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Résumé

Nous introduisons trois méthodes de culture directe, la culture d’exposition directe et la culture d’exposition pour évaluer la cytocompatibilité in vitro des matériaux d’implants biodégradables. Ces méthodes in vitro imitent différentes interactions cellule-implant in vivo et peuvent être appliquées pour étudier divers matériaux biodégradables.

Résumé

Au cours des dernières décennies, les matériaux biodégradables ont été largement explorés pour des applications biomédicales telles que les implants orthopédiques, dentaires et craniomaxillo-faciaux. Pour dépister les matériaux biodégradables pour des applications biomédicales, il est nécessaire d’évaluer ces matériaux en termes de réponses cellulaires in vitro , de cytocompatibilité et de cytotoxicité. Les normes de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) ont été largement utilisées dans l’évaluation des biomatériaux. Cependant, la plupart des normes ISO ont été établies à l’origine pour évaluer la cytotoxicité des matériaux non dégradables, offrant ainsi une valeur limitée pour le dépistage des matériaux biodégradables.

Cet article présente et discute trois méthodes de culture différentes, à savoir la méthode de culture directe, la méthode de culture d’exposition directe et la méthode de culture d’exposition pour évaluer la cytocompatibilité in vitro de matériaux d’implants biodégradables, y compris les polymères biodégradables, les céramiques, les métaux et leurs composites, avec différents types de cellules. La recherche a montré que les méthodes de culture influencent les réponses cellulaires aux matériaux biodégradables parce que leur dégradation dynamique induit des différences spatio-temporelles à l’interface et dans l’environnement local. Plus précisément, la méthode de culture directe révèle les réponses des cellules ensemencées directement sur les implants; la méthode de culture par exposition directe élucide les réponses des cellules hôtes établies entrant en contact avec les implants; et la méthode de culture d’exposition évalue les cellules hôtes établies qui ne sont pas en contact direct avec les implants, mais qui sont influencées par les changements dans l’environnement local dus à la dégradation des implants.

Cet article fournit des exemples de ces trois méthodes de culture pour étudier la cytocompatibilité in vitro des matériaux implantaires biodégradables et leurs interactions avec les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC). Il décrit également comment récolter, passer, cultiver, semer, fixer, tacher, caractériser les cellules et analyser les milieux et les matériaux de postculture. Les méthodes in vitro décrites dans cet article imitent différents scénarios de l’environnement in vivo , élargissant l’applicabilité et la pertinence des tests de cytocompatibilité in vitro de différents biomatériaux pour diverses applications biomédicales.

Introduction

Pendant des décennies, les matériaux biodégradables ont été largement étudiés et utilisés dans des applications biomédicales telles que les applications orthopédiques1,2, dentaires3,4 et craniomaxillo-faciales5. Contrairement aux implants et aux matériaux permanents, les métaux biodégradables, les céramiques, les polymères et leurs composites se dégradent progressivement dans le corps au fil du temps via différentes réactions chimiques dans l’environnement physiologique. Par exemple, les métaux biodégradables tels que les alliages de magnésium (Mg)1,6,7 et les alliages de zinc (Zn)8,9 sont des matériaux prometteurs pour les dispositifs de fixation osseuse. Leur biodégradabilité pourrait éliminer la nécessité de chirurgies secondaires pour retirer les implants après la cicatrisation osseuse. Les céramiques biodégradables telles que les ciments de phosphate de calcium (CPC) ont montré un potentiel intéressant pour le traitement des fractures ostéoporotiques de compression vertébrale dans la cyphoplastie percutanée10. Les CPC fournissent un soutien mécanique au corps vertébral fracturé et se dégradent progressivement après la guérison de la fracture.

Les polymères biodégradables, tels que certains polysaccharides et polyesters, ont également été largement explorés pour des applications biomédicales. Par exemple, l’hydrogel de chitosane en tant que polysaccharide biodégradable a montré ses capacités à prévenir les infections et à régénérer les tissus cutanés11. L’acide poly-L-lactique (PLLA), l’acide poly(glycolique) (PGA) et le poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) sont des polyesters largement étudiés pour la fabrication d’échafaudages poreux 2D ou 3D pour des applications d’ingénierie tissulaire12,13,14. De plus, les matériaux composites intègrent deux phases ou plus de métaux, de céramiques et de polymères pour fournir des fonctions avancées pour un large éventail d’applications biomédicales15,16,17. Par exemple, les composites PLGA et phosphate de calcium peuvent être utilisés pour fabriquer des échafaudages biodégradables pour des applications telles que la réparation des défauts osseux du crâne18. Ces échafaudages et implants biodégradables pourraient soutenir et favoriser la croissance des cellules et des tissus, puis se dégrader progressivement dans le corps au fil du temps.

Comme le montre le tableau supplémentaire 1, différents matériaux biodégradables peuvent avoir des mécanismes, des produits et des taux de dégradation variés. Par exemple, les alliages de magnésium, tels que Mg-2 % en poids de Zn-0,5 % en poids de Ca (ZC21)1, Mg-4 % en poids de Zn-1 % en poids de Sr (ZSr41)19 et Mg-9 % en poids d’Al-1 % en poids de zinc (AZ91)20, se dégradent en réagissant avec l’eau, et leurs produits de dégradation comprennent principalement des ions Mg2+, des ions OH-, du gaz H2 et des dépôts minéraux. Le taux de dégradation des métaux biodégradables varie en fonction de leurs différentes compositions, géométries et environnements de dégradation. Par exemple, Cipriano et al.19 ont rapporté que les fils ZSr41 (Ø1,1 × 15 mm) perdaient 85 % de masse tandis que les fils Mg purs de même géométrie perdaient 40 % de masse après avoir été implantés dans les tibias du rat pendant 47 jours. Les matériaux céramiques biodégradables tels que l’hydroxyapatite (HA) et le phosphate β-tricalcique (β-TCP) peuvent se dégrader par dissolution liquide extracellulaire entraînée par solution ou se décomposer en petites particules, puis se dégrader via des processus de dissolution liquide extracellulaire et de résorption à médiation cellulaire. Les produits de dégradation de ces céramiques à base de phosphate de calcium peuvent inclure des ions Ca2+, des ions (PO4)3-, des ions OH- et des dépôts minéraux21. Le taux de dégradation des céramiques de phosphate de calcium est significativement affecté par leurs structures cristallines. Par exemple, Van Blitterswijk et al.22 ont rapporté que l’AH avec des micropores à 40 % vol. n’a pas perdu de masse tandis que β-TCP avec 40 % vol.% de micropores a perdu 30 ± 4 % de masse après avoir été implanté dans les tibias de lapins pendant 3 mois. Les polymères tels que PLGA14,23 peuvent se dégrader en raison de l’hydrolyse des liaisons esters en présence d’eau, et les produits de dégradation comprennent principalement les acides lactique et glycolique. Il peut s’écouler un mois avant que PLGA 50/50 et PLGA 95/5 n’atteigne une dégradation complète24.

Les tests de réponse cellulaire et de cytocompatibilité sont essentiels pour évaluer et dépister ces matériaux implantaires biodégradables pour des applications biomédicales. Cependant, les normes actuelles de l’Organisation internationale de normalisation (ISO), telles que l’ISO 10993-5:2009 « Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 5 Tests de cytotoxicité in vitro », ont été initialement conçues pour évaluer la cytotoxicité de biomatériaux non dégradables tels que les alliages Ti et les alliages Cr-Co in vitro25. Plus précisément, l’ISO 10993-5:2009 ne couvre que les essais de cytotoxicité in vitro de l’extrait, les essais de contact direct et les essais de contact indirect. Dans le test d’extrait, l’extrait est préparé en immergeant des échantillons dans des fluides d’extraction tels que des milieux de culture avec du sérum et des solutions salines physiologiques dans l’une des conditions de temps et de température standard. L’extrait collecté ou la dilution est ensuite ajouté dans la culture cellulaire pour étudier la cytotoxicité. Pour l’essai de contact direct, le contact direct entre l’échantillon et les cellules est obtenu en plaçant l’échantillon d’essai sur la couche cellulaire établie (adhérée). Dans le test de contact indirect, le milieu de culture contenant du sérum et de la gélose fondue est pipeté pour recouvrir les cellules établies. L’échantillon est ensuite placé sur la couche de gélose solidifiée avec ou sans filtre.

Les normes ISO ont montré certaines limites lorsqu’elles sont appliquées pour évaluer les matériaux biodégradables in vitro. Contrairement aux matériaux non dégradables, les comportements de dégradation des matériaux biodégradables sont dynamiques et peuvent changer à un moment différent ou dans des conditions environnementales variées (par exemple, température, humidité, composition du milieu et type de cellule). L’essai d’extrait évalue uniquement la cytotoxicité des produits de dégradation du matériau et ne reflète pas le processus dynamique de dégradation de l’échantillon. Les tests de contact direct et indirect de la norme ISO ne caractérisent que les interactions entre les cellules établies et les échantillons. De plus, dans l’essai de contact indirect, les matériaux et les cellules se trouvent dans différents microenvironnements qui ne reflètent pas l’environnement in vivo et ne capturent pas la dégradation dynamique des matériaux biodégradables.

L’objectif de cet article est de présenter et de discuter des méthodes d’essai de cytocompatibilité pour divers matériaux d’implants biodégradables afin de répondre aux limites susmentionnées des méthodes décrites dans les normes ISO actuelles. Les méthodes présentées dans cet article prennent en compte le comportement de dégradation dynamique des matériaux implantaires et les différentes circonstances des interactions cellule-matériau in vivo. Plus précisément, cet article fournit trois méthodes de test de cytocompatibilité, à savoir la culture directe, la culture d’exposition directe et la culture d’exposition pour divers matériaux biodégradables, y compris les polymères biodégradables, les céramiques, les métaux et leurs composites pour les applications d’implants médicaux.

Dans la méthode de culture directe, les cellules en suspension dans le milieu de culture sont directement ensemencées sur les échantillons, évaluant ainsi les interactions entre les cellules nouvellement ensemencées et les implants. Dans la culture d’exposition directe, les échantillons sont placés directement sur la couche cellulaire établie pour imiter les interactions des implants avec les cellules hôtes établies dans le corps. Dans la culture d’exposition, les échantillons sont placés dans leurs inserts de puits respectifs, puis introduits dans les puits de culture avec des cellules établies, ce qui caractérise les réponses des cellules établies aux changements dans l’environnement local induits par la dégradation de l’implant lorsqu’elles n’ont pas de contact direct avec les implants. Les méthodes de culture directe et de culture par exposition directe évaluent les cellules directement ou indirectement en contact avec les matériaux de l’implant dans le même puits de culture. La culture d’exposition caractérise indirectement les cellules en contact avec les matériaux de l’implant à une distance prescrite dans le même puits de culture.

Cet article présente une description détaillée des tests de cytocompatibilité pour différents matériaux biodégradables et de leurs interactions avec les cellules modèles, c’est-à-dire les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC). Les protocoles comprennent la récolte, la culture, l’ensemencement, la fixation, la coloration et l’imagerie des cellules, ainsi que des analyses des matériaux et des milieux de postculture, qui s’appliquent à une variété de matériaux d’implants biodégradables et à un large éventail de types de cellules. Ces méthodes sont utiles pour le criblage de matériaux biodégradables pour différentes applications biomédicales en termes de réponses cellulaires et de cytocompatibilité in vitro.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie à Riverside (UCR) pour la récolte de cellules et de tissus. Un rat femelle Sprague-Dawley (SD) de 12 semaines est montré à titre d’exemple dans la vidéo. Les rats femelles et mâles plus jeunes sont préférés.

1. Préparation de la culture cellulaire

REMARQUE : Les trois méthodes de culture décrites dans cet article sont généralement applicables aux différents types de cellules adhérentes. Ici, les BMSC récoltés sur des sevrés de rats seront introduits comme exemple pour la préparation de la culture cellulaire. Selon leur pertinence pour des applications médicales spécifiques, différents types de cellules peuvent être utilisés, y compris des cellules primaires prélevées sur des animaux ou des donneurs humains et des lignées cellulaires à partir d’une banque de cellules / tissus.

  1. Récolte de BMSC à partir de sevrages de rats
    REMARQUE : Le diagramme schématique de la figure 1 montre les étapes à suivre pour récolter les BMSC des sevrés de rats.
    1. Euthanasier le rat Sprague Dawley (SD) par inhalation de CO2 .
    2. Retirez la peau, les muscles et les tissus conjonctifs pour disséquer le fémur du rat euthanasié. Placer les os fémoraux dans un tube conique de 15 mL (polypropylène) contenant un milieu de culture cellulaire. Placez les tubes coniques sur de la glace jusqu’au moment de l’extraction cellulaire.
      REMARQUE: Tibia peut également être utilisé pour récolter des BMSC. Le milieu de culture cellulaire est le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S).
    3. Transférer les os dans une boîte de Petri dans l’armoire de sécurité biologique. Coupez les extrémités de l’os à l’aide d’une lame chirurgicale et rincez la moelle osseuse dans un tube conique de 50 mL (polypropylène) en lavant la cavité de la moelle osseuse avec un milieu de culture cellulaire à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 251/2 G.
      REMARQUE: Insérez une seringue avec une aiguille de 18 G dans le support avec de la moelle osseuse. Lentement et doucement, prenez et distribuez le milieu pour briser le gros morceau de moelle jusqu’à ce qu’aucun agglomérat cellulaire / tissulaire visible ne soit présent.
    4. Filtrer la suspension de la cellule à l’aide d’un filtre de 70 μm, suivi d’une centrifugation à 126 × g (1 000 tr/min) pendant 5 min pour obtenir les pastilles de la cellule.
    5. Aspirer le milieu surnageant et reconstituer avec 10 mL de milieux frais. Pipettez doucement de haut en bas pour remettre les cellules en suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
    6. Pipettez la suspension directement sur le fond intérieur d’une fiole T-75 et ajoutez du support pour porter le volume à 25 mL. Cultiver les cellules dans un incubateur dans un environnement de culture cellulaire stérile standard (c.-à-d. 37 °C, atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 et 95 % d’air).
    7. Après 3-7 jours, rincez les cellules non adhérentes en aspirant l’ancien milieu et en reconstituant avec du milieu frais. Continuez à cultiver et à nourrir les cellules avec un milieu frais jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour le passage cellulaire, la congélation ou l’utilisation dans une expérience.
  2. Entretien des cellules
    1. Changez régulièrement le milieu de culture cellulaire pour éliminer les déchets cellulaires et reconstituer les nutriments environ tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 90% à 100%. À 90% de confluence, le passage, le gel ou l’utilisation des cellules dans une expérience.
    2. Cellules de passage
      REMARQUE: Le passage, également appelé sous-culture, est un terme qui s’applique chaque fois que des cellules sont transférées d’une culture à une autre. Les cellules fraîchement récoltées sont au stade de passage 0 (P0). Les quantités de solution d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (trypsine-EDTA) et de milieux décrits dans cet article sont pour une fiole de T-75.
      1. Vérifiez les cellules au microscope optique pour confirmer qu’elles sont confluentes à 90 %.
      2. Aspirer le milieu de la fiole cellulaire.
      3. Distribuer 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la fiole à l’aide d’une pipette sérologique. Bercez doucement la fiole pour rincer les cellules avec du PBS; aspirer tous les PBS.
        REMARQUE: Cette étape sert de rinçage supplémentaire pour s’assurer qu’aucune cellule morte ou aucun déchet cellulaire ne sera transféré pendant le passage.
      4. Distribuer 3 mL de trypsine-EDTA dans la fiole cellulaire directement sur la surface des cellules. Secouez doucement la fiole pour vous assurer que toute la surface avec les cellules est recouverte par la trypsine-EDTA.
      5. Placez la fiole cellulaire avec de la trypsine-EDTA dans l’incubateur pendant 5 minutes pour permettre aux cellules de se détacher.
      6. Après 5 min dans l’incubateur, vérifiez les cellules au microscope optique pour confirmer que les cellules sont détachées. Si certaines cellules ne se sont pas détachées, appuyez doucement sur le côté de la fiole et vérifiez à nouveau la fiole.
      7. Ajouter 9 mL de milieu frais dans la fiole cellulaire pour diluer la trypsine-EDTA. Cela fournit des protéines plus accessibles auxquelles la trypsine-EDTA peut se lier au lieu de lyser les cellules.
      8. Pipeter les cellules dans un milieu et de la trypsine-EDTA et les distribuer dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules à 126 × g (1 000 tr/min) pendant 5 min.
      9. Sans perturber la pastille cellulaire, aspirer le milieu avec de la trypsine-EDTA.
      10. Ajouter 5 à 10 mL de milieu frais dans le tube de centrifugeuse et remettre doucement en suspension les cellules dans le milieu à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
      11. Pipeter les cellules en suspension dans le milieu hors du tube de centrifugeuse et diviser le volume en 2-3 flacons de culture frais. Ajouter suffisamment de milieu pour porter le volume moyen total à 25 mL pour chaque flacon.
        REMARQUE: Le ratio de division pendant la sous-culture peut varier en fonction des types de cellules et des caractéristiques de croissance spécifiques.
      12. Vérifiez les cellules sous un microscope optique et replacez-les dans l’incubateur.
    3. Congélation de cellules
      1. Vérifiez les cellules au microscope optique pour confirmer qu’elles sont confluentes à 90 %.
      2. Répétez les étapes 1.2.2.2 à 1.2.2.9.
      3. Ajouter 900 μL de milieu frais au tube de centrifugeuse avec une micropipette de 100-1000 μL. Remettre lentement et doucement les cellules en milieu à l’aide de la même micropipette.
      4. Transférer la suspension cellulaire de 900 μL dans un cryovial. Ajouter 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
      5. Dès que possible, placez le cryovial dans un récipient en mousse cylindrique conçu pour réguler la diminution de la température (voir le Tableau des matériaux). Placez le récipient en mousse dans le congélateur à -80 °C.
    4. Décongélation des cellules
      1. Décongeler les cellules congelées au bain-marie. Prenez un tube conique stérile de 15 mL rempli de 5 mL de milieu frais, placez les cellules dans le tube conique et centrifugez à 126 × g (1 000 tr/min) pendant 5 min.
      2. Aspirer le milieu contenant du DMSO.
      3. Ajouter 5 à 10 mL de milieu frais au tube conique de 15 mL de cellules. Pipettez lentement et doucement de haut en bas pour remettre les cellules en suspension.
      4. Pipeter les cellules en suspension dans un milieu à partir du tube conique de 15 mL et distribuer dans une nouvelle fiole T-75. Lors de la distribution des cellules, utilisez un mouvement de balayage pour répartir les cellules aussi uniformément que possible au fond de la fiole cellulaire.
      5. Ajouter suffisamment de milieu frais pour porter le volume moyen total à 25 mL pour chaque fiole T-75.
      6. Vérifiez les cellules sous un microscope optique et replacez la fiole dans l’incubateur.

2. Préparation et stérilisation des échantillons

  1. Préparation des échantillons
    1. Utilisez des plaques traitées par culture tissulaire telles que des plaques de 6, 12, 24, 48 ou 96 puits pour les expériences de culture cellulaire décrites dans cet article. Sélectionnez le type de plaques de culture tissulaire et le volume de milieu dans chaque puits en fonction de différents plans expérimentaux tels que la dimension de l’échantillon.
  2. Stériliser ou désinfecter tous les échantillons biodégradables avant la culture cellulaire.
    REMARQUE: La désinfection est acceptable pour in vitro les études lorsque les échantillons sont sujets à des changements chimiques et/ou de surface dans certaines conditions de stérilisation impliquant une chaleur élevée, un oxydant et/ou des radicaux. Les méthodes de stérilisation ou de désinfection pour différents types d’échantillons varient en fonction des différentes propriétés des matériaux, tels que les polymères, les métaux et les céramiques. Le processus de stérilisation ou de désinfection peut impliquer de la chaleur, du gaz, des radiations, des produits chimiques, une haute pression ou une combinaison de ceux-ci.
    1. Métaux biodégradables
      1. En général, utilisez le rayonnement ultraviolet (UV) pour désinfecter les métaux biodégradables pour les études in vitro .
        REMARQUE: Par exemple, Zhang et al. ont rapporté que des échantillons d’alliage de magnésium pur (Mg) et de ZC21 Mg ont été désinfectés sous rayonnement UV pendant 4 h avant d’être utilisés dans les études cellulaires1. Pour les études in vivo, les échantillons doivent généralement être stérilisés. Pour de nombreux métaux biodégradables tels que le magnésium ou les alliages de magnésium, l’autoclavage à la vapeur doit être évité car ces échantillons pourraient être oxydés ou corrodés dans l’eau6. Un plat en quartz est recommandé pour la désinfection UV car il offre une meilleure transparence UV que la plupart des verres et des plastiques.
      2. Stériliser les échantillons d’alliage Mg à feu sec dans un four ou un autoclave à la plage de température de 100-200 °C.
        REMARQUE: Comme certains alliages métalliques peuvent encore s’oxyder à la surface à des températures élevées dans l’air, un rayonnement de haute intensité peut être utilisé comme alternative dans certains cas. Cependant, les rayonnements de haute intensité tels que les rayonnements alpha ou gamma doivent être évités lors de la stérilisation de fines feuilles métalliques. Il peut provoquer un déplacement d’atomes dans les matériaux, modifiant la microstructure des matériaux.
      3. Utiliser la stérilisation au gaz à l’oxyde d’éthylène (EtO) comme méthode alternative pour les métaux biodégradables sensibles à la chaleur et aux radiations26.
    2. Céramique biodégradable
      1. Généralement, désinfectez les céramiques biodégradables à l’aide d’un rayonnement UV ou d’une solution d’éthanol à 70% avant les études in vitro .
        NOTE : Par exemple, Liu et coll. ont rapporté que les échantillons de phosphate de calcium ont été désinfectés par immersion dans de l’éthanol à 70 % pendant 1 h et exposés à la lumière UV pendant 12 h de chaque côté avant d’être utilisés dans des tests de cytocompatibilité in vitro27.
      2. Utilisez des autoclaves pour stériliser les céramiques biodégradables si les températures élevées et la vapeur d’eau n’endommagent pas leurs compostions et microstructures.
        REMARQUE: Certaines céramiques peuvent être affectées par l’autoclavage. Par exemple, un changement de phase et une rugosité de surface ont été constatés lorsque des céramiques de zircone stabilisées à l’yttria ont été autoclavées à 121 °C pendant 15 minutes. De plus, les CPC ne peuvent pas être stérilisés par autoclavage à la vapeur car les échantillons réagiront avec l’eau.
      3. Utilisez d’autres méthodes de stérilisation telles que le rayonnement cobalt-60 pour les céramiques de zircone stabilisées à l’yttria et les échantillons de CPC susmentionnés28.
    3. Polymères biodégradables
      1. En général, désinfectez les polymères biodégradables à l’aide de rayons UV ou d’éthanol à 70% avant de les utiliser dans des études cellulaires in vitro.
        REMARQUE: Certains polymères peuvent subir des changements chimiques sous le rayonnement UV. Pour la stérilisation, un traitement aux rayons gamma tel que le rayonnement Cobalt-60 peut être utilisé. Par exemple, les poudres d’amidon ont été stérilisées sous rayonnement cobalt-60 avant d’être utilisées dans des études cellulaires in vitro29.
      2. Matériaux polymères autoclaves pouvant résister à des températures et à une humidité élevées.
        REMARQUE: Par exemple, les polymères tels que le polypropylène peuvent être autoclavés car ils peuvent tolérer des températures d’autoclavage (c’est-à-dire 121-134 ° C). Certains polymères tels que la polycaprolactone (PCL) ne peuvent pas être autoclavés en raison de leurs points de fusion relativement bas (c’est-à-dire environ 60 °C)30.
      3. Utilisez le gaz EtO pour stériliser les matériaux polymères sensibles à la stérilisation par la chaleur ou par rayonnement.

3. Méthodes de culture cellulaire

  1. Méthodes de culture directe
    REMARQUE : Le diagramme schématique de la figure 2A montre les étapes de la méthode de culture directe. Dans cet article, les BMSC ont été cultivés sur une plaque dérivée de Mg placée à l’intérieur des puits d’une plaque traitée par culture tissulaire de 12 puits à titre d’exemple pour illustrer la méthode de culture.
    1. Suivez les étapes décrites aux étapes 1.2.2.1-1.2.2.10 pour obtenir la suspension cellulaire.
    2. Utilisez une fiole confluente à 90 % pour déterminer la concentration cellulaire dans la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer la suspension cellulaire à l’aide d’un milieu frais à une concentration cellulaire prescrite nécessaire à l’étude cellulaire in vitro.
      REMARQUE: La densité d’ensemencement des cellules est déterminée par la conception expérimentale. Par exemple, des densités cellulaires de 2 000 à 40 000 cellules/cm2 ont été utilisées dans différentes études cellulaires avec des matériaux biodégradables.
    3. Placez les échantillons (plaque Mg) au centre des 12 plaques de culture tissulaire bien traitées. Rincer séquentiellement les plaques de culture avec 2 mL de PBS et 2 mL de DMEM pour calibrer la pression osmotique dans des conditions stériles. Ajouter 3 mL de suspension cellulaire diluée dans chaque puits sur les échantillons d’intérêt.
    4. Cultiver les cellules dans un incubateur dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 24 h.
      REMARQUE: Le temps de culture peut être plus long ou plus court que 24 h selon la conception expérimentale.
  2. Cultures à exposition directe
    REMARQUE : Le diagramme schématique de la figure 2B montre les étapes de la culture d’exposition directe.
    1. Comme décrit aux étapes 3.1.1 et 3.1.2, préparer la suspension cellulaire avec les concentrations requises de cellules en fonction de la conception expérimentale pour différents types de cellules et applications prévues.
    2. Rincer les plaques de culture avec 2 mL de PBS et 2 mL de DMEM séquentiellement pour calibrer la pression osmotique dans des conditions stériles. Ajouter 3 mL de la suspension cellulaire diluée dans chaque puits. Cultivez les cellules dans l’incubateur humidifié dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 24 h ou jusqu’à ce que les cellules atteignent 50 à 80% de confluence.
      REMARQUE: Le niveau de confluence cellulaire peut varier selon les types de cellules et la conception expérimentale.
    3. Après 24 h, rincez les cellules dans la plaque du puits avec du PBS à l’aide d’une pipette pour éliminer les cellules mortes flottantes.
    4. Placez les échantillons désinfectés ou stérilisés directement sur les cellules adhérentes. Ajouter 3 mL de milieu frais dans chaque puits.
    5. Cultiver les cellules dans des conditions de culture cellulaire standard pendant encore 24 heures.
      REMARQUE: Le temps de culture peut être plus long ou plus court que 24 h selon la conception expérimentale.
  3. Cultures d’exposition
    REMARQUE : Le diagramme schématique de la figure 2C montre les étapes de la méthode de culture d’exposition.
    1. Les premières étapes de la préparation cellulaire sont les mêmes que celles de la culture d’exposition. Comme décrit aux étapes 3.1.1 et 3.1.2, préparer la suspension cellulaire avec les cellules souhaitées. Semblable aux étapes 3.2.1 et 3.2.2, ensemencez les cellules dans la plaque de puits à la densité souhaitée et cultivez-les dans un incubateur dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 24 h.
    2. Après 24 h, rincer les cellules adhérentes avec du PBS pour éliminer les cellules mortes flottantes, puis ajouter 3 mL de milieu frais dans chaque puits.
    3. Ensuite, placez les échantillons dans les inserts de puits avec une taille de pore membranaire de 0,4 μm et placez les inserts de puits avec les échantillons dans chaque puits avec les cellules.
    4. Cultiver les cellules dans des conditions de culture cellulaire standard pendant encore 24 heures.
      REMARQUE: Le temps de culture peut être plus long ou plus court que 24 h selon la conception expérimentale.

4. Caractérisation post-culture des cellules

REMARQUE: Pour la culture directe et la culture d’exposition directe, fixez, coloriez, imagez et analysez les cellules adhérentes sur les plaques de puits et les échantillons. Pour la culture d’exposition, analysez les cellules collées aux plaques de puits.

  1. Fixation des cellules
    1. Recueillir le milieu de postculture de chaque puits dans un tube conique correspondant de 15 mL pour une analyse plus approfondie. Prélever tous les échantillons après la culture pour une analyse plus approfondie.
    2. Rincez les cellules adhérentes sur les échantillons et les plaques de puits 3 fois en utilisant PBS.
    3. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA, formol tamponné neutre à 10 %) dans chaque plaque de puits. Remettez le couvercle sur la plaque du puits et laissez le PFA réagir pendant 20 min.
    4. Après 20 min, aspirer le PFA et le distribuer dans un flacon poubelle. Rincez la plaque du puits 3 fois à l’aide de PBS pour éliminer le PFA et transférez les déchets dans le flacon de déchets.
  2. Coloration cellulaire
    1. Préparez les stocks de travail des agents colorants en suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE: Par exemple, Alexa Fluor 488 Phalloidin est utilisé pour colorer la F-actine, et 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est utilisé pour colorer les noyaux cellulaires. Le temps de coloration peut être réduit si les échantillons se dégradent rapidement dans les solutions de coloration.
    2. Ajouter 200-400 μL d’agent colorant alexa Fluor 488 Phalloidin dilué à chaque puits pour couvrir les cellules sur la plaque du puits et l’échantillon. Enveloppez la plaque du puits dans du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière et laissez l’Alexa Fluor 488 Phalloidin réagir pendant 20 minutes à température ambiante.
    3. Collectez l’agent colorant Alexa Fluor 488 Phalloidin et distribuez-le dans le flacon de déchets correspondant. Rincez la plaque du puits 3 fois à l’aide de PBS pour éliminer l’excès de phalloïdine Alexa Fluor 488 et distribuez le PBS usagé dans le flacon de déchets correspondant.
    4. Ajouter 200 à 400 μL de DAPI dilué à chaque puits pour couvrir les cellules du puits et de l’échantillon. Enveloppez la plaque du puits dans du papier d’aluminium et laissez le DAPI réagir pendant 5 min à température ambiante.
    5. Collectez le DAPI et distribuez-le dans le flacon de déchets correspondant. Rincez la plaque du puits 3 fois à l’aide de PBS pour éliminer le DAPI et distribuez le PBS usagé dans le flacon de déchets correspondant.
  3. Imagerie cellulaire
    1. Après la coloration, imagez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence. Dans la mesure du possible, prenez des images de cellules à contraste de phase en plus des images de fluorescence. Imagez les cellules sur les échantillons biodégradables dès que possible ou immédiatement après la coloration pour éviter ou réduire les changements possibles causés par la dégradation continue des échantillons. Stocker les cellules dans les plaques de puits dans une solution tampon à 2-8 °C après la fixation, et imager les cellules dès que possible après la coloration pour éviter la perte de signaux de fluorescence.
    2. Pour la culture directe et la culture par exposition directe, imager et évaluer deux types de cellules : (1) les cellules sur les échantillons (en contact direct avec les échantillons) et (2) les cellules adhérentes sur la plaque de puits entourant les échantillons (contact indirect avec les échantillons), comme le montre la figure 3A.
    3. Pour la culture d’exposition, comme le montre la figure 3B, utilisez un guide d’image lorsque vous prenez les images de fluorescence des cellules pour déterminer si la réponse cellulaire serait différente en réponse au gradient de dégradation dynamique des échantillons. Imagez et analysez séparément les cellules situées dans la zone située à l’intérieur de l’anneau intérieur (à 3,5 mm du centre) et de l’anneau extérieur (à 7 mm du centre).
      Remarque : Le guide d’image est utilisé pour définir la distance entre les cellules et les échantillons.
    4. Pour chaque échantillon et puits dans les plaques de culture, prélever au hasard au moins cinq images de chaque zone d’intérêt où les cellules sont en contact direct ou indirect avec les échantillons à une distance prédéfinie.
  4. Analyse d’images
    1. Pour toutes les images cellulaires obtenues à partir de l’étape 4.3, quantifiez la morphologie cellulaire en mesurant la zone d’étalement cellulaire et le rapport d’aspect à l’aide d’un logiciel tel que ImageJ pour l’analyse d’images.
    2. Comptez le nombre de cellules dans chaque zone de l’image. Calculez la densité d’adhérence des cellules dans des conditions de contact direct et indirect comme le nombre de cellules par unité de surface.

5. Analyses postculturelles des milieux et des échantillons

  1. Mesurer le pH du milieu de postculture.
    REMARQUE: Certains échantillons modifient la valeur du pH du milieu pendant leur dégradation. Par exemple, les métaux biodégradables tels que les alliages de magnésium augmentent généralement la valeur du pH du milieu en raison de leur dégradation31. En revanche, les polymères biodégradables tels que le PLGA diminuent souvent la valeur du pH du milieu lorsqu’ils se dégradent32. La mesure de la valeur du pH du milieu de postculture peut indiquer la dégradation de ces échantillons in vitro.
    1. Avant la fixation cellulaire, prélever le milieu de postculture comme à l’étape 4.1.1.
    2. Mesurez les valeurs de pH du milieu de postculture dans chaque puits immédiatement après la collecte, à l’aide d’un pH-mètre précalibré.
      REMARQUE: Le pH du milieu peut dériver au fil du temps en raison des conditions environnementales telles que le niveau de CO2 et la température, qui doivent être prises en considération.
  2. Analyser les compositions moyennes pour le comportement de dégradation des échantillons biodégradables. Pour certains échantillons qui provoquent un changement de couleur du milieu, mesurez la valeur de densité optique (O.D.) du milieu de postculture à l’aide d’un spectrophotomètre ou d’un lecteur de microplaques pour déterminer le comportement de dégradation. Alternativement, utilisez la spectroscopie ultraviolet-visible (UV-VIS) et la réflectance totale atténuée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR-ATR) pour analyser les produits de dégradation dans le milieu de postculture.
    REMARQUE: La mesure des produits de dégradation dans le milieu post-culture est utile pour comprendre le comportement de dégradation des échantillons. L’une des approches les plus courantes consiste à mesurer les ions d’intérêt dans le milieu de postculture à l’aide d’un spectromètre d’émission plasma-optique à couplage inductif (ICP-OES). L’ICP-OES peut être utilisé pour mesurer les compositions des milieux de postculture des métaux et des céramiques, mais peut ne pas convenir aux polymères. Les polymères sont généralement constitués de carbone, d’hydrogène et d’oxygène, et la quantification précise de ces éléments est difficile pour ICP-OES.
    1. Conformément à l’étape 5.1.2 pour la mesure du pH, recueillir et diluer le milieu à l’aide d’un facteur de dilution souhaitable pour des mesures optimales des concentrations d’ions.
    2. Mesurer les concentrations des ions d’intérêt dans le milieu de postculture à l’aide d’un ICP-OES.
  3. Analyse postculturelle d’échantillons
    REMARQUE: Après l’étude cellulaire in vitro , les échantillons biodégradables peuvent changer de dimension, de masse, de morphologie de surface, de microstructure et de composition. L’analyse postculturenelle des échantillons aide à comprendre le mécanisme de dégradation des échantillons.
    1. Après la culture cellulaire, prenez les photographies des échantillons pour montrer les changements possibles dans la dimension, la couleur, la morphologie et d’autres caractéristiques visibles de l’échantillon.
    2. Sécher ou déshydrater les échantillons de postculture et mesurer la masse, la dimension et le volume de l’échantillon pour quantifier tout changement de masse, de dimension et de volume.
    3. Utilisez un microscope électronique à balayage (MEB) pour caractériser la microstructure et la morphologie des échantillons. Utilisez la spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (EDX) et la diffraction des rayons X (XRD) pour caractériser la composition et la phase des produits de dégradation sur les échantillons. Utilisez FTIR-ATR pour détecter la liaison chimique sur les surfaces de l’échantillon.

Résultats

La figure 4 montre les images de fluorescence représentatives des BMSC dans des conditions de contact direct et indirect en utilisant différentes méthodes de culture. La figure 4A,B montre les BMSC dans des conditions de contact direct et indirect après la même culture directe de 24 heures avec des alliages de magnésium ZC2111. Les alliages ZC21 se composent de 97,5 % en poids de magnésium, de 2 % en poids de zinc ...

Discussion

Différentes méthodes de culture cellulaire peuvent être utilisées pour évaluer la cytocompatibilité in vitro de biomatériaux d’intérêt pour divers aspects d’applications in vivo. Cet article présente trois méthodes de culture in vitro , à savoir la culture directe, la culture d’exposition directe et la culture d’exposition, pour imiter différents scénarios in vivo où des matériaux d’implant biodégradables sont utilisés à l’intérieur du corps humain. La m...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs apprécient le soutien financier de la National Science Foundation des États-Unis (NSF CBET award 1512764 et NSF PIRE 1545852), des National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), de la Regents Faculty Development Fellowship de l’Université de Californie (UC) et du Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) et de la UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Les auteurs apprécient le Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) à l’UC-Riverside pour l’utilisation du SEM/EDS et le Dr Perry Cheung pour l’utilisation des instruments XRD. Les auteurs apprécient également Thanh Vy Nguyen et Queenie Xu pour l’édition partielle. Les auteurs tiennent également à remercier Cindy Lee d’avoir enregistré la narration de la vidéo. Toutes les opinions, constatations et conclusions, ou recommandations exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation ou des National Institutes of Health.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL serological pipetteVWR490019-704
12-well tissue-culture-treated platesThermo Fisher Scientific353043
15 mL conical tube (Polypropylene)VWR89039-666
18 G needleBD305196
25½ G needleBD305122
4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI)InvitrogenD3571
50 mL conical tube (Polypropylene)VWR89039-658
70 μm nylon strainerFisher Scientific50-105-0135
Alexa Flour 488-phalloidinLife technologiesA12379
Biological safety cabinetLABCONCOClass II, Type A2
CentrifugeEppendorfRotor F-35-6-30, Centrifuge5430
Clear Fused Quartz Round DishAdValue TechnologyFQ-4085
CO2 incubatorSANYOMCO-19AIC
CoolCell Freezer ContainerCorning432000foam container designed to regulate temperature decrease
CryovialThermo Fisher Scientific5000-1020
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5648
EDX analysis softwareOxford InstrumentsAztecSynergy
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX)FEI50mm2 X-Max50 SDD
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.SH30910
Fluorescence microscopeNikonEclipse Ti
FormaldehydeVWR100496-496
HemacytometerHausser Scientific3520
ImageJ softwareNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)
Inductively coupled plasma
optical emission spectrometry (ICP-OES)		PerkinElmerOptima 8000
Optical microscopeVWRVistaVision
Penicillin/streptomycin (P/S)Thermo Fisher Scientific, Inc.,15070063
pH meterVWRmodel SB70P
Phosphate Buffered Saline (PBS)VWR97062-730
Scanning electronic microscope (SEM)FEINova NanoSEM 450
surgical bladeVWR76353-728
Tissue Culture FlasksVWRT-75, MSPP-90076
Transwell insertsCorning3460
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA)Sigma-AldrichT4049
X-ray diffraction instrument (XRD)PANalyticalEmpyrean Series 2

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