체외에서 생분해성 임플란트 재료를 연구하기 위한 직접 및 간접 배양 방법

요약

우리는 생분해성 임플란트 재료의 시험관내 세포 적합성을 평가하기 위해 직접 배양, 직접 노출 배양 및 노출 배양의 세 가지 방법을 소개합니다. 이러한 시험관 내 방법은 상이한 생체내 세포-임플란트 상호작용을 모방하고 다양한 생분해성 물질을 연구하는데 적용될 수 있다.

초록

지난 수십 년 동안 생분해 성 물질은 정형 외과, 치과 및 두개골 안면 임플란트와 같은 생물 의학 응용 분야를 위해 광범위하게 탐구되었습니다. 생분해성 물질을 생체의학 응용을 위해 스크리닝하기 위해서는 시험관내 세포 반응, 세포 적합성 및 세포독성 측면에서 이들 물질을 평가할 필요가 있다. 국제 표준화기구 (ISO) 표준은 생체 재료 평가에 널리 활용되었습니다. 그러나 대부분의 ISO 표준은 원래 비분해성 물질의 세포 독성을 평가하기 위해 확립되었으므로 생분해 성 물질 스크리닝에 제한된 가치를 제공합니다.

이 기사에서는 세 가지 다른 배양 방법, 즉 직접 배양 방법, 직접 노출 배양 방법 및 생분해성 폴리머, 세라믹, 금속 및 그 복합체를 포함한 생분해 성 임플란트 재료의 시험관 내 세포 적합성을 평가하기위한 노출 배양 방법을 소개하고 논의합니다. 연구에 따르면 배양 방법은 동적 분해가 계면과 지역 환경에서 시공간 차이를 유도하기 때문에 생분해성 물질에 대한 세포 반응에 영향을 미친다는 사실이 밝혀졌습니다. 구체적으로, 직접 배양 방법은 임플란트에 직접 시딩된 세포의 반응을 드러낸다; 직접 노출 배양 방법은 임플란트와 접촉하는 확립 된 숙주 세포의 반응을 해명합니다. 노출 배양 방법은 임플란트와 직접 접촉하지는 않지만 임플란트 분해로 인한 국소 환경의 변화에 의해 영향을받는 확립 된 숙주 세포를 평가합니다.

이 기사에서는 생분해성 임플란트 물질의 시험관내 세포 적합성 및 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (BMSCs)와의 상호 작용을 연구하기 위한 이러한 세 가지 배양 방법의 예를 제공합니다. 또한 수확, 계대, 배양, 종자, 고정, 염색, 세포 특성화 및 배양 후 배지 및 재료 분석 방법을 설명합니다. 이 기사에서 설명된 시험관내 방법은 생체내 환경의 상이한 시나리오를 모방하여, 다양한 생체의학적 응용을 위한 상이한 생체재료의 시험관내 세포적합성 시험의 적용가능성 및 관련성을 넓힌다.

서문

수십 년 동안 생분해 성 물질은 정형 외과^1,2, ^dental3,4 및 craniomaxillofacial5 응용 분야와 같은 생물 의학 응용 분야에서 광범위하게 연구되고 사용되었습니다. 영구 임플란트 및 재료와 달리 생분해 성 금속, 세라믹, 폴리머 및 그 복합체는 생리 환경에서 다양한 화학 반응을 통해 시간이 지남에 따라 체내에서 점차 분해됩니다. 예를 들어, 마그네슘 (Mg) 합금^1,6,7 및 아연 (Zn) 합금^8,9와 같은 생분해 성 금속은 뼈 고정 장치의 유망한 재료입니다. 그들의 생분해성은 뼈 치유 후 임플란트를 제거하기 위해 이차 수술의 필요성을 제거 할 수 있습니다. 인산칼슘 시멘트(CPCs)와 같은 생분해성 세라믹은 경피적 척추성형술에서 골다공증 척추 압박 ....

프로토콜

이 프로토콜은 세포 및 조직 수확을 위해 리버 사이드 캘리포니아 대학 (UCR)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 12 주 된 암컷 Sprague-Dawley (SD) 쥐가 비디오에 예로 나와 있습니다. 젊은 암컷과 수컷 쥐가 선호됩니다.

1. 세포 배양 준비

참고: 이 문서에 설명된 세 가지 배양 방법은 일반적으로 부착되는 다른 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 여기서, 래트 이유식으로부터 수확된 BMSCs는 세포 배양 준비를 위한 예로서 도입될 것이다. 특정 의료 용도에 대한 관련성에 따라, 동물 또는 인간 기증자로부터 수확한 일차 세포 및 세포/조직 은행으로부터의 세포주를 포함하여 상이한 세포 유형이 이용될 수 있다.

1. 쥐 이유식에서 BMSC를 수확
   참고: 그림 1 의 개략도는 쥐 이유식에서 BMSC를 수확하는 단계를 보여줍니다.
   1. CO2 흡입으로 Sprague Dawley (SD) 쥐를 안락사시킵니다.
   2. 피부와 근육 및 결합 조직을 제거하여 안락사 된 쥐에서 대퇴골을 해부하십시오. 대퇴골 뼈를 세포 ....

결과

도 4는 상이한 배양 방법을 이용한 직접 및 간접 접촉 조건하에서의 BMSCs의 대표적인 형광 이미지를 나타낸다. 도 4A, B는 ZC21 마그네슘 합금1과 동일한 24시간 직접 배양 후 직접 및 간접 접촉 조건 하에서의 ^BMSC를 보여준다. ZC21 합금은 97.5 wt % 마그네슘, 2 wt % 아연 및 0.5 wt % 칼슘으로 구성됩니다. ZC21 합금 샘플과 직접 접촉?.......

토론

상이한 세포 배양 방법이 생체내 적용의 다양한 양태에 대해 관심있는 생체재료의 시험관내 세포적합성을 평가하는데 사용될 수 있다. 이 기사에서는 세 가지 시험관 내 배양 방법, 즉 직접 배양, 직접 노출 배양 및 노출 배양을 보여 주어 생분해 성 임플란트 재료가 인체 내부에서 사용되는 다양한 생체 내 시나리오를 모방합니다. 직접 배양 방법은 주로 임플란트 재료?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipette	VWR	490019-704
12-well tissue-culture-treated plates	Thermo Fisher Scientific	353043
15 mL conical tube (Polypropylene)	VWR	89039-666
18 G needle	BD	305196
25½ G needle	BD	305122
4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI)	Invitrogen	D3571
50 mL conical tube (Polypropylene)	VWR	89039-658
70 μm nylon strainer	Fisher Scientific	50-105-0135
Alexa Flour 488-phalloidin	Life technologies	A12379
Biological safety cabinet	LABCONCO	Class II, Type A2
Centrifuge	Eppendorf	Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430
Clear Fused Quartz Round Dish	AdValue Technology	FQ-4085
CO2 incubator	SANYO	MCO-19AIC
CoolCell Freezer Container	Corning	432000	foam container designed to regulate temperature decrease
Cryovial	Thermo Fisher Scientific	5000-1020
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5648
EDX analysis software	Oxford Instruments	AztecSynergy
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX)	FEI	50mm2 X-Max50 SDD
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.	SH30910
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti
Formaldehyde	VWR	100496-496
Hemacytometer	Hausser Scientific	3520
ImageJ software	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)
Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	Optima 8000
Optical microscope	VWR	VistaVision
Penicillin/streptomycin (P/S)	Thermo Fisher Scientific, Inc.,	15070063
pH meter	VWR	model SB70P
Phosphate Buffered Saline (PBS)	VWR	97062-730
Scanning electronic microscope (SEM)	FEI	Nova NanoSEM 450
surgical blade	VWR	76353-728
Tissue Culture Flasks	VWR	T-75, MSPP-90076
Transwell inserts	Corning	3460
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA)	Sigma-Aldrich	T4049
X-ray diffraction instrument (XRD)	PANalytical	Empyrean Series 2