Une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris

Résumé

L’étalon-or en cardiologie pour les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires sont les cardiomyocytes. Cet article décrit les adaptations à la technique non-Langendorff pour isoler les cardiomyocytes de souris.

Résumé

Le besoin de méthodes reproductibles mais techniquement simples produisant des cardiomyocytes de haute qualité est essentiel pour la recherche en biologie cardiaque. Les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires (p. ex. contraction, électrophysiologie, cycle du calcium, etc.) sur les cardiomyocytes sont l’étalon-or pour établir le(s) mécanisme(s) de la maladie. La souris est l’espèce de choix pour les expériences fonctionnelles et la technique décrite est spécifiquement pour l’isolement des cardiomyocytes de souris. Les méthodes antérieures nécessitant un appareil de Langendorff nécessitent des niveaux élevés d’entraînement et de précision pour la canulation aortique, entraînant souvent une ischémie. Le domaine évolue vers des méthodes d’isolement sans Langendorff qui sont simples, reproductibles et produisent des myocytes viables pour l’acquisition de données physiologiques et la culture. Ces méthodes diminuent considérablement le temps d’ischémie par rapport à la canulation aortique et permettent d’obtenir des cardiomyocytes obtenus de manière fiable. Notre adaptation à la méthode sans Langendorff comprend une perfusion initiale avec une solution de nettoyage glacé, l’utilisation d’une plate-forme stabilisatrice qui assure une aiguille stable pendant la perfusion et des étapes de digestion supplémentaires pour garantir un obtention fiable de cardiomyocytes pour une utilisation dans les mesures fonctionnelles et la culture. Cette méthode est simple et rapide à réaliser et nécessite peu de compétences techniques.

Introduction

Pendant des décennies, une idée essentielle dans la littérature en biologie cardiaque est le mécanisme moléculaire de l’action. Le mécanisme d’action doit être établi afin de publier des études fiables. Une stratégie bien établie pour déterminer le mécanisme moléculaire consiste en des études de cardiomyocytes isolés, qui nécessitent des cardiomyocytes de haute qualité pour obtenir des données fiables. Les expériences cellulaires et moléculaires effectuées sur les cardiomyocytes pour déterminer le mécanisme d’action sont l’étalon-or pour étudier la contraction¹, l’électrophysiologie², le cycle du calcium (Ca 2+)³, la sensibilité du myofilament Ca^{2+ 4}, le cytosquelette⁵, le métabolisme⁶, les effets des hormones⁷, les molécules de signalisation⁸, les études sur les médicaments⁹ etc. La souris est devenue l’espèce de choix pour la plupart des expériences de biologie cardiaque en raison de la facilité de manipulation génétique, de sa petite taille, de sa durée de vie relativement courte, de son faible coût, etc.¹⁰. Cependant, l’isolement fiable des cardiomyocytes de souris de haute qualité n’est pas trivial avec les techniques actuelles.

Les laboratoires isolent les cardiomyocytes depuis près de 70 ans¹¹. Pratiquement toutes les techniques d’isolement des cardiomyocytes reposent sur la digestion du cœur via diverses enzymes (collagénase, protéase, trypsine, etc.). Dans les premières périodes (années 1950-1960), la méthode des morceaux a été utilisée, qui consistait à retirer le cœur, à couper en morceaux beaucoup plus petits et à incuber en solution avec collagénase / protéase / trypsine¹². Dans les années 1970, les laboratoires ont mis en œuvre la méthode améliorée « Langendorff »¹³, qui isolait les cardiomyocytes à l’aide d’une technique d’isolement basée sur la perfusion des artères coronaires (perfusion rétrograde avec enzyme via l’appareil de Langendorff); Cette technique reste la méthode dominante d’isolement des myocytes dans le domaine aujourd’hui, ~50 ans plus tard^14,15,16. Des travaux récents se sont tournés vers la canulation du cœur in vivo pour limiter le temps d’hypoxie et les dommages ischémiques, ce qui a entraîné des isolements de cardiomyocytes supérieurs (meilleurs rendements et meilleure qualité)¹⁷. Récemment, cela a évolué pour effectuer in vivo, des perfusions cardiaques sans Langendorff 18,19,20,21,22. Nous avons fait évoluer la technique d’isolation des cardiomyocytes sans Langendorff basée sur la technique d’Ackers-Johnson et ^al.18 et adapté divers composants des nombreuses techniques d’isolement précédentes. Ces adaptations clés comprennent l’injection d’un tampon de nettoyage glacé et l’incorporation d’une plate-forme de soutien pour stabiliser l’aiguille, ce qui permet de réduire la manipulation du cœur. Cette technique détaille également le contrôle de la température des tampons injectés (37 °C), qui réduit le temps entre l’injection in vivo et la digestion en raison d’une perfusion réduite d’EDTA, comme publié précédemment¹⁸. En diminuant la manipulation du cœur et donc en minimisant la taille du site de ponction, on obtient une perfusion complète et constante des artères coronaires. Nous avons également affiné la technique avec une méthode de digestion secondaire en morceaux, la quantité d’EDTA dans le tampon de compensation injecté et modifié le pH. Notre technique décrite est plus fiable, plus efficace et ne nécessite pas la formation / pratique approfondie par rapport à l’utilisation de l’appareil Langendorff (tableau 1).

Protocole

Toutes les procédures effectuées dans cette étude ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Ohio State University conformément aux directives des NIH.

1. Préparation de la solution

NOTA : Veuillez consulter le tableau 2 pour connaître les concentrations de tampons.

1. Pré-isolement (jusqu’à 2 semaines avant l’isolement des myocytes
   1. Base tampon de perfusion : Préparer 1 L de base tampon de perfusion (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose et BDM) dans 1 L de 18,2 MΩ·cm H₂O ultrapur. Ajuster à pH_7,4 avant la filtration stérile de 0,22 μm. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.
   2. Tampon de nettoyage: Préparer 1 L de tampon de nettoyage (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose, EDTA et BDM) dans 1 L de 18,2 MΩ·cm H₂O ultrapur. Ajuster à pH_7,4 avant une filtration stérile de 0,22 μm. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.
   3. Solution mère de CaCl 2 de 100 mM : Peser 1,11 g de CaCl 2 et dissoudre dans 100 mL de 18,2 MΩ·cm H₂ O ultrapure. Conserver à température ambiantejusqu’au jour de l’isolement.
   4. Aliquotes liberase : Dissoudre 5 mg d’enzymes digestives dans 5 mL d’eau stérile sans RNase. Préparer 0,8 mL d’aliquotes et conserver à -20 °C jusqu’au jour de l’isolement.
   5. Laminer les plats : Appliquer 100 μL de laminine de souris à 40 μg/mL sur des boîtes de Petri stériles de 30 ml à fond de verre. Laisser reposer pendant 30 minutes et enlever l’excès de laminine. Réglez la laminine sur une boîte de Petri avec incubation UV à température ambiante pendant 30 min. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement (les boîtes de Petri laminées peuvent être utilisées jusqu’à 2 semaines).
   6. Milieu DMEM : Dans une enceinte de biosécurité, ajouter 2,5 mL de FBS, 0,5 mL de Pénicilline-Streptomycine (50 U/mL-50 μg) et 1 mL de 500 mM de BDM à 46 mL de DMEM. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement (le milieu peut être utilisé jusqu’à 2 semaines).
   7. Milieu M199 : Préparer 1 L de milieu M199 (NaHCO₃, HEPES, L-glutathion, M199, BDM et BSA) dans 1 L de 18,2 MΩ·cm H₂O ultrapur. Ajuster à pH 7,4 avant la filtration stérile (filtre de 0,22 μm). Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.
   8. Stock de BDM 500 mM : Ajouter 0,5 g de BDM à 10 mL de 18,2 MΩ·cm H₂O ultrapur. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.
   9. Création de plate-forme stabilisatrice: pâte à modeler autour de la base de l’aiguille vissée dans le robinet d’arrêt Luer. Mouler dans la boîte de Petri qui contiendra le cœur et s’assurer que l’aiguille est à la bonne hauteur pour l’injection du ventricule (~5 mm au-dessus du fond de la boîte).
2. Le jour de l’isolement
   1. Tampon de perfusion : Le jour de l’isolement, ajouter 9,5 mg de MgCl₂ à 100 mL de base tampon de perfusion. Laisser mélanger complètement avant de retirer 30 ml de tampon de perfusion terminé et placer dans une bouteille de verre propre et à large ouverture de 100 ml munie d’un couvercle à vis (tampon de digestion).
      REMARQUE : Ces ajouts peuvent être effectués le jour de l’isolement sans ajustement supplémentaire du pH, car leur ajout modifie de façon négligeable le pH.
      1. Retirer 12 ml de tampon de perfusion et placer sur le côté (tampon d’arrêt). Versez les 58 ml restants de tampon de perfusion dans une autre bouteille en verre propre et à large ouverture de 100 ml munie d’un couvercle à vis. Entreposer le tampon de perfusion restant à 37 °C pendant toute la durée de l’isolement.
   2. Tampon de digestion : Ajouter 7,5 μL de CaCl₁₀₀ mM 2 à 30 mL de tampon de perfusion pour une concentration finale de 25 μM. Immédiatement avant l’isolement, ajouter 770 μL de Liberase au tampon de digestion pour une concentration finale de 26 μg/mL.
   3. Tampon d’arrêt : Dissoudre 240 mg de BSA dans 12 mL de tampon de perfusion. Conserver à 37 °C pendant toute la durée de l’isolement.
   4. Tampon d’élimination : Préparez une seringue de 3 ml de tampon de nettoyage et débarrassez-vous de l’aiguille des bulles. Conserver sur de la glace jusqu’à l’isolement.

2. Préparation du collecteur

1. Dégagez le collecteur à température contrôlée avec un tampon de perfusion fraîchement préparé, en veillant à ne pas laisser de bulles. À l’aide d’un connecteur Luer lock, vissez une aiguille de 27 G et débarrassez-vous des bulles. Un collecteur dégagé est essentiel pour un isolement réussi.

3. Préparation des animaux

1. Injecter à la souris par voie intrapéritonéale 100 mg/kg de kétamine et 20 mg/kg de xylazine en poids corporel immédiatement avant l’isolement. Cette procédure a utilisé une souris C57Bl/6 mâle âgée de 4 mois.
2. Si nécessaire, placez la souris sur un coussin chirurgical chauffé pour encourager la sédation. Tendez les bras de la souris et collez les membres et la base de la queue à une couche de laboratoire bleue. S’assurer que l’animal est complètement anesthésié par le retrait du réflexe de pincement des orteils. Appliquez un champ stérile autour de la zone chirurgicale.

4. Procédure d’isolement des cardiomyocytes

1. Exposez le sternum de la souris et, latéralement à la ligne médiane, coupez proximale à travers les côtes et à l’aisselle. Couper doucement complètement à travers le diaphragme, en assurant des coupures peu profondes pour éviter le cœur. Serrez le sternum avec un hémostatique et pliez les côtes vers l’arrière pour exposer la cavité thoracique.
2. Retirez doucement le péricarde du cœur et coupez complètement la veine cave inférieure, immédiatement distale au cœur. Utilisez une seringue de 3 mL avec une aiguille de 27 G pour injecter rapidement 3 mL de tampon de nettoyage glacé dans le ventricule droit du cœur pendant 1 min.
3. Tenez doucement le cœur à l’aide d’une pince à épiler et éloignez-vous du corps, en exposant autant que possible l’aorte. À l’aide d’un hémostatique, serrez l’aorte ascendante, en prenant soin de ne pas serrer les oreillettes, et excisez le cœur de la poitrine.
4. Transférer rapidement le cœur serré sur le couvercle d’une boîte de Petri en polypropylène avec environ 10 ml de tampon de perfusion chaude. Placez le cœur serré dans la plate-forme de support et utilisez une aiguille stabilisée de 27 G fixée au collecteur pour injecter 10 ml de tampon de perfusion à température contrôlée à 37 °C dans le ventricule gauche pendant 5 minutes.
5. Transférer le cœur serré et la plate-forme de soutien dans une boîte de Petri avec environ 5 ml de tampon de digestion. Échangez les seringues d’entrée contre une seringue de 50 mL avec 25 mL de tampon de digestion.
6. Débarrassez le collecteur de toute bulle et du tampon de perfusion restant avant l’injection. Replacez délicatement l’aiguille dans la même position d’aiguille dans l’apex ventriculaire gauche.
7. Utilisez une pompe de perfusion pour injecter un tampon de digestion à température contrôlée à 37 °C dans le ventricule gauche pendant 15 minutes à l’aide d’une seringue de 50 mL. Contrôler la température de la solution à l’aide d’une chemise d’eau préalablement calibrée pour éjecter une solution à 37 °C à l’extrémité de l’aiguille.
8. Retirez les ventricules des oreillettes et transférez-les dans un bécher de 10 mL. Ajouter 3 mL de tampon de digestion dans le bécher et, à l’aide de ciseaux tranchants, couper les ventricules en gros morceaux. Couvrir le bécher de papier d’aluminium et placer dans un bain-marie en agitation préchauffé à 37 °C pendant 5 min.
9. Jetez le surnageant, en prenant soin d’éviter d’enlever des morceaux de tissu. Remettez en suspension les morceaux de tissu dans 3 mL de tampon de digestion et triturez pendant environ 4 minutes ou jusqu’à ce qu’un mélange homogène soit obtenu.
10. Filtrer les cellules à travers une crépine à cellules en nylon de 70 μm dans un tube en polypropylène de 50 mL.
11. Remettre le filtrat dans un tube en polypropylène à fond rond de 14 ml et centrifuger pendant 1 min à 100 tr/min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 3 mL de tampon stop.
12. Ajouter 54 μL de 100 mM de CaCl₂ aux cellules remises en suspension pour_{une concentration finale} de CaCl2 de 1,8 mM. Cette étape peut également être effectuée étape à pas pour augmenter le rendement cellulaire.
13. Laisser les cellules vivantes se déposer par gravité pendant 10 minutes avant de retirer le surnageant contenant les cellules mortes. Remettre en suspension la pastille dans une solution de stockage (solution de perfusion avec 200 μM de CaCl2). Ces cellules peuvent maintenant être utilisées pour des expériences fonctionnelles (c.-à-d. imagerie / contraction du calcium, pince de patch, etc.), la culture, etc.
    REMARQUE: Les cellules peuvent également être remises en suspension dans des solutions dépendantes du laboratoire ou de l’expérience.

5. Culture cellulaire

1. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou par un comptage de vue de champ à l’aide d’un bordereau de couverture quadrillé. Comme les myocytes sont très gros, le comptage à l’aide d’un hémocytomètre n’est pas toujours précis. Ceci est utilisé pour avoir une idée approximative du nombre de cellules obtenues à partir de l’isolement.
2. Diluer les cellules à ~25 000 cellules/ml avec un milieu DMEM. Ajouter 1 mL de solution cellulaire à chaque puits.
3. Incuber à 37 °C, 95%_O2, 5% CO 2 pendant₂ h.
4. Aspirer doucement le média DMEM de chaque puits et ajouter 2 ml de média M199.
5. Incuber à 37 °C, 95% O 2, 5% CO₂ jusqu’à 24 h.

Résultats

Il y a quelques éléments à examiner pour déterminer le succès d’un isolement. Tout d’abord, les cardiomyocytes doivent être en forme de bâtonnets sans blebs membranaires, tels que les cellules isolées à la figure 1. Un isolement typique donnera ~80% des myocytes étant en forme de bâtonnet. Si l’isolement produit moins de 50% de cellules en forme de bâtonnet, il est considéré comme un isolement infructueux et les cardiomyocytes ne sont pas utilisés. Enfin, les cardiomyocy...

Discussion

Le principal avantage de notre technique d’isolation des cardiomyocytes sans Langendorff est qu’elle limite l’hypoxie et le temps ischémique en ne nécessitant pas de canulation à un appareil de Langendorff. Alternative aux techniques classiques de Langendorff qui prennent plusieurs minutes pour enlever, nettoyer et suspendre le cœur, entraînant souvent des dommages ischémiques au myocyte, notre méthode comprend une élimination in vivo du sang via une solution de nettoyage glacée. Le tampo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815