв рефлекс защемления пальцев ног. Наложите стерильную простыню на операционную область.

4. Процедура выделения кардиомиоцитов

  1. Обнажите грудину мыши и латерально к средней линии разрежьте проксимально через ребра и до подмышечной впадины. Аккуратно прорежьте диафрагму полностью, делая неглубокие разрезы, чтобы избежать сердца. Зажмите грудину гемостатом и сложите ребра назад, чтобы обнажить грудную полость.
  2. Аккуратно извлеките перикард из сердца и полностью прорежьте нижнюю полую вену, непосредственно дистальнее сердца. Используйте шприц объемом 3 мл с иглой 27 г, чтобы быстро ввести 3 мл ледяного очищающего буфера в правый желудочек сердца в течение 1 минуты.
  3. Аккуратно зажмите сердце пинцетом и оттяните от тела, обнажив как можно большую часть аорты. Используя гемостат, пережмите восходящую аорту, стараясь не пережать предсердия, и иссеките сердце из грудной клетки.
  4. Быстро перенесите зажатое сердце на крышку полипропиленовой чашки Петри с примерно 10 мл теплого перфузионного буфера. Поместите зажатое сердце в опорную платформу и используйте стабилизированную иглу 27 G, прикрепленную к коллектору, чтобы ввести 10 мл перфузионного буфера с регулируемой температурой 37 °C в левый желудочек в течение 5 минут.
  5. Перенесите зажатое сердце и опорную платформу в чашку Петри с примерно 5 мл буфера для пищеварения. Замените входные шприцы на шприц объемом 50 мл с буфером для разложения 25 мл.
  6. Перед инъекцией очистите коллектор от пузырьков и оставшегося буфера для перфузии. Осторожно вставьте иглу в то же положение иглы в верхушке левого желудочка.
  7. Используйте перфузионный насос для введения буфера для разложения 37 °C с регулируемой температурой в левый желудочек в течение 15 минут с помощью шприца объемом 50 мл. Контролируйте температуру раствора с помощью водяной рубашки, предварительно откалиброванной для выброса раствора при температуре 37 °C на конце иглы.
  8. Удалите желудочки из предсердий и пересадите в стакан объемом 10 мл. Добавьте 3 мл буфера для пищеварения в стакан и острыми ножницами разрежьте желудочки на большие куски. Накройте стакан алюминиевой фольгой и поставьте на водяную баню, разогретую до 37 °C, на 5 минут.
  9. Откажитесь от надосадочной жидкости, стараясь не удалять куски ткани. Ресуспендировать кусочки ткани в 3 мл буфера для разложения и растирать в течение примерно 4 мин или до получения однородной смеси.
  10. Отфильтруйте клетки через нейлоновый сетчатый фильтр для ячеек размером 70 мкм в полипропиленовую пробирку объемом 50 мл.
  11. Верните фильтрат в полипропиленовую пробирку с круглым дном объемом 14 мл и центрифугу в течение 1 мин при 100 об/мин. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 3 мл стоп-буфера.
  12. Добавьте 54 мкл 100 мМ запаса CaCl2 в ресуспендированные ячейки для получения конечной концентрацииCaCl2 1,8 мМ. Этот шаг также может быть выполнен поэтапно, чтобы увеличить выход клеток.
  13. Дайте живым клеткам осесть под действием силы тяжести в течение 10 минут, прежде чем удалять надосадочную жидкость, содержащую мертвые клетки. Ресуспендировать гранулы в растворе для хранения (перфузионный раствор с 200 мкМCaCl2). Эти клетки теперь можно использовать для функциональных экспериментов (например, визуализации/сокращения кальция, пластыря и т. д.), культивирования и т. д.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки также могут быть ресуспендированы в лабораторных или экспериментальных растворах.

5. Клеточная культура

  1. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или с помощью полевого просмотра с помощью сетчатого покровного листа. Поскольку миоциты очень большие, подсчет с помощью гемоцитометра не всегда точен. Это используется, чтобы получить представление о том, сколько примерно клеток было получено из выделения.
  2. Разбавьте клетки до ~ 25 000 клеток / мл с помощью среды DMEM. Добавьте по 1 мл клеточного раствора в каждую лунку.
  3. Инкубировать при 37 °C, 95% O 2, 5 % CO 2 в течение2 часов.
  4. Аккуратно аспирируйте среду DMEM из каждой лунки и добавьте 2 мл среды M199.
  5. Инкубировать при 37 °C, 95% O 2, 5 % CO2 до 24 часов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Есть несколько элементов, которые следует учитывать при определении успешности изоляции. Во-первых, кардиомиоциты должны иметь палочковидную форму без мембранных пузырьков, таких как клетки, выделенные на рисунке 1. Типичная изоляция дает ~ 80% миоцитов палочковидной фо?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Основное преимущество нашей методики выделения кардиомиоцитов без Лангендорфа заключается в том, что она ограничивает время гипоксии и ишемии, не требуя канюляции в аппарате Лангендорфа. В отличие от классических методов Лангендорфа, которые занимают несколько минут для удаления, оч?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Отсутствие конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) и T32 HL134616 (Sturgill and Salyer).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cc Bd Luer-Lok SyringeFisher Sci14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form BeakerCole-PalmerUX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottleDWK Life SciencesUX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With CapFisher Sci14-959-11B
2,3-Butanedione MonoximeSigmaB0753>98%
3 cc BD Luer-Lok SyringeFisher Sci14-823-435
35 mm glass bottom dishesMatTek CorporationP35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without NeedleFisher Sci13-689-8
50 mL Conical Centrifuge TubesCole-PalmerEW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating PadFisher Sci14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic NeedlesBecton Dickinson305109
Bovine Serum AlbuminSigmaA3803Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrateSigmaC7902>99%
D-(+)-GlucoseSigmaG7021Suitable for cell culture, >99.5%
DMEMFisher Sci11965092
EDTAFisher SciAAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture DishCorning353003
FBSR&D Systems (Bio-techne)S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion CirculatorsFisher Sci13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic ForcepsWorld Precision Instruments15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber SetFisher Sci02-671-11
HEPESSigmaH4034>99.5%
Labeling TapeFisher Sci15-901-10R
Legato 100 Syringe PumpkdScientific788100
L-glutathioneFisher SciICN19467980
Liberase TH Research GradeSigma5401135001High thermolysin concentration
M199Fisher SciMT10060CV
Magnesium ChlorideInvitrogenAM9530G
Mouse LamininCorning354232
Pen/StrepFisher Sci
Potassium ChlorideSigmaP5405>99%
Precision Digital Reciprocating Water BathThermoFisher ScientificTSCIR19
Sodium BicarbonateSigmaS5761Suitable for cell culture
Sodium ChlorideSigmaS5886>99%
Sodium phosphate monobasicSigmaS5011>99%
Sterile Cell Strainer 70 µmFisher Sci22-363-548
Student Fine ScissorsFine Science Tools91460-11
VWR Absorbent UnderpadsFisher SciNC9481815

Ссылки

  1. Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
  2. Ziolo, M. T., et al. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).
  3. Traynham, C. J., et al. Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling. PLoS One. 7 (12), 52005(2012).
  4. Nixon, B. R., et al. Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).
  5. Swager, S. A., et al. Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1. Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).
  6. Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
  7. Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).
  8. Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).
  9. Roof, S. R., et al. CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat. Frontiers in Physiology. 8, 894(2017).
  10. Milani-Nejad, N. J. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  11. Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).
  12. Kono, T. Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues. Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).
  13. Baker, J. B. An improved apparatus for mammalian heart perfusion. The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).
  14. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).
  15. Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
  16. Zhang, Z., et al. An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605(2016).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
  20. Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart. AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140(2019).
  21. Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).
  22. Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e61866(2021).
  23. Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers. Methods in Cell Biology. 99, 126(1994).
  24. Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart. Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).
  25. Thum, J. B. Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
  26. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены