体外研究可生物降解种植体材料的直接和间接培养方法

摘要

我们介绍了直接培养、直接暴露培养和暴露培养三种方法，用于评估可生物降解植入物材料的 体外 细胞相容性。这些 体外 方法模仿不同的 体内 细胞 - 植入物相互作用，可以应用于研究各种可生物降解的材料。

摘要

在过去的几十年中，可生物降解材料已被广泛探索用于生物医学应用，如骨科，牙科和颅颌面植入物。为了筛选用于生物医学应用的可生物降解材料，有必要从 体外 细胞反应，细胞相容性和细胞毒性的角度评估这些材料。国际标准化组织（ISO）标准已被广泛用于生物材料的评估。然而，大多数ISO标准最初是为了评估不可降解材料的细胞毒性而建立的，因此为筛选可生物降解材料提供的价值有限。

本文介绍并讨论了三种不同的培养方法，即直接培养法、直接暴露培养法和暴露培养方法，用于评估具有不同细胞类型的可生物降解植入物材料（包括可生物降解聚合物、陶瓷、金属及其复合材料）的 体外 细胞相容性。研究表明，培养方法会影响细胞对可生物降解材料的反应，因为它们的动态降解会在界面和局部环境中引起时空差异。具体而言，直接培养方法揭示了直接接种在植入物上的细胞的反应;直接暴露培养方法阐明了与植入物接触的已建立宿主细胞的反应;暴露培养方法评估已建立的宿主细胞，这些细胞不与植入物直接接触，但由于植入物降解而受到局部环境变化的影响。

本文提供了这三种培养方法的示例，用于研究可生物降解植入物材料的 体外 细胞相容性及其与骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）的相互作用。它还描述了如何收获，传代，培养，播种，固定，染色，表征细胞以及分析培养后培养基和材料。本文中描述的 体外 方法模拟了 体内 环境的不同场景，拓宽了不同生物材料的 体外 细胞相容性测试对各种生物医学应用的适用性和相关性。

引言

几十年来，可生物降解材料已被广泛研究并用于生物医学应用，如骨科^1，2，牙科^3，4和颅颌面⁵ 应用。与永久性植入物和材料不同，可生物降解的金属，陶瓷，聚合物及其复合材料随着时间的推移，通过生理环境中的不同化学反应在体内逐渐降解。例如，可生物降解的金属，如镁（Mg）合金^1，6，7 和锌（Zn）合金^8，9 是用于骨固定装置的有前途的材料。它们的生物降解性可以消除二次手术在骨愈合后移除植入物的必要性。可生物降解的陶瓷，如磷酸钙水泥（CPC），在治疗经皮后凸成形术中骨质疏松性椎体压缩性骨折方面显示出令人兴奋的潜力¹⁰。CPC为骨折的椎体提供机械支撑，并在骨折愈合后逐渐降解。

可生物降解的聚合物，如一些多糖和聚酯，也被广泛探索用于生物医学应用。例如，壳聚糖水凝胶作为可生物降解的多糖已经显示出其预防感染和再生皮肤组织的能力¹¹。聚L-乳酸（PLLA），聚乙醇酸（PGA）和聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）是被广泛研究的聚酯，用于制造用于组织工程应用的2D或3D多孔支架^12，13，14。此外，复合材料集成了金属、陶瓷和聚合物的两相或两相，为广泛的生物医学应用提供高级功能^15，16，17。例如，PLGA和磷酸钙复合材料可用于制造可生物降解的支架，用于修复颅骨缺陷等应用¹⁸。这些可生物降解的支架和植入物可以支持和促进细胞和组织的生长，然后随着时间的推移在体内逐渐降解。

如 补充表1所示，不同的可生物降解材料可能具有不同的降解机理、产物和速率。例如，镁合金，如Mg-2重量%锌-0.5重量%钙（ZC21）¹，Mg-4重量%锌-1重量%Sr（ZSr41）¹⁹和Mg-9重量%Al-1重量%锌（AZ91）²⁰，通过与水反应降解，其降解产物主要包括^{Mg2 +} 离子，OH^- 离子，_H2 气体和矿物沉积物。可生物降解金属的降解速率根据其不同的成分，几何形状和降解环境而变化。例如，Cipriano等人¹⁹ 报告说，ZSr41线（Ø1.1×15毫米）在植入大鼠胫骨47天后损失了85%的质量，而具有相同几何形状的纯Mg线损失了40%的质量。可生物降解的陶瓷材料，如羟基磷灰石（HA）和β-磷酸三钙（β-TCP），可以通过溶液驱动的细胞外液体溶解降解或分解成小颗粒，然后通过细胞外液体溶解和细胞介导的再吸收过程降解。这些磷酸钙基陶瓷的降解产物可能包括^{Ca2 +} 离子，（_PO4）^3- 离子，OH^- 离子和矿物沉积²¹。磷酸钙陶瓷的降解速率受其晶体结构的显著影响。例如，Van Blitterswijk等人^报告说 ，具有40 vol.%微孔的HA在植入兔子的胫骨3个月后没有失去任何质量，而具有40 vol.%微孔的β-TCP损失了30±4%的质量。诸如^PLGA14，23 的聚合物可能由于酯键在水的存在下水解而降解，降解产物主要包括乳酸和乙醇酸。PLGA 50/50 可能需要一个月的时间，PLGA 95/5 可能需要几个月的时间才能实现完全降级²⁴。

细胞反应和细胞相容性测试对于评估和筛选这些可生物降解的植入材料用于生物医学应用至关重要。然而，国际标准化组织（ISO）的现行标准，如ISO 10993-5:2009"医疗器械的生物学评估 - 体外 细胞毒性测试第5部分"，最初旨在评估不可降解生物材料的细胞毒性，如Ti合金和Cr-Co合金 在体外²⁵。具体而言，ISO 10993-5:2009仅涵盖提取物的 体外 细胞毒性测试，直接接触和间接接触测试。在提取物测试中，通过将样品浸入提取液中，例如在标准时间和温度条件下用血清和生理盐水溶液培养基中的样品来制备提取物。然后将收集的提取物或稀释液加入细胞培养物中以研究细胞毒性。对于直接接触测试，通过将测试样品放在已建立的（粘附的）细胞层上来实现样品与细胞之间的直接接触。在间接接触试验中，将含有血清和融化琼脂的培养基移液以覆盖已建立的细胞。然后将样品放入固化的琼脂层上，有或没有过滤器。

ISO标准在应用于体 外评估可生物降解材料时显示出一些局限性。与不可降解材料不同，可生物降解材料的降解行为是动态的，可以在不同的时间或不同的环境条件（例如，温度、湿度、培养基组成和细胞类型）发生变化。提取物测试仅评估材料降解产物的细胞毒性，不反映样品降解的动态过程。ISO标准的直接和间接接触测试仅表征已建立的细胞和样品之间的相互作用。此外，在间接接触试验中，材料和细胞处于不同的微环境中，不反映 体内 环境，不捕捉可生物降解材料的动态降解。

本文的目的是介绍和讨论各种可生物降解植入材料的细胞相容性测试方法，以解决当前ISO标准中描述的方法的上述局限性。本文提出的方法考虑了植入材料的动态降解行为以及 体内细胞-材料相互作用的不同情况。具体而言，本文提供了三种细胞相容性测试方法，即直接培养，直接暴露培养和各种可生物降解材料的暴露培养，包括用于医疗植入物应用的可生物降解聚合物，陶瓷，金属及其复合材料。

在直接培养方法中，悬浮在培养基中的细胞直接接种在样品上，从而评估新接种的细胞与植入物之间的相互作用。在直接暴露培养物中，将样品直接放置在已建立的细胞层上，以模拟植入物与体内已建立的宿主细胞的相互作用。在暴露培养物中，将样品放置在各自的孔插入物中，然后用已建立的细胞引入培养孔，这表征了当它们不与植入物直接接触时，已建立的细胞对植入物降解引起的局部环境变化的反应。直接培养和直接暴露培养方法评估与同一培养井中的植入材料直接或间接接触的细胞。暴露培养物表征细胞在同一培养井中与植入材料间接接触的规定距离。

本文详细介绍了不同可生物降解材料的细胞相容性测试及其与模型细胞（即骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs））的相互作用。这些方案包括细胞的收获，培养，接种，固定，染色和成像，以及培养后材料和培养基的分析，适用于各种可生物降解的植入材料和各种细胞类型。这些方法可用于筛选不同生物医学应用的可生物降解材料，包括细胞反应和 体外细胞相容性。

研究方案

该协议已获得加州大学河滨分校（UCR）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，用于细胞和组织收获。视频中以一只12周龄的雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠为例。较年轻的雌性和雄性大鼠是首选。

1. 细胞培养制备

注意:本文中描述的三种培养方法通常适用于贴壁的不同细胞类型。在这里，将从大鼠断奶中收获的BMSC作为细胞培养制备的一个例子。根据其与特定医疗应用的相关性，可以使用不同的细胞类型，包括从动物或人类供体中收获的原代细胞以及来自细胞/组织库的细胞系。

1. 从大鼠断奶中收获BMSC
   注: 图1 中的示意图显示了从大鼠断奶中收获BMSC的步骤。
   1. 通过吸入_CO2 对Sprague Dawley（SD）大鼠实施安乐死。
   2. 取出皮肤和肌肉以及结缔组织，将股骨从安乐死的大鼠身上解剖出来。将股骨置于含有细胞培养基的15 mL锥形管（聚丙烯）中。将锥形管放在冰上，直到进行细胞提取。
      注意:胫骨也可用于收获BMSC。细胞培养基是Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM），补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P / S）。
   3. 将骨头转移到生物安全柜中的培养皿中。使用手术刀片切割骨头的末端，并使用带有251/2 G针头的注射器用细胞培养基清洗骨髓腔，将骨髓冲洗到50 mL锥形管（聚丙烯）中。
      注意:将带有18 G针头的注射器插入带有骨髓的培养基中。缓慢而轻柔地，拿起并分配培养基以分解大块骨髓，直到没有可见的细胞/组织附聚物存在。
   4. 使用70μm过滤器过滤细胞悬浮液，然后以126× g （1，000rpm）离心5分钟以获得细胞沉淀。
   5. 吸出上清液培养基，并补充 10 mL 新鲜培养基。使用10 mL血清学移液器轻轻地上下移液以重悬细胞。
   6. 将悬浮液直接移取在T-75烧瓶的内底部，并加入培养基以使体积达到25 mL。在标准无菌细胞培养环境（即37°C，加湿气氛，5%CO ₂ 和95%空气）的培养箱中培养细胞。
   7. 3-7天后，通过吸出旧培养基并用新鲜培养基补充来冲洗掉不粘附的细胞。继续培养并用新鲜培养基喂养细胞，直到它们准备好进行细胞传代，冷冻或用于实验。
2. 电池维护
   1. 定期更换细胞培养基以除去细胞废物并大约每隔一天补充营养物质，直到细胞90%-100%汇合。在90%汇合时，传代，冷冻或在实验中使用细胞。
   2. 传代细胞
      注意:传代，也称为传代培养，是一个术语，适用于细胞从一种培养物转移到另一种培养物。新鲜收获的细胞处于传代阶段0（_P0）。本文中描述的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液（胰蛋白酶-EDTA）和培养基的量适用于T-75烧瓶。
      1. 在光学显微镜下检查细胞，以确认细胞融合90%。
      2. 从细胞烧瓶中吸出培养基。
      3. 使用血清学移液器将 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 分液到烧瓶中。轻轻摇动烧瓶，用PBS冲洗细胞;吸出所有 PBS。
         注意:此步骤可作为额外的冲洗，以确保在传代过程中不会转移死细胞或细胞废物。
      4. 将3mL胰蛋白酶-EDTA分配到细胞烧瓶中，直接分配到细胞表面。轻轻摇动烧瓶，以确保带有细胞的整个表面被胰蛋白酶-EDTA覆盖。
      5. 将装有胰蛋白酶-EDTA的细胞烧瓶放入培养箱5分钟，以使细胞分离。
      6. 在培养箱中5分钟后，在光学显微镜下检查细胞以确认细胞被分离。如果某些细胞尚未分离，请轻轻敲击细胞烧瓶的侧面，然后再次检查烧瓶。
      7. 向细胞烧瓶中加入9mL新鲜培养基以稀释胰蛋白酶-EDTA。这为胰蛋白酶-EDTA提供了更容易获得的蛋白质，使其结合而不是裂解细胞。
      8. 移出培养基中的细胞和胰蛋白酶-EDTA，并将它们分配到15 mL锥形管中。将细胞以126×g（1，000rpm）离心5分钟。
      9. 在不干扰细胞沉淀的情况下，用胰蛋白酶-EDTA吸出培养基。
      10. 向离心管中加入5-10mL新鲜培养基，并使用10mL血清学移液管轻轻重悬培养基中的细胞。
      11. 将悬浮在培养基中的细胞移出离心管，并将体积分成2-3个新鲜培养瓶。加入足够的培养基，使每个烧瓶的总培养基体积达到25 mL。
          注意:传代培养过程中的分裂比例可能因细胞类型和特定生长特征而异。
      12. 在光学显微镜下检查细胞并将其放回培养箱中。
   3. 冷冻细胞
      1. 在光学显微镜下检查细胞，以确认细胞融合90%。
      2. 重复步骤 1.2.2.2 到 1.2.2.9。
      3. 将900μL新鲜培养基加入具有100-1000μL微量移液器的离心管中。使用相同的微量移液器缓慢而轻柔地将细胞重悬于培养基中。
      4. 将900μL细胞悬浮液转移到冷冻管中。加入100μL二甲基亚砜（DMSO）。
      5. 尽快将冷冻管放入旨在调节温度降低的圆柱形泡沫容器中（见 材料表）。将泡沫容器置于-80°C冰箱中。
   4. 解冻细胞
      1. 在水浴中解冻冷冻细胞。取一个充满5 mL新鲜培养基的无菌15 mL锥形管，将细胞置于锥形管中，并以126× g （1，000rpm）离心5分钟。
      2. 吸出含有DMSO的培养基。
      3. 将5-10mL新鲜培养基加入15mL锥形细胞管中。缓慢而轻柔地上下移液以重悬细胞。
      4. 将悬浮在培养基中的细胞从15mL锥形管中移出，然后分配到新的T-75烧瓶中。分配细胞时，使用扫掠动作将细胞尽可能均匀地分布在细胞烧瓶的底部。
      5. 加入足够的新鲜培养基，使每个T-75烧瓶的总培养基体积达到25 mL。
      6. 在光学显微镜下检查细胞，并将细胞瓶放回培养箱中。

2. 样品制备和灭菌

1. 样品制备
   1. 使用组织培养处理的板（如 6、12、24、48 或 96 孔板）进行本文所述的细胞培养实验。根据不同的实验设计（如样品尺寸）选择组织培养板的类型和每个孔中培养基的体积。
2. 在细胞培养前对所有可生物降解的样品进行灭菌或消毒。
   注意:消毒是可以接受的 in vitro 研究样品在某些涉及高温、氧化剂和/或自由基的灭菌条件下容易发生化学和/或表面变化的情况。不同样品类型的灭菌或消毒方法因材料（如聚合物、金属和陶瓷）的不同性质而异。灭菌或消毒过程可能涉及热、气体、辐射、化学品、高压或这些因素的组合。
   1. 可生物降解金属
      1. 通常，使用紫外线（UV）辐射对可生物降解的金属进行消毒 ，以进行体外 研究。
         注:例如，Zhang等人报告说，纯镁（Mg）和ZC21 Mg合金样品在紫外线辐射下消毒4小时，然后才用于细胞研究¹。对于 体内 研究，通常需要对样品进行灭菌。对于许多可生物降解的金属，如镁或镁合金，应避免使用蒸汽高压灭菌，因为这些样品可能会在水中氧化或腐蚀⁶。建议使用石英培养皿进行紫外线消毒，因为它比大多数玻璃和塑料提供更好的紫外线透明度。
      2. 在100-200°C的温度范围内，在烘箱或高压灭菌器中干热灭菌Mg合金样品。
         注意:由于某些金属合金在空气中的高温下仍可能在表面上氧化，因此在某些情况下，可以使用高强度辐射作为替代方案。但是，在对薄金属箔进行灭菌时，应避免高强度辐射，例如α或γ辐射。它可能导致材料内的原子位移，改变材料的微观结构。
      3. 使用环氧乙烷（EtO）气体灭菌作为对热和辐射敏感的可生物降解金属的替代方法²⁶。
   2. 可生物降解陶瓷
      1. 通常， 在体外 研究之前，使用紫外线辐射或70%乙醇溶液对可生物降解的陶瓷进行消毒。
         注意:例如，Liu等人报告说，磷酸钙样品通过浸入70%乙醇中消毒1小时，并在每侧暴露于紫外线下12小时，然后用于 体外 细胞相容性测试²⁷。
      2. 如果高温和水蒸气不会损坏其堆肥和微观结构，请使用高压灭菌器对可生物降解的陶瓷进行灭菌。
         注意:某些陶瓷可能会受到高压灭菌的影响。例如，当钇稳定氧化锆陶瓷在121°C下高压灭菌15分钟时，发现相变和表面粗糙化。此外，CPC不能通过蒸汽高压灭菌进行灭菌，因为样品会与水发生反应。
      3. 对上述钇稳定氧化锆陶瓷和CPC样品使用替代灭菌方法，例如钴-60辐射²⁸。
   3. 可生物降解聚合物
      1. 通常，在 体外细胞研究中使用可生物降解聚合物之前，使用紫外线辐射或70%乙醇对它们进行消毒。
         注意:某些聚合物在紫外线辐射下可能会发生化学变化。对于灭菌，可以使用伽马射线处理，例如钴-60辐射。例如，淀粉粉末在钴-60辐射下灭菌后再用于 体外 细胞研究²⁹。
      2. 可耐高温和潮湿的高压灭菌高分子材料。
         注意:例如，聚丙烯等聚合物可以高温高压灭菌，因为它们可以耐受高压灭菌温度（即121-134°C）。一些聚合物如聚己内酯（PCL）由于其相对较低的熔点（即约60°C）而不能高压灭菌³⁰。
      3. 使用 EtO 气体对对热敏感的聚合物材料进行灭菌或辐射灭菌。

3. 细胞培养方法

1. 直接培养方法
   注: 图2A 中的示意图显示了直接培养方法的步骤。在本文中，将BMSC培养在放置在12孔组织培养处理板的孔内的Mg衍生板上培养，作为示例来说明培养方法。
   1. 按照步骤1.2.2.1-1.2.2.10中描述的步骤获得细胞悬浮液。
   2. 使用90%汇合烧瓶使用血细胞计数器测定细胞悬浮液中的细胞浓度。使用新鲜培养基将细胞悬浮液稀释至 体外细胞研究所需的规定细胞浓度。
      注意:细胞的接种密度由实验设计决定。例如，2，000-40，000个细胞/ cm ² 的细胞密度已用于具有可生物降解材料的不同细胞研究中。
   3. 将样品（Mg板）置于12孔处理的组织培养板的中心。依次用2 mL PBS和2 mL DMEM冲洗培养板，以在无菌条件下校准渗透压。将3mL稀释的细胞悬浮液加入每个孔中，以达到目的样品。
   4. 在标准细胞培养条件下在培养箱中培养细胞24小时。
      注意:培养时间可能长于或短于24小时，具体取决于实验设计。
2. 直接接触培养
   注: 图2B 中的示意图显示了直接暴露培养的步骤。
   1. 如步骤3.1.1和3.1.2中所述，根据不同细胞类型和预期应用的实验设计，制备具有所需细胞浓度的细胞悬浮液。
   2. 依次用2 mL PBS和2 mL DMEM冲洗培养板，以在无菌条件下校准渗透压。将3mL稀释的细胞悬浮液加入每个孔中。在标准细胞培养条件下，在加湿的培养箱中培养细胞24小时或直到细胞达到50-80%汇合。
      注意:细胞汇合水平可能因不同的细胞类型和实验设计而异。
   3. 24小时后，使用移液器用PBS冲洗孔板中的细胞以除去漂浮的死细胞。
   4. 将消毒或灭菌的样品直接放在粘附的细胞上。将3毫升新鲜培养基加入每个孔中。
   5. 在标准细胞培养条件下将细胞再培养24小时。
      注意:培养时间可能长于或短于24小时，具体取决于实验设计。
3. 接触文化
   注: 图2C 中的示意图显示了暴露培养方法的步骤。
   1. 细胞制备的初始步骤与暴露培养相同。如步骤3.1.1和3.1.2中所述，用所需的细胞制备细胞悬浮液。与步骤3.2.1和3.2.2类似，将细胞以所需密度接种在孔板中，并在标准细胞培养条件下在培养箱中培养24小时。
   2. 24小时后，用PBS冲洗贴壁细胞以除去漂浮的死细胞，然后在每个孔中加入3mL新鲜培养基。
   3. 之后，将样品放入膜孔径为0.4μm的孔插入物中，并将与样品一起的孔插入物放入每个孔中。
   4. 在标准细胞培养条件下将细胞再培养24小时。
      注意:培养时间可能长于或短于24小时，具体取决于实验设计。

4. 细胞的培养后表征

注意:对于直接培养和直接暴露培养，固定，染色，成像和分析孔板和样品上的细胞贴壁。对于暴露培养，分析粘附在孔板上的细胞。

1. 细胞固定
   1. 将每个孔中的后培养基收集到相应的15 mL锥形管中以进行进一步分析。培养后收集所有样品以进行进一步分析。
   2. 使用PBS冲洗样品和孔板上贴壁的细胞3次。
   3. 将1mL的4%多聚甲醛（PFA，10%中性缓冲福尔马林）加入每个孔板中。将盖子放回孔板上，让PFA反应20分钟。
   4. 20分钟后，吸出PFA并将其分配到废瓶中。使用PBS冲洗孔板3次以除去PFA，并将废物转移到废物瓶中。
2. 细胞染色
   1. 按照制造商的说明准备染色剂的工作库存。
      注意:例如，Alexa Fluor 488 Phalloidin用于染色F-肌动蛋白，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）用于染色细胞核。如果样品在染色溶液中迅速降解，则可以缩短染色时间。
   2. 向每个孔中加入200-400μL稀释的Alexa Fluor 488 Phalloidin染色剂，以覆盖孔板和样品上的细胞。将孔板包裹在铝箔中以防止光照，并让Alexa Fluor 488 Phalloidin在室温下反应20分钟。
   3. 收集Alexa Fluor 488 Phalloidin染色剂并将其分配到相应的废瓶中。使用PBS冲洗孔板3次，以除去多余的Alexa Fluor 488 Phalloidin，然后将用过的PBS分配到相应的废瓶中。
   4. 向每个孔中加入200-400μL稀释的DAPI，以覆盖孔中和样品上的细胞。将孔板包裹在铝箔中，让DAPI在室温下反应5分钟。
   5. 收集DAPI并将其分配到相应的废瓶中。使用PBS冲洗孔板3次以除去DAPI，然后将用过的PBS分配到相应的废瓶中。
3. 细胞成像
   1. 染色后，使用荧光显微镜对细胞进行成像。只要有可能，除了荧光图像外，还要拍摄细胞的相差图像。在可生物降解样品上尽快或染色后立即对细胞进行成像，以避免或减少样品连续降解引起的可能变化。固定后将细胞储存在2-8°C的缓冲溶液中的孔板中，并在染色后尽快对细胞进行成像，以避免荧光信号的损失。
   2. 对于直接培养和直接暴露培养，对两种类型的细胞进行成像和评估:（1）样品上的细胞（与样品直接接触）和（2）细胞贴附在样品周围的孔板上（与样品间接接触），如图 3A所示。
   3. 对于曝光培养，如图 3B所示，在拍摄细胞荧光图像时使用图像导轨，以确定细胞响应是否响应样品的动态降解梯度而不同。分别对位于内环（距中心3.5毫米）和外环（距中心7毫米）区域内的细胞进行成像和分析。
      注:图像指南用于定义细胞和样品之间的距离。
   4. 对于培养板中的每个样品和孔，从每个感兴趣区域随机取至少五张图像，其中细胞在预定距离内与样品直接接触或间接接触。
4. 图像分析
   1. 对于从步骤4.3获得的所有细胞图像，通过使用用于图像分析的ImageJ等软件测量细胞扩散面积和纵横比来量化细胞形态。
   2. 计算每个图像区域中的单元格数。将直接和间接接触条件下的细胞粘附密度计算为每单位面积的细胞数。

5. 培养基和样品的培养后分析

1. 测量培养后培养基的pH值。
   注意:一些样品在降解过程中会改变培养基的pH值。例如，可生物降解的金属（如镁合金）通常会因其降解而增加介质的pH值³¹。相比之下，可生物降解的聚合物（如PLGA）在降解时通常会降低培养基的pH值³²。测量培养后培养基的pH值可以指示这些样品 在体外降解。
   1. 在细胞固定之前，按照步骤4.1.1收集培养后培养基。
   2. 收集后立即使用预校准的pH计测量每个孔中培养后培养基的pH值。
      注:由于_CO2 水平和温度等环境条件，介质的pH值可能会随时间漂移，应予以考虑。
2. 分析介质成分中可生物降解样品的降解行为。对于某些导致培养基颜色变化的样品，使用分光光度计或酶标仪测量培养后培养基的光密度（O.D.）值，以确定降解行为。或者，使用紫外可见光谱（UV-VIS）和傅里叶变换红外光谱衰减全反射率（FTIR-ATR）来分析培养后培养基中的降解产物。
   注:测量培养后培养基中的降解产物对于了解样品的降解行为很有价值。最常见的方法之一是使用电感耦合等离子体光学发射光谱仪（ICP-OES）测量培养后培养基中感兴趣的离子。ICP-OES可用于测量金属和陶瓷的培养后培养基的成分，但可能不适用于聚合物。聚合物通常由碳，氢和氧组成，ICP-OES很难准确量化这些元素。
   1. 在pH测量的步骤5.1.2之后，使用所需的稀释因子收集和稀释培养基，以最佳测量离子浓度。
   2. 使用ICP-OES测量培养后培养基中目标离子的浓度。
3. 样品的培养后分析
   注意: 体外 细胞研究后，可生物降解样品的尺寸，质量，表面形态，微观结构和组成可能会发生变化。样品的培养后分析有助于了解样品的降解机制。
   1. 细胞培养后，拍摄样品的照片，以显示样品尺寸，颜色，形态和其他可见特征的可能变化。
   2. 干燥或脱水后培养样品，并测量样品质量、尺寸和体积，以量化质量、尺寸和体积的任何变化。
   3. 使用扫描电子显微镜（SEM）表征样品的微观结构和形态。使用能量色散X射线光谱（EDX）和X射线衍射（XRD）来表征样品上降解产物的组成和相。使用FTIR-ATR检测样品表面上的化学键合。

结果

图4 显示了使用不同培养方法在直接和间接接触条件下BMSC的代表性荧光图像。 图4A、B 显示了与ZC21镁合金直接培养24小时后，在直接和间接接触条件下的^BMSC1。ZC21合金由97.5重量%的镁，2重量%的锌和0.5重量%的钙组成。与ZC21合金样品没有直接接触的电池比与样品直接接触的电池扩散得更好。如图 4C

讨论

不同的细胞培养方法可用于评估感兴趣的生物材料的 体外 细胞相容性，用于 体内应用的各个方面。本文演示了三 种体外 培养方法，即直接培养，直接暴露培养和暴露培养，以模拟在人体内使用可生物降解植入材料的不同 体内 场景。直接培养方法主要用于评估新接种的细胞直接贴附在植入材料上并围绕植入材料的行为。直接暴露培养方法模拟 体内 场景，其中?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipette	VWR	490019-704
12-well tissue-culture-treated plates	Thermo Fisher Scientific	353043
15 mL conical tube (Polypropylene)	VWR	89039-666
18 G needle	BD	305196
25½ G needle	BD	305122
4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI)	Invitrogen	D3571
50 mL conical tube (Polypropylene)	VWR	89039-658
70 μm nylon strainer	Fisher Scientific	50-105-0135
Alexa Flour 488-phalloidin	Life technologies	A12379
Biological safety cabinet	LABCONCO	Class II, Type A2
Centrifuge	Eppendorf	Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430
Clear Fused Quartz Round Dish	AdValue Technology	FQ-4085
CO2 incubator	SANYO	MCO-19AIC
CoolCell Freezer Container	Corning	432000	foam container designed to regulate temperature decrease
Cryovial	Thermo Fisher Scientific	5000-1020
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5648
EDX analysis software	Oxford Instruments	AztecSynergy
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX)	FEI	50mm2 X-Max50 SDD
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.	SH30910
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti
Formaldehyde	VWR	100496-496
Hemacytometer	Hausser Scientific	3520
ImageJ software	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)
Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	Optima 8000
Optical microscope	VWR	VistaVision
Penicillin/streptomycin (P/S)	Thermo Fisher Scientific, Inc.,	15070063
pH meter	VWR	model SB70P
Phosphate Buffered Saline (PBS)	VWR	97062-730
Scanning electronic microscope (SEM)	FEI	Nova NanoSEM 450
surgical blade	VWR	76353-728
Tissue Culture Flasks	VWR	T-75, MSPP-90076
Transwell inserts	Corning	3460
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA)	Sigma-Aldrich	T4049
X-ray diffraction instrument (XRD)	PANalytical	Empyrean Series 2