JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы вводим три метода прямого культивирования, культуры прямого воздействия и культуры воздействия для оценки цитосовместимости биоразлагаемых материалов имплантатов in vitro . Эти методы in vitro имитируют различные взаимодействия между клетками и имплантатами in vivo и могут быть применены для изучения различных биоразлагаемых материалов.

Аннотация

За последние несколько десятилетий биоразлагаемые материалы были широко исследованы для биомедицинских применений, таких как ортопедические, стоматологические и черепно-мышечно-лицевые имплантаты. Для скрининга биоразлагаемых материалов для биомедицинских применений необходимо оценить эти материалы с точки зрения клеточных реакций in vitro , цитосовместимости и цитотоксичности. Стандарты Международной организации по стандартизации (ИСО) широко используются при оценке биоматериалов. Однако большинство стандартов ИСО были первоначально установлены для оценки цитотоксичности неразлагаемых материалов, что обеспечивает ограниченную ценность для скрининга биоразлагаемых материалов.

В этой статье представлены и обсуждаются три различных метода культивирования, а именно: метод прямого культивирования, метод культуры прямого воздействия и метод культуры воздействия для оценки цитосовместимости in vitro биоразлагаемых материалов имплантатов, включая биоразлагаемые полимеры, керамику, металлы и их композиты, с различными типами клеток. Исследования показали, что методы культивирования влияют на реакцию клеток на биоразлагаемые материалы, поскольку их динамическая деградация вызывает пространственно-временные различия на границе раздела и в местной среде. В частности, метод прямого культивирования выявляет реакции клеток, посеянных непосредственно на имплантатах; метод культивирования прямого воздействия выявляет реакции установленных клеток-хозяев, вступающих в контакт с имплантатами; и метод культивирования воздействия оценивает установленные клетки-хозяева, которые не находятся в непосредственном контакте с имплантатами, но находятся под влиянием изменений в местной среде из-за деградации имплантата.

В этой статье приведены примеры этих трех методов культивирования для изучения цитосовместимости биоразлагаемых материалов имплантатов in vitro и их взаимодействия с мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга (BMSC). В нем также описывается, как собирать, проходить, культивировать, сеять, фиксировать, окрашивать, характеризовать клетки и анализировать посткультурные среды и материалы. Методы in vitro , описанные в этой статье, имитируют различные сценарии среды in vivo , расширяя применимость и актуальность тестирования цитосовместимости различных биоматериалов in vitro для различных биомедицинских применений.

Введение

На протяжении десятилетий биоразлагаемые материалы широко изучались и использовались в биомедицинских приложениях, таких как ортопедические1,2, стоматологические3,4 и черепно-челюстно-лицевые5. В отличие от постоянных имплантатов и материалов, биоразлагаемые металлы, керамика, полимеры и их композиты постепенно разлагаются в организме с течением времени в результате различных химических реакций в физиологической среде. Например, биоразлагаемые металлы, такие как магниевые (Mg) сплавы1,6,7 и цинковые (Zn) сплавы8,9, являются перспективными материалами для устройств фиксации кости. Их биоразлагаемость может устранить необходимость вторичных операций по удалению имплантатов после заживления кости. Биоразлагаемая керамика, такая как цементы фосфата кальция (CPC), показала захватывающий потенциал для лечения остеопоротических компрессионных переломов позвонков при чрескожной кифопластике10. ЦПК обеспечивают механическую поддержку сломанного тела позвонка и постепенно деградируют после заживления перелома.

Биоразлагаемые полимеры, такие как некоторые полисахариды и полиэфиры, также широко исследовались для биомедицинских применений. Например, гидрогель хитозана как биоразлагаемый полисахарид продемонстрировал свои способности предотвращать инфекцию и регенерировать ткани кожи11. Поли-L-молочная кислота (PLLA), поли(гликолевая кислота) (PGA) и поли(молочная-со-гликолевая кислота) (PLGA) являются широко изученными полиэфирами для изготовления 2D или 3D пористых каркасов для тканевой инженерии12,13,14. Кроме того, композиционные материалы объединяют две или более фаз металлов, керамики и полимеров, чтобы обеспечить расширенные функции для широкого спектра биомедицинских применений15,16,17. Например, композиты PLGA и фосфата кальция могут быть использованы для изготовления биоразлагаемых каркасов для таких применений, как восстановление дефектов костей черепа18. Эти биоразлагаемые каркасы и имплантаты могут поддерживать и стимулировать рост клеток и тканей, а затем постепенно разлагаться в организме с течением времени.

Как показано в Дополнительной таблице 1, различные биоразлагаемые материалы могут иметь различные механизмы деградации, продукты и скорости. Например, магниевые сплавы, такие как Mg-2 мас.% Zn-0,5 мас.% Ca (ZC21)1, Mg-4 мас.% Zn-1 мас.% Sr (ZSr41)19 и Mg-9 мас.% Al-1 мас.% цинка (AZ91)20, разлагаются в результате взаимодействия с водой, и их продукты деградации в основном включают ионы Mg2+, OH-ионы, газ H2 и минеральные осаждения. Скорость деградации биоразлагаемых металлов варьируется в зависимости от их различного состава, геометрии и среды деградации. Например, Cipriano et al.19 сообщили, что провода ZSr41 (Ø1,1 × 15 мм) потеряли 85% массы, в то время как чистые провода Mg с той же геометрией потеряли 40% массы после имплантации в большеберцовую кость крысы в течение 47 дней. Биоразлагаемые керамические материалы, такие как гидроксиапатит (ГК) и β-трикальцийфосфат (β-TCP), могут разлагаться через внеклеточное растворение жидкости или распадаться на мелкие частицы, а затем разлагаться как через внеклеточное жидкое растворение, так и через процессы резорбции, опосредованные клетками. Продукты разложения этих керамических изделий на основе фосфата кальция могут включать ионы Ca2+, (PO4)3-ионы, OH-ионы и минеральные осаждения21. Скорость деградации керамики фосфата кальция значительно зависит от ее кристаллической структуры. Например, Van Blitterswijk et al.22 сообщили, что ГК с 40 об.% микропор не теряла массы, в то время как β-TCP с 40 об.% микропор потерял 30 ± 4% массы после имплантации в большеберцовые кости кроликов в течение 3 месяцев. Полимеры, такие как PLGA14,23, могут разлагаться из-за гидролиза эфирных связей в присутствии воды, а продукты разложения в основном включают молочную и гликолевую кислоты. Для достижения полной деградации PLGA 50/50 может потребоваться один месяц, а для PLGA 95/5 - несколько месяцев24.

Клеточный ответ и тестирование цитосовместимости имеют решающее значение для оценки и скрининга этих биоразлагаемых материалов имплантатов для биомедицинских применений. Однако текущие стандарты Международной организации по стандартизации (ISO), такие как ISO 10993-5:2009 «Биологическая оценка медицинских устройств - Часть 5 Тесты на цитотоксичность in vitro», изначально были разработаны для оценки цитотоксичности неразлагаемых биоматериалов, таких как ti-сплавы и сплавы Cr-Co in vitro25. В частности, ISO 10993-5:2009 охватывает только тесты на цитотоксичность экстракта in vitro, тесты на прямой контакт и косвенный контакт. В тесте экстракта экстракт получают путем погружения образцов в экстракционные жидкости, такие как питательные среды с сывороткой и физиологические солевые растворы в одном из стандартных временных и температурных условий. Собранный экстракт или разбавление затем добавляют в культуру клеток для изучения цитотоксичности. Для испытания на прямой контакт прямой контакт между образцом и клетками достигается путем помещения испытуемого образца на установленный (приклеенный) клеточный слой. В тесте на косвенный контакт культуральная среда, содержащая сыворотку и расплавленный агар, пипетируется для покрытия установленных клеток. Затем образец помещают на затвердевший слой агара с фильтром или без него.

Стандарты ИСО показали некоторые ограничения при применении для оценки биоразлагаемых материалов in vitro. В отличие от неразлагаемых материалов, поведение деградации биоразлагаемых материалов является динамическим и может изменяться в разное время или в различных условиях окружающей среды (например, температура, влажность, состав среды и тип ячейки). Тест экстракта оценивает только цитотоксичность продуктов разложения материала и не отражает динамический процесс деградации образца. Как прямые, так и косвенные контактные тесты стандарта ISO характеризуют только взаимодействия между установленными ячейками и образцами. Кроме того, при испытании на косвенный контакт материалы и клетки находятся в различных микросредах, которые не отражают среду in vivo и не улавливают динамическую деградацию биоразлагаемых материалов.

Целью данной статьи является представление и обсуждение методов тестирования цитосовместимости для различных биоразлагаемых материалов имплантатов для устранения вышеупомянутых ограничений методов, описанных в текущих стандартах ISO. Методы, представленные в данной статье, учитывают динамическое деградационное поведение материалов имплантатов и различные обстоятельства взаимодействия клеток и материалов in vivo. В частности, в этой статье представлены три метода тестирования цитосовместимости, а именно прямая культура, культура прямого воздействия и культура воздействия для различных биоразлагаемых материалов, включая биоразлагаемые полимеры, керамику, металлы и их композиты для применения в медицинских имплантатах.

В методе прямого культивирования клетки, взвешенные в культуральной среде, непосредственно засеивают на образцы, тем самым оценивая взаимодействие между вновь засеянными клетками и имплантатами. В культуре прямого воздействия образцы помещаются непосредственно на установленный клеточный слой, чтобы имитировать взаимодействие имплантатов с установленными клетками-хозяевами в организме. В культуре воздействия образцы помещают в соответствующие вкладыши колодца, а затем вводят в культуральные колодцы с установленными клетками, что характеризует реакцию установленных клеток на изменения в местной среде, вызванные деградацией имплантата, когда они не имеют прямого контакта с имплантатами. Методы культуры прямого и прямого воздействия оценивают клетки, прямо или косвенно контактирующие с материалами имплантата в той же культуре. Экспозиционная культура характеризует клетки, косвенно контактирующие с материалами имплантата в пределах предписанного расстояния в той же культуре.

В данной статье представлено подробное описание тестирования цитосовместимости различных биоразлагаемых материалов и их взаимодействия с модельными клетками, то есть мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга (BMSC). Протоколы включают сбор, культивирование, посев, фиксацию, окрашивание и визуализацию клеток, а также анализы посткультурных материалов и сред, которые применяются к различным биоразлагаемым материалам имплантатов и широкому спектру типов клеток. Эти методы полезны для скрининга биоразлагаемых материалов для различных биомедицинских применений с точки зрения клеточных реакций и цитосовместимости in vitro.

протокол

Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Калифорнийском университете в Риверсайде (UCR) для сбора клеток и тканей. 12-недельная самка крысы Sprague-Dawley (SD) показана в качестве примера в видео. Предпочтение отдается более молодым самкам и самцам крыс.

1. Подготовка клеточной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Три метода культивирования, описанные в этой статье, обычно применимы для различных типов клеток, которые являются адгезивными. Здесь в качестве примера для приготовления клеточных культур будут введены BMSC, собранные из крысиных отъемов. В зависимости от их актуальности для конкретных медицинских применений могут использоваться различные типы клеток, включая первичные клетки, собранные у животных или доноров человека, и клеточные линии из банка клеток / тканей.

  1. Сбор BMSC из крысиных отъемов
    ПРИМЕЧАНИЕ: На принципиальной диаграмме на рисунке 1 показаны шаги по сбору BMSC из крысиных отъемов.
    1. Усыплите крысу Sprague Dawley (SD) путем вдыхания CO2 .
    2. Удалите кожу, мышечные и соединительные ткани, чтобы рассечь бедренную кость от усыпленной крысы. Поместите бедренные кости в коническую трубку (полипропилен) объемом 15 мл, содержащую питательную среду. Поместите конические трубки на лед до момента выполнения извлечения клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большеберцовая кость также может быть использована для сбора BMSC. Клеточная культуральная среда представляет собой модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином / стрептомицином (P / S).
    3. Переложите кости на чашку Петри в шкаф биологической безопасности. Отрежьте концы кости хирургическим лезвием и промойте костный мозг в коническую трубку объемом 50 мл (полипропилен), промыв полость костного мозга клеточной культуральной средой с помощью шприца с иглой 251/2 г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте шприц с иглой 18 г в среду с костным мозгом. Медленно и осторожно возьмите и распределите среду, чтобы разбить большой кусок костного мозга, пока не появятся видимые клеточные / тканевые агломераты.
    4. Фильтруйте клеточную суспензию с помощью фильтра 70 мкм с последующим центрифугированием при 126 × г (1000 об/мин) в течение 5 мин для получения гранул ячейки.
    5. Аспирируйте надосадочную среду и пополняйте 10 мл свежих сред. Аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать клетки, используя серологическую пипетку 10 мл.
    6. Пипетка суспензии непосредственно на внутреннюю нижнюю часть колбы Т-75 и добавление среды для доведения объема до 25 мл. Культивируйте клетки в инкубаторе в стандартной стерильной среде клеточной культуры (т.е. 37 °C, увлажненная атмосфера с 5% CO2 и 95% воздуха).
    7. Через 3-7 дней смойте неприлипшие клетки, аспирируя старую среду и пополняя ее свежей средой. Продолжайте культивировать и кормить клетки свежей средой, пока они не будут готовы к прохождению клеток, замораживанию или использованию в эксперименте.
  2. Обслуживание ячеек
    1. Регулярно меняйте среду клеточной культуры, чтобы удалить клеточные отходы и восполнять питательные вещества примерно через день, пока клетки не станут на 90%-100% сливающимися. При 90% слиянии проходите, замораживайте или используйте клетки в эксперименте.
    2. Пасующие ячейки
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пассаж, также называемый субкультурой, является термином, который применяется всякий раз, когда клетки переносятся из одной культуры в другую. Свежесобранные клетки находятся на стадии прохождения 0 (P0). Количество раствора трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (трипсин-ЭДТА) и сред, описанных в этой статье, предназначено для колбы Т-75.
      1. Проверьте клетки под оптическим микроскопом, чтобы подтвердить, что клетки на 90% сливаются.
      2. Аспирируйте среду из клеточной колбы.
      3. Дозируйте 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в колбу с помощью серологической пипетки. Аккуратно покачайте колбу, чтобы промыть клетки PBS; аспирировать все PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг служит дополнительным ополаскиванием, чтобы гарантировать, что мертвые клетки или клеточные отходы не будут перенесены во время прохождения.
      4. Дозируйте 3 мл трипсина-ЭДТА в клеточную колбу непосредственно на поверхность клеток. Аккуратно раскачайте колбу, чтобы вся поверхность с клетками была покрыта трипсином-ЭДТА.
      5. Поместите клеточную колбу с трипсином-ЭДТА в инкубатор на 5 минут, чтобы клетки отсоединились.
      6. Через 5 минут в инкубаторе проверьте клетки под оптическим микроскопом, чтобы подтвердить, что клетки отсоединены. Если некоторые ячейки не отсоединились, осторожно постучите по боковой стороне колбы клетки и снова проверьте колбу.
      7. Добавьте 9 мл свежей среды в клеточную колбу, чтобы разбавить трипсин-ЭДТА. Это обеспечивает более доступные белки для трипсина-ЭДТА для связывания с клетками, а не для лизирования клеток.
      8. Пипетка выводит клетки в средах и трипсин-ЭДТА и дозирует их в коническую трубку объемом 15 мл. Центрифугирование ячеек при 126 × г (1000 об/мин) в течение 5 мин.
      9. Не нарушая клеточную гранулу, аспирировать среду трипсином-ЭДТА.
      10. Добавьте 5-10 мл свежей среды в трубку центрифуги и осторожно повторно суспендируйте клетки в среде, используя серологическую пипетку объемом 10 мл.
      11. Пипетку клеток суспендируют в среде из трубки центрифуги и расщепляют объем на 2-3 свежие культуральные колбы. Добавьте достаточное количество среды, чтобы довести общий объем среды до 25 мл для каждой колбы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент расщепления во время субкультуры может варьироваться в зависимости от типов клеток и конкретных характеристик роста.
      12. Проверьте клетки под оптическим микроскопом и поместите их обратно в инкубатор.
    3. Замораживание клеток
      1. Проверьте клетки под оптическим микроскопом, чтобы подтвердить, что клетки на 90% сливаются.
      2. Повторите шаги 1.2.2.2-1.2.2.9.
      3. Добавьте 900 мкл свежей среды в трубку центрифуги с помощью микропипетки объемом 100-1000 мкл. Медленно и осторожно повторно суспендируйте клетки в среде, используя ту же микропипетку.
      4. Переведите 900 мкл клеточной суспензии в криовиальную. Добавьте 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
      5. Как можно скорее поместите криовиал в цилиндрический пенопластовый контейнер, предназначенный для регулирования снижения температуры (см. Таблицу материалов). Поместите пенопластовый контейнер в морозильную камеру при температуре -80 °C.
    4. Оттаивающие ячейки
      1. Разморозьте замороженные клетки на водяной бане. Возьмите стерильную коническую трубку объемом 15 мл, заполненную 5 мл свежей среды, поместите клетки в коническую трубку и центрифугируйте при 126 × г (1000 об/мин) в течение 5 мин.
      2. Аспирировать среду, содержащую ДМСО.
      3. Добавьте 5-10 мл свежей среды в коническую трубку клеток объемом 15 мл. Медленно и осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать клетки.
      4. Пипетки клеток суспендируют в среде из конической трубки объемом 15 мл и дозируют в новую колбу Т-75. При дозировании клеток используйте размашистое движение, чтобы распределить ячейки как можно более равномерно на дне колбы клетки.
      5. Добавьте достаточно свежей среды, чтобы довести общий объем среды до 25 мл для каждой колбы Т-75.
      6. Проверьте клетки под оптическим микроскопом и поместите клеточную колбу обратно в инкубатор.

2. Пробоподготовка и стерилизация

  1. Пробоподготовка
    1. Используйте обработанные тканевыми культурами пластины, такие как пластины с 6, 12, 24, 48 или 96 лунками, для экспериментов с клеточными культурами, описанных в этой статье. Выберите тип пластин тканевой культуры и объем среды в каждой скважине на основе различных экспериментальных конструкций, таких как размер образца.
  2. Стерилизуйте или дезинфицируйте все биоразлагаемые образцы перед посевом клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дезинфекция приемлема для in vitro исследования, когда образцы подвержены химическим и/или поверхностным изменениям при некоторых условиях стерилизации, связанных с высокой температурой, окислителем и/или радикалами. Методы стерилизации или дезинфекции для различных типов образцов варьируются в зависимости от различных свойств материалов, таких как полимеры, металлы и керамика. Процесс стерилизации или дезинфекции может включать тепло, газ, радиацию, химические вещества, высокое давление или их комбинацию.
    1. Биоразлагаемые металлы
      1. В целом, используйте ультрафиолетовое (УФ) излучение для дезинфекции биоразлагаемых металлов для исследований in vitro .
        ПРИМЕЧАНИЕ: Например, Zhang et al. сообщили, что образцы сплава чистого магния (Mg) и ZC21 Mg дезинфицировали под воздействием ультрафиолетового излучения в течение 4 ч, прежде чем они были использованы в клеточных исследованиях1. Для исследований in vivo образцы, как правило, должны быть стерилизованы. Для многих биоразлагаемых металлов, таких как магний или магниевые сплавы, следует избегать автоклавирования с использованием пара, поскольку эти образцы могут быть окислены или корродированы в воде6. Кварцевая посуда рекомендуется для УФ-дезинфекции, потому что она обеспечивает лучшую прозрачность УФ-излучения, чем большинство стаканов и пластмасс.
      2. Стерилизуйте образцы сплава Mg под сухим нагревом в печи или автоклаве в диапазоне температур 100-200 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку некоторые металлические сплавы все еще могут окисляться на поверхности при высоких температурах в воздухе, в некоторых случаях в качестве альтернативы может использоваться высокоинтенсивное излучение. Тем не менее, следует избегать излучения высокой интенсивности, такого как альфа- или гамма-излучение, при стерилизации тонкой металлической фольги. Это может вызвать смещение атомов внутри материалов, изменяя микроструктуру материалов.
      3. Используйте газовую стерилизацию этиленоксидом (EtO) в качестве альтернативного метода для биоразлагаемых металлов, чувствительных к теплу и излучению26.
    2. Биоразлагаемая керамика
      1. Как правило, дезинфицируют биоразлагаемую керамику с использованием УФ-излучения или 70% раствора этанола перед исследованиями in vitro .
        ПРИМЕЧАНИЕ: Например, Liu et al. сообщили, что образцы фосфата кальция дезинфицировали путем погружения в 70% этанола в течение 1 ч и воздействия ультрафиолетового света в течение 12 ч с каждой стороны, прежде чем они были использованы в тестах на цитосовместимость in vitro27.
      2. Используйте автоклавы для стерилизации биоразлагаемой керамики, если высокая температура и водяной пар не повреждают их компостирование и микроструктуры.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые керамические изделия могут быть затронуты автоклавированием. Например, фазовое изменение и шероховатость поверхности были обнаружены, когда стабилизированную иттрией керамику циркония автоклавировали при 121 °C в течение 15 мин. Кроме того, CPC не могут быть стерилизованы с помощью автоклавирования паром, потому что образцы будут реагировать с водой.
      3. Используйте альтернативные методы стерилизации, такие как излучение кобальта-60 для вышеупомянутой циркониевой керамики, стабилизированной иттрией, и образцов CPC28.
    3. Биоразлагаемые полимеры
      1. В общем, дезинфицируйте биоразлагаемые полимеры, используя ультрафиолетовое излучение или 70% этанол, прежде чем использовать их в клеточных исследованиях in vitro.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые полимеры могут подвергаться химическим изменениям под воздействием ультрафиолетового излучения. Для стерилизации может использоваться гамма-обработка, такая как излучение кобальта-60. Например, крахмальные порошки были стерилизованы под воздействием излучения кобальта-60, прежде чем их использовали в исследованиях клеток in vitro29.
      2. Автоклавные полимерные материалы, способные выдерживать высокую температуру и влажность.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Например, полимеры, такие как полипропилен, могут быть автоклавированы, поскольку они могут переносить температуру автоклавирования (т.е. 121-134 °C). Некоторые полимеры, такие как поликапролактон (PCL), не могут быть автоклавированы из-за их относительно низкой температуры плавления (т.е. около 60 °C)30.
      3. Используйте газ EtO для стерилизации полимерных материалов, чувствительных к нагреванию или радиационной стерилизации.

3. Методы культивирования клеток

  1. Методы прямого культивирования
    ПРИМЕЧАНИЕ: На принципиальной схеме на рисунке 2A показаны этапы метода прямого языка и региональных параметров. В этой статье BMSC культивировали на пластине, полученной из Mg, помещенной внутри скважин 12-луночной пластины, обработанной культурой ткани, в качестве примера для иллюстрации метода культивирования.
    1. Для получения суспензии ячейки выполните действия, описанные в этапах 1.2.2.1-1.2.2.10.
    2. Используйте 90% сливающуюся колбу для определения концентрации клеток в клеточной суспензии с помощью гемоцитометра. Разбавьте клеточную суспензию, используя свежую среду, до предписанной концентрации клеток, необходимой для исследования клеток in vitro.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность высева клеток определяется экспериментальной конструкцией. Например, плотность клеток 2000-40000 клеток/ см2 использовалась в различных исследованиях клеток с биоразлагаемыми материалами.
    3. Поместите образцы (Mg пластинку) в центр 12 хорошо обработанных тканевых культуральных пластин. Последовательно промывайте культуральные пластины 2 мл PBS и 2 мл DMEM для калибровки осмотического давления в стерильных условиях. Добавьте 3 мл разбавленной клеточной суспензии в каждую лунку на интересующие образцы.
    4. Культивируйте клетки в инкубаторе в стандартных условиях культивирования клеток в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время культивирования может быть длиннее или короче 24 ч в зависимости от экспериментальной конструкции.
  2. Культуры прямого воздействия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Принципиальная схема на рисунке 2B показывает этапы культуры прямого воздействия.
    1. Как описано на этапах 3.1.1 и 3.1.2, готовят клеточную суспензию с требуемыми концентрациями клеток на основе экспериментальной конструкции для различных типов клеток и предполагаемых применений.
    2. Промывайте культуральные пластины 2 мл PBS и 2 мл DMEM последовательно, чтобы откалибровать осмотическое давление в стерильных условиях. Добавьте 3 мл разбавленной клеточной суспензии в каждую лунку. Культивируйте клетки в увлажненном инкубаторе в стандартных условиях клеточной культуры в течение 24 ч или до тех пор, пока клетки не достигнут 50-80% слияния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень слияния клеток может варьироваться для различных типов клеток и экспериментальной конструкции.
    3. Через 24 ч промыть ячейки в пластине скважины PBS с помощью пипетки для удаления плавающих мертвых клеток.
    4. Поместите продезинфицированные или стерилизованные образцы непосредственно на приклеенные клетки. Добавьте в каждую лунку 3 мл свежей среды.
    5. Культивируйте клетки в стандартных условиях клеточной культуры еще 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время культивирования может быть длиннее или короче 24 ч в зависимости от экспериментальной конструкции.
  3. Экспозиционные культуры
    ПРИМЕЧАНИЕ: Принципиальная схема на рисунке 2C показывает этапы метода культуры воздействия.
    1. Начальные этапы подготовки клеток такие же, как и экспозиция культуры. Как описано на этапах 3.1.1 и 3.1.2, подготовьте суспензию ячейки с желаемыми ячейками. Аналогично этапам 3.2.1 и 3.2.2, засеять клетки в пластине скважины при желаемой плотности и культивировать их в инкубаторе в стандартных условиях клеточной культуры в течение 24 ч.
    2. Через 24 ч промыть адгезивные клетки PBS для удаления плавающих мертвых клеток с последующим добавлением 3 мл свежей среды в каждую лунку.
    3. После этого поместите образцы в скважинные вставки с размером мембранных пор 0,4 мкм и поместите вкладыши скважины с образцами в каждую скважину с ячейками.
    4. Культивируйте клетки в стандартных условиях клеточной культуры еще 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время культивирования может быть длиннее или короче 24 ч в зависимости от экспериментальной конструкции.

4. Посткультурная характеристика клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Для прямой культуры и культуры прямого воздействия фиксируйте, окрашивайте, изображайте и анализируйте клетки, прикрепленные как на пластинах скважин, так и на образцах. Для экспозиции культуры анализируют клетки, приклеенные к пластинам колодца.

  1. Фиксация клеток
    1. Соберите посткультурную среду из каждой скважины в соответствующую коническую трубку объемом 15 мл для дальнейшего анализа. Соберите все образцы после посева для дальнейшего анализа.
    2. Промыть клетки, прилипшие как к образцам, так и к пластинам колодца 3 раза с помощью PBS.
    3. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида (PFA, 10% нейтрального буферизованного формалина) в каждую пластину скважины. Положите крышку обратно на пластину колодца и дайте PFA вступить в реакцию в течение 20 минут.
    4. Через 20 мин аспирируйте PFA и раздайте его в бутылку для отходов. Промойте пластину колодца 3 раза, используя PBS, чтобы удалить PFA, и перенесите отходы в бутылку для отходов.
  2. Окрашивание клеток
    1. Подготовьте рабочие запасы окрашивающих агентов в соответствии с инструкциями производителей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, Alexa Fluor 488 Фаллоидин используется для окрашивания F-актина, а 4', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) используется для окрашивания ядер клеток. Время окрашивания может быть сокращено, если образцы быстро разлагаются в окрашивающих растворах.
    2. Добавьте 200-400 мкл разбавленного красителя Alexa Fluor 488 Phalloidin в каждую лунку, чтобы покрыть клетки на пластине скважины и образец. Оберните пластину колодца в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить воздействие света, и позвольте фаллоидину Alexa Fluor 488 реагировать в течение 20 минут при комнатной температуре.
    3. Соберите краситель Alexa Fluor 488 Phalloidin и поместите его в соответствующую бутылку для отходов. Промойте пластину колодца 3 раза, используя PBS, чтобы удалить избыток фаллоидина Alexa Fluor 488, и распределите использованный PBS в соответствующую бутылку для отходов.
    4. Добавьте 200-400 мкл разбавленного DAPI в каждую скважину, чтобы покрыть клетки в скважине и на образце. Оберните пластину скважины в алюминиевую фольгу и дайте DAPI вступить в реакцию в течение 5 минут при комнатной температуре.
    5. Соберите DAPI и раздайте его в соответствующую бутылку для отходов. Промойте пластину колодца 3 раза, используя PBS, чтобы удалить DAPI, и распределите использованный PBS в соответствующую бутылку для отходов.
  3. Визуализация клеток
    1. После окрашивания визуализируйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа. По возможности делайте фазоконтрастные изображения клеток в дополнение к флуоресцентным изображениям. Визуализируйте клетки на биоразлагаемых образцах как можно скорее или сразу после окрашивания, чтобы избежать или уменьшить возможные изменения, вызванные непрерывной деградацией образцов. Храните ячейки в пластинах скважины в буферном растворе при 2-8 °C после фиксации и визуализируйте ячейки как можно скорее после окрашивания, чтобы избежать потери флуоресцентных сигналов.
    2. Для непосредственного культивирования и культуры прямого воздействия изобразите и оцените два типа клеток: (1) клетки на образцах (в непосредственном контакте с образцами) и (2) клетки, прилипшие к пластине скважины, окружающей образцы (косвенный контакт с образцами), как показано на рисунке 3A.
    3. Для культуры экспозиции, как показано на рисунке 3B, используйте руководство по изображению при взятии флуоресцентных изображений клеток, чтобы определить, будет ли реакция клеток отличаться в ответ на динамический градиент деградации образцов. Изобразите и проанализируйте ячейки, расположенные в области внутри внутреннего кольца (3,5 мм от центра) и наружного кольца (7 мм от центра) отдельно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Руководство по изображению используется для определения расстояния между ячейками и образцами.
    4. Для каждого образца и скважины в культуральных пластинах случайным образом сделайте по меньшей мере пять изображений из каждой интересующей области, где клетки находятся либо в прямом контакте, либо в косвенном контакте с образцами на заранее определенном расстоянии.
  4. Анализ изображений
    1. Для всех изображений клеток, полученных на этапе 4.3, количественно оцените морфологию ячейки, измерив площадь распространения ячеек и соотношение сторон с помощью программного обеспечения, такого как ImageJ для анализа изображений.
    2. Подсчитайте количество ячеек в каждой области изображения. Рассчитайте плотность адгезии ячеек в условиях прямого и косвенного контакта как количество ячеек на единицу площади.

5. Посткультурный анализ медиа и образцов

  1. Измерьте рН посткультурной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые образцы изменяют значение рН среды во время их деградации. Например, биоразлагаемые металлы, такие как магниевые сплавы, обычно увеличивают значение рН среды из-за их деградации31. Напротив, биоразлагаемые полимеры, такие как PLGA, часто снижают значение рН среды, когда они разлагаются32. Измерение значения рН посткультурной среды может указывать на деградацию этих образцов in vitro.
    1. Перед фиксацией клеток соберите посткультурную среду, как показано на этапе 4.1.1.
    2. Измерьте значения pH посткультурной среды в каждой скважине сразу после сбора, используя предварительно калиброванный рН-метр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: pH сред может дрейфовать с течением времени из-за условий окружающей среды, таких как уровень CO2 и температура, которые следует принимать во внимание.
  2. Анализ композиций среды на предмет деградационного поведения биоразлагаемых образцов. Для некоторых образцов, которые вызывают изменение цвета среды, измерьте значение оптической плотности (O.D.) посткультурной среды с помощью спектрофотометра или считывателя микропластин для определения поведения деградации. В качестве альтернативы, используйте ультрафиолетово-видимую спектроскопию (UV-VIS) и инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье с ослабленным полным отражением (FTIR-ATR) для анализа продуктов деградации в посткультурной среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение продуктов разложения в посткультурной среде ценно для понимания деградационного поведения образцов. Одним из наиболее распространенных подходов является измерение ионов, представляющих интерес в посткультурной среде, с использованием индуктивно связанного плазменно-оптического эмиссионного спектрометра (ICP-OES). ICP-OES может использоваться для измерения композиций посткультурной среды металлов и керамики, но может не подходить для полимеров. Полимеры обычно состоят из углерода, водорода и кислорода, и точная количественная оценка этих элементов затруднена для ICP-OES.
    1. Следуя этапу 5.1.2 для измерения pH, соберите и разбавьте среду с использованием желательного коэффициента разрежения для оптимальных измерений концентраций ионов.
    2. Измерьте концентрации интересующих ионов в посткультурной среде с помощью ICP-OES.
  3. Посткультурный анализ образцов
    ПРИМЕЧАНИЕ: После исследования клеток in vitro биоразлагаемые образцы могут изменяться по размеру, массе, морфологии поверхности, микроструктуре и составу. Посткультурный анализ образцов помогает понять механизм деградации образцов.
    1. После культивирования клеток сделайте фотографии образцов, чтобы показать возможные изменения в размерах образца, цвете, морфологии и других видимых характеристиках.
    2. Высушите или обезвоживание образцов посткультуры и измерьте массу, размер и объем образца для количественной оценки любых изменений в массе, размерах и объеме.
    3. Используйте сканирующий электронный микроскоп (SEM) для характеристики микроструктуры и морфологии образцов. Используйте энергодисперсионную рентгеновскую спектроскопию (EDX) и рентгеновскую дифракцию (XRD) для характеристики состава и фазы продуктов деградации на образцах. Используйте FTIR-ATR для обнаружения химической связи на поверхностях образцов.

Результаты

На рисунке 4 показаны репрезентативные флуоресцентные изображения BMSC в условиях прямого и косвенного контакта с использованием различных методов культивирования. На рисунке 4A,B показаны BMSC в условиях прямого и косвенного контакта после той же ...

Обсуждение

Различные методы культивирования клеток могут быть использованы для оценки цитосовместимости биоматериалов in vitro , представляющих интерес для различных аспектов применения in vivo. В этой статье демонстрируются три метода культивирования in vitro , то есть прямая культура, ку?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы высоко оценивают финансовую поддержку со стороны Национального научного фонда США (NSF CBET award 1512764 и NSF PIRE 1545852), Национальных институтов здравоохранения (NIH NIDCR 1R03DE028631), стипендии регентов Калифорнийского университета (UC) и Комитета по исследовательскому гранту семян (Huinan Liu) и гранта UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Авторы высоко оценивают Центральный центр передовой микроскопии и микроанализа (CFAMM) в Калифорнийском университете в Риверсайде за использование SEM / EDS и доктора Перри Чунга за использование инструментов XRD. Авторы также ценят Thanh Vy Nguyen и Queenie Xu за частичное редактирование. Авторы также хотели бы поблагодарить Синди Ли за запись повествования для видео. Любые мнения, выводы и выводы, выраженные в этой статье, являются мнениями авторов и не обязательно отражают взгляды Национального научного фонда или Национальных институтов здравоохранения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL serological pipetteVWR490019-704
12-well tissue-culture-treated platesThermo Fisher Scientific353043
15 mL conical tube (Polypropylene)VWR89039-666
18 G needleBD305196
25½ G needleBD305122
4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI)InvitrogenD3571
50 mL conical tube (Polypropylene)VWR89039-658
70 μm nylon strainerFisher Scientific50-105-0135
Alexa Flour 488-phalloidinLife technologiesA12379
Biological safety cabinetLABCONCOClass II, Type A2
CentrifugeEppendorfRotor F-35-6-30, Centrifuge5430
Clear Fused Quartz Round DishAdValue TechnologyFQ-4085
CO2 incubatorSANYOMCO-19AIC
CoolCell Freezer ContainerCorning432000foam container designed to regulate temperature decrease
CryovialThermo Fisher Scientific5000-1020
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5648
EDX analysis softwareOxford InstrumentsAztecSynergy
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX)FEI50mm2 X-Max50 SDD
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.SH30910
Fluorescence microscopeNikonEclipse Ti
FormaldehydeVWR100496-496
HemacytometerHausser Scientific3520
ImageJ softwareNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)
Inductively coupled plasma
optical emission spectrometry (ICP-OES)		PerkinElmerOptima 8000
Optical microscopeVWRVistaVision
Penicillin/streptomycin (P/S)Thermo Fisher Scientific, Inc.,15070063
pH meterVWRmodel SB70P
Phosphate Buffered Saline (PBS)VWR97062-730
Scanning electronic microscope (SEM)FEINova NanoSEM 450
surgical bladeVWR76353-728
Tissue Culture FlasksVWRT-75, MSPP-90076
Transwell insertsCorning3460
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA)Sigma-AldrichT4049
X-ray diffraction instrument (XRD)PANalyticalEmpyrean Series 2

Ссылки

  1. Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
  2. Xu, C., et al. A green biocompatible fabrication of highly porous functional ceramics with high strength and controllable pore structures. Journal of Materials Science & Technology. 32 (8), 729-732 (2016).
  3. Asgari, M., et al. Biodegradable metallic wires in dental and orthopedic applications: a review. Metals. 8 (4), 212 (2018).
  4. Shi, Y., Liu, J., Yu, L., Zhong, L. Z., Jiang, H. B. β-TCP scaffold coated with PCL as biodegradable materials for dental applications. Ceramics International. 44 (13), 15086-15091 (2018).
  5. Wu, C. -. C., et al. A self-reinforcing biodegradable implant made of poly (ɛ-caprolactone)/calcium phosphate ceramic composite for craniomaxillofacial fracture fixation. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery. 44 (9), 1333-1341 (2016).
  6. Jiang, W., et al. In vitro evaluation of MgSr and MgCaSr alloys via direct culture with bone marrow derived mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 72, 407-423 (2018).
  7. Zhang, C., et al. Magnesium-based biodegradable microelectrodes for neural recording. Materials Science and Engineering: C. 110, 110614 (2020).
  8. Jia, B., et al. In vitro and in vivo studies of Zn-Mn biodegradable metals designed for orthopedic applications. Acta Biomaterialia. 108, 358-372 (2020).
  9. Yang, H., et al. Alloying design of biodegradable zinc as promising bone implants for load-bearing applications. Nature Communications. 11 (1), 1-16 (2020).
  10. Liu, H., et al. Injectable, biomechanically robust, biodegradable and osseointegrative bone cement for percutaneous kyphoplasty and vertebroplasty. International Orthopaedics. 42 (1), 125-132 (2018).
  11. Anjum, S., Arora, A., Alam, M., Gupta, B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. International Journal of Pharmaceutics. 508 (1-2), 92-101 (2016).
  12. Barroca, N., et al. Electrically polarized PLLA nanofibers as neural tissue engineering scaffolds with improved neuritogenesis. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167, 93-103 (2018).
  13. Liu, Y., et al. Polydopamine-modified poly (l-lactic acid) nanofiber scaffolds immobilized with an osteogenic growth peptide for bone tissue regeneration. RSC Advances. 9 (21), 11722-11736 (2019).
  14. Liu, H., Webster, T. J. Enhanced biological and mechanical properties of well-dispersed nanophase ceramics in polymer composites: from 2D to 3D printed structures. Materials Science and Engineering: C. 31 (2), 77-89 (2011).
  15. Xu, C., et al. Bioinspired mechano-sensitive macroporous ceramic sponge for logical drug and cell delivery. Advanced Science. 4 (6), 1600410 (2017).
  16. Xu, C., Bai, Y., Yang, H., Yang, L. Mechanically modulated, ultra-high precision logic delivery of molecules by bio-inspired macroporous ceramic sponge. MRS Advances. 2 (19-20), 1125-1130 (2017).
  17. Zhang, N., Xu, C., Azer, A., Liu, H. Dispersibility and characterization of polyvinyl alcohol-coated magnetic nanoparticles in poly (glycerol sebacate) for biomedical applications. Journal of Nanoparticle Research. 21 (12), 1-11 (2019).
  18. Kim, S. S., et al. A poly (lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite scaffold with enhanced osteoconductivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 206-215 (2007).
  19. Cipriano, A. F., et al. Degradation of bioresorbable Mg-4Zn-1Sr intramedullary pins and associated biological responses in vitro and in vivo. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (51), 44332-44355 (2017).
  20. Surmeneva, M. A., et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cell response to the RF magnetron sputter deposited hydroxyapatite coating on AZ91 magnesium alloy. Materials Chemistry and Physics. 221, 89-98 (2019).
  21. Sheikh, Z., et al. Mechanisms of in vivo degradation and resorption of calcium phosphate based biomaterials. Materials. 8 (11), 7913-7925 (2015).
  22. Klein, C., Driessen, A., De Groot, K., Van den Hooff, A. Biodegradation behavior of various calcium phosphate materials in bone tissue. Journal of Biomedical Materials Research. 17 (5), 769-784 (1983).
  23. Lanao, R. P. F., Leeuwenburgh, S. C., Wolke, J. G., Jansen, J. A. Bone response to fast-degrading, injectable calcium phosphate cements containing PLGA microparticles. Biomaterials. 32 (34), 8839-8847 (2011).
  24. Vey, E., et al. Degradation kinetics of poly (lactic-co-glycolic) acid block copolymer cast films in phosphate buffer solution as revealed by infrared and Raman spectroscopies. Polymer Degradation and Stability. 96 (10), 1882-1889 (2011).
  25. Standard, I. Biological evaluation of medical devices-Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Geneve, Switzerland: International Organization for Standardization. , (2009).
  26. Liu, X., Zhou, W., Wu, Y., Cheng, Y., Zheng, Y. Effect of sterilization process on surface characteristics and biocompatibility of pure Mg and MgCa alloys. Materials Science and Engineering: C. 33 (7), 4144-4154 (2013).
  27. Liu, H., Yazici, H., Ergun, C., Webster, T. J., Bermek, H. An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 4 (5), 1472-1479 (2008).
  28. Liu, H., et al. Enhancing effects of radiopaque agent BaSO4 on mechanical and biocompatibility properties of injectable calcium phosphate composite cement. Materials Science and Engineering: C. 116, 110904 (2020).
  29. Xu, C., et al. A versatile three-dimensional foam fabrication strategy for soft and hard tissue engineering. Biomedical Materials. 13 (2), 025018 (2018).
  30. Speranza, V., Sorrentino, A., De Santis, F., Pantani, R. Characterization of the polycaprolactone melt crystallization: complementary optical microscopy, DSC, and AFM studies. The Scientific World Journal. , 720157 (2014).
  31. Cipriano, A. F., et al. Anodization of magnesium for biomedical applications-Processing, characterization, degradation and cytocompatibility. Acta Biomaterialia. 62, 397-417 (2017).
  32. Li, H., Chang, J. pH-compensation effect of bioactive inorganic fillers on the degradation of PLGA. Composites science and technology. 65 (14), 2226-2232 (2005).
  33. Xu, C., Hung, C., Cao, Y., Liu, H. H. Tunable crosslinking, reversible phase transition, and 3D printing of hyaluronic acid hydrogels via dynamic coordination of innate carboxyl groups and metallic ions. ACS Applied Bio Materials. 4 (3), 2408-2428 (2021).
  34. Cortez Alcaraz, M. C., et al. Electrophoretic deposition of magnesium oxide nanoparticles on magnesium: processing parameters, microstructures, degradation, and cytocompatibility. ACS Applied Bio Materials. 2 (12), 5634-5652 (2019).
  35. Rutherford, D., et al. Synthesis, characterization, and cytocompatibility of yttria stabilized zirconia nanopowders for creating a window to the brain. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 108 (3), 925-938 (2020).
  36. Tian, Q., Deo, M., Rivera-Castaneda, L., Liu, H. Cytocompatibility of magnesium alloys with human urothelial cells: a comparison of three culture methodologies. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (9), 1559-1571 (2016).
  37. Nguyen, T., Cipriano, A., Guan, R. G., Zhao, Z. Y., Liu, H. In vitro interactions of blood, platelet, and fibroblast with biodegradable magnesium-zinc-strontium alloys. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2974-2986 (2015).
  38. Jiang, W., Lin, J., Chen, A. H., Pan, J., Liu, H. A portable device for studying the effects of fluid flow on degradation properties of biomaterials inside cell incubators. Regenerative Biomaterials. 6 (1), 39-48 (2019).
  39. Tian, Q., et al. Responses of human urothelial cells to magnesium-zinc-strontium alloys and associated insoluble degradation products for urological stent applications. Materials Science and Engineering: C. 96, 248-262 (2019).
  40. Wetteland, C. L., Liu, H. Optical and biological properties of polymer-based nanocomposites with improved dispersion of ceramic nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (10), 2692-2707 (2018).
  41. Wetteland, C. L., Nguyen, N. -. Y. T., Liu, H. Concentration-dependent behaviors of bone marrow derived mesenchymal stem cells and infectious bacteria toward magnesium oxide nanoparticles. Acta Biomaterialia. 35, 341-356 (2016).
  42. Aoi, W., Marunaka, Y. The importance of regulation of body fluid pH in the development and progression of metabolic diseases. Advances in Medicine and Biology. 77, 177-189 (2014).
  43. Wang, H. . Hydroxyapatite degradation and biocompatibility. , (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182BMSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены