A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
אנו מציגים שלוש שיטות של תרבות ישירה, תרבות חשיפה ישירה ותרבות חשיפה להערכת תאימות במבחנה של חומרי שתל מתכלים מתכלים. שיטות הפריה חוץ גופית אלה מחקות אינטראקציות שונות של שתל תא vivo וניתן ליישם אותן כדי ללמוד חומרים מתכלים שונים.
במהלך העשורים האחרונים, חומרים מתכלים נחקרו בהרחבה עבור יישומים ביו-רפואיים כגון שתלים אורתופדיים, דנטליים וקרניומקסיופסיאליים. כדי לסנן חומרים מתכלים עבור יישומים ביו-רפואיים, יש צורך להעריך חומרים אלה במונחים של תגובות תא במבחנה , ציטוקי תאימות, ו ציטוטוקסיות. תקני הארגון הבינלאומי לתקנון (ISO) נוצלו באופן נרחב בהערכת ביו-חומרים. עם זאת, רוב תקני ISO נקבעו במקור כדי להעריך את הציטוטוקסיות של חומרים שאינם מתכלים, ובכך לספק ערך מוגבל לסינון חומרים מתכלים.
מאמר זה מציג ודן בשלוש שיטות תרבות שונות, כלומר, שיטת תרבות ישירה, שיטת תרבות חשיפה ישירה ושיטת תרבות חשיפה להערכת תאימות במבחנה של חומרי שתל מתכלים מתכלים, כולל פולימרים מתכלים, קרמיקה, מתכות ומרוכבים שלהם, עם סוגי תאים שונים. מחקרים הראו כי שיטות תרבות משפיעות על תגובות התאים לחומרים מתכלים מכיוון שהשפלה הדינמית שלהם גורמת להבדלים מרחביים בממשק ובסביבה המקומית. באופן ספציפי, שיטת התרבות הישירה חושפת את התגובות של תאים שנזרעו ישירות על השתלים; שיטת תרבות החשיפה הישירה מבהירה את התגובות של תאים מארחים מבוססים שבאים במגע עם השתלים; ושיטת תרבות החשיפה מעריכה את התאים המארחים שנקבעו שאינם נמצאים במגע ישיר עם השתלים אך מושפעים מהשינויים בסביבה המקומית עקב התדרדרות השתל.
מאמר זה מספק דוגמאות לשלוש שיטות תרבית אלה לחקר הציות במבחנה של חומרי שתל מתכלים והאינטראקציות שלהם עם תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (BMSCs). הוא גם מתאר כיצד לקצור, מעבר, תרבות, זרע, זרע, לתקן, כתם, לאפיין את התאים, ולנתח מדיה וחומרים פוסט תרבותיים. שיטות הפריה חוץ גופית המתוארות במאמר זה מחקות תרחישים שונים של סביבת in vivo , הרחבת הישימות והרלוונטיות של בדיקות ציטו-תאימות במבחנה של ביו-חומרים שונים עבור יישומים ביו-רפואיים שונים.
במשך עשרות שנים, חומרים מתכלים נחקרו בהרחבה ונעשה בהם שימוש ביישומים ביו-רפואיים כגון יישומים אורתופדיים כגון אורתופדיים 1,2, שיניים, 3,4, ו craniomaxillofacial5 יישומים. שלא כמו שתלים וחומרים קבועים, מתכות מתכלות, קרמיקה, פולימרים ומרוכבים שלהם בהדרגה להתפרק בגוף לאורך זמן באמצעות תגובות כימיות שונות בסביבה הפיזיולוגית. לדוגמה, מתכות מתכלות כגון סגסוגות מגנזיום (מ"ג)1,6,7 ואבץ (Zn) סגסוגות8,9 הם חומרים מבטיחים עבור מכשירי קיבוע עצם. ההתכלות שלהם יכולה לבטל את הצורך בניתוחים משניים כדי להסיר את השתלים לאחר ריפוי העצם. קרמיקה מתכלה כגון מלט סידן פוספט (CPCs) הראו פוטנציאל מרגש לטיפול בשברים דחיסת חוליות אוסטאופורוטית בקיפופלסטיקה מלעורית10. ה- CPCs מספקים תמיכה מכנית לגוף החוליות השבור ומתפרקים בהדרגה לאחר שהשבר החלים.
פולימרים מתכלים, כגון כמה פוליסכרידים ופוליאסטרים, נחקרו גם הם בהרחבה עבור יישומים ביו-רפואיים. לדוגמה, הידרוג'ל צ'יטוסן כפוליסכריד מתכלה הפגין את יכולותיו למניעת זיהום והתחדשות רקמת העור11. חומצה פולי-L-לקטית (PLLA), פולי(חומצה גליקולית) (PGA) וחומצה פולי(לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) נחקרות באופן נרחב עבור ייצור פיגומים נקבוביים דו-ממדיים או תלת-ממדיים עבור יישומי הנדסת רקמות12,13,144. יתר על כן, חומרים מרוכבים לשלב שני שלבים או יותר של מתכות, קרמיקה, ופולימרים כדי לספק פונקציות מתקדמות עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים15,16,17. לדוגמה, PLGA וסידן פוספט מרוכבים ניתן להשתמש כדי לפברק פיגומים מתכלים עבור יישומים כגון תיקון פגמים עצם הגולגולת18. פיגומים ושתלים מתכלים אלה יכולים לתמוך ולקדם את הצמיחה של תאים ורקמות ולאחר מכן בהדרגה להתפרק בגוף לאורך זמן.
כפי שמוצג בטבלה משלימה 1, חומרים מתכלים שונים עשויים להיות בעלי מנגנוני השפלה, מוצרים ותעריפים מגוונים. לדוגמה, סגסוגות מגנזיום, כגון Mg-2 wt % Zn-0.5 wt % Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19, ו Mg-9 wt% Al-1 wt% אבץ (AZ91)20, להתפרק על ידי תגובה עם מים, ומוצרי השפלה שלהם כוללים בעיקר Mg2 + יונים, OH- יונים, גז H2, ותצהירים מינרליים. שיעור ההשפלה של מתכות מתכלות משתנה בהתאם להרכבים, הגיאומטריות וסביבות ההשפלה השונות שלהן. לדוגמה, Cipriano et al.19 דיווח כי חוטי ZSr41 (Ø1.1 × 15 מ"מ) איבדו 85% מסה בעוד חוטי Mg טהורים עם אותה גיאומטריה איבדו 40% מסה לאחר שהושתלו בשוקה החולדה במשך 47 ימים. חומרים קרמיים מתכלים כגון הידרוקסיאפטיט (HA) ופוספט β-טריקלציום (β-TCP) יכולים להתפרק באמצעות פירוק נוזלי חוץ-תאי מונחה פתרון או להתפרק לחלקיקים קטנים ולאחר מכן להתפרק באמצעות פירוק נוזלים חוץ-תאיים ותהליכי ספיגה בתיווך תאים. מוצרי השפלה של קרמיקה מבוססת סידן פוספט אלה עשויים לכלול Ca2 + יונים, (PO4)3- יונים, OH- יונים, תצהירים מינרליים21. שיעור ההשפלה עבור קרמיקה סידן פוספט מושפע באופן משמעותי על ידי מבני הגביש שלהם. לדוגמה, ואן Blitterswijk et al.22 דיווח כי HA עם 40 vol.% micropores לא לאבד שום מסה בעוד β-TCP עם 40 vol.% מיקרופוריות איבדו 30 ± 4% מסה לאחר שהושתל בשוקה של ארנבות במשך 3 חודשים. פולימרים כגון PLGA14,23 עלולים להתפרק עקב הידרוליזה של הצמדות אסתר בנוכחות מים, ומוצרי השפלה כוללים בעיקר חומצות לקטיות וגליקוליות. זה יכול לקחת חודש אחד עבור PLGA 50/50 וכמה חודשים עבור PLGA 95/5 כדי להשיג השפלה מלאה24.
תגובה תאית ובדיקות תאימות הן קריטיות להערכה וסינון של חומרי שתל מתכלים אלה עבור יישומים ביו-רפואיים. עם זאת, הסטנדרטים הנוכחיים של הארגון הבינלאומי לתקנות (ISO), כגון ISO 10993-5:2009 "הערכה ביולוגית של מכשירים רפואיים-חלק 5 בדיקות עבור ציטוטוקסיות במבחנה", תוכננו בתחילה כדי להעריך את הציטוטוקסיות של ביו-חומרים מתכלים כגון סגסוגות Ti וסגסוגות Cr-Co במבחנה25. באופן ספציפי, ISO 10993-5:2009 מכסה רק את בדיקות הציטוטוקסיות במבחנה של התמצית, מגע ישיר, ובדיקות מגע עקיפות. בבדיקת התמצית, התמצית מוכנה על ידי טבילת דגימות בנוזלי מיצוי כגון מדיה תרבותית עם סרום ופתרונות מלוחים פיזיולוגיים תחת אחד מתנאי הזמן והטמפרטורה הסטנדרטיים. התמצית או הדילול שנאספו מתווספים לאחר מכן לתרבות התא כדי ללמוד ציטוטוקסיות. עבור בדיקת מגע ישיר, מגע ישיר בין מדגם ותאים מושגת על ידי הצבת דגימת הבדיקה על שכבת התא הוקמה (דבק). במבחן המגע העקיף, מדיה התרבות המכילה סרום אגר מומס הוא pipetted כדי לכסות את התאים שנקבעו. לאחר מכן המדגם ממוקם על שכבת אגר המוצקה עם או בלי מסנן.
תקני ISO הראו מגבלות מסוימות כאשר מוחלים על הערכת חומרים מתכלים במבחנה. שלא כמו חומרים בלתי מתכלים, התנהגויות ההשפלה של חומרים מתכלים הן דינמיות ועשויות להשתנות בזמן אחר או בתנאים סביבתיים מגוונים (למשל, טמפרטורה, לחות, הרכב מדיה וסוג תא). בדיקת התמצית רק מעריכה את הציטוטוקסיות של תוצרי השפלה של החומר ואינה משקפת את התהליך הדינמי של השפלה מדגם. בדיקות מגע ישירות ועקיפות של תקן ISO מאפיינות רק את האינטראקציות בין התאים והדגימות שנקבעו. יתר על כן, במבחן המגע העקיף, החומרים והתאים נמצאים במיקרו-סביבה שונים שאינם משקפים את סביבת in vivo ואינם לוכדים את ההשפלה הדינמית של חומרים מתכלים.
מטרת מאמר זה היא להציג ולדון בשיטות בדיקת הציטו-תאימות לחומרי שתל מתכלים שונים כדי לטפל במגבלות הנ"ל של השיטות המתוארות בתקני ISO הנוכחיים. השיטות המוצגות במאמר זה מתייחסות להתנהגות ההשפלה הדינמית של חומרי השתלה ולנסיבות השונות של אינטראקציות בין תאים לחומרים ב- vivo. באופן ספציפי, מאמר זה מספק שלוש שיטות לבדיקת ציטושים, כלומר תרבות ישירה, תרבות חשיפה ישירה ותרבות חשיפה לחומרים מתכלים שונים, כולל פולימרים מתכלים, קרמיקה, מתכות ומרוכבים שלהם ליישומי שתלים רפואיים.
בשיטת התרבות הישירה, תאים התלויים בתקשורת התרבות נזרעים ישירות על הדגימות, ובכך מעריכים את האינטראקציות בין תאים חדשים שנזרעו לבין השתלים. בתרבית החשיפה הישירה, הדגימות ממוקמות ישירות על שכבת התא שנקבעה כדי לחקות את האינטראקציות של שתלים עם תאים מארחים מבוססים בגוף. בתרבית החשיפה, הדגימות ממוקמות בתוספות הבאר שלהם ולאחר מכן מוצגות לבארות התרבות עם תאים מבוססים, המאפיינים את התגובות של תאים מבוססים לשינויים בסביבה המקומית הנגרמים על ידי השפלת שתל כאשר אין להם מגע ישיר עם שתלים. התרבות הישירה ושיטות תרבית החשיפה הישירה מעריכות את התאים במישרין או בעקיפין במגע עם חומרי השתל באותה תרבות היטב. תרבית החשיפה מאפיינת את התאים במגע עקיף עם חומרי השתל במרחק שנקבע באותה תרבות היטב.
מאמר זה מציג תיאור מפורט של בדיקות הציטו-תאימות לחומרים מתכלים שונים והאינטראקציות שלהם עם תאי מודל, כלומר, תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (BMSCs). הפרוטוקולים כוללים קצירה, פולחן, זריעה, תיקון, הכתמה והדמיה של התאים, יחד עם ניתוחים של חומרים פוסט-תרבותיים ומדיה, החלים על מגוון חומרי שתל מתכלים ומגוון רחב של סוגי תאים. שיטות אלה שימושיות לסינון חומרים מתכלים עבור יישומים ביו-רפואיים שונים במונחים של תגובות תאים וציות במבחנה.
פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה בריברסייד (UCR) לקצירת תאים ורקמות. חולדת ספראג-דולי (SD) בת 12 שבועות מוצגת כדוגמה בסרטון. נקבות צעירות יותר ועכברושים זכרים עדיפים.
1. הכנה לתרבות התא
הערה: שלוש שיטות התרבות המתוארות במאמר זה ישימות בדרך כלל עבור סוגי תאים שונים התואמים. כאן, BMSCs שנקטפו מגמילה חולדה יוצגו כדוגמה להכנת תרבית תאים. בהתאם לרלוונטיות שלהם עבור יישומים רפואיים ספציפיים, סוגים שונים של תאים עשויים להיות מנוצלים, כולל תאים ראשוניים שנקטפו מבעלי חיים או תורמים אנושיים וקווי תאים מבנק תאים / רקמות.
2. הכנה ועיקור מדגם
3. שיטות תרבית תאים
4. אפיון פוסט-תרבותי של תאים
הערה: לתרבות ישירה ולתרבית חשיפה ישירה, תקן, כתם, תמונה וניתח את התאים הנדבקים הן בלוחות והן בדגימות. לתרבית החשיפה, נתחו את התאים שנדבקו ללוחות הבאר.
5. ניתוחים פוסט-תרבותיים של מדיה ודגימות
איור 4 מציג את תמונות הפלואורסצנטיות הייצוגיות של BMSCs בתנאי מגע ישירים ועקיפים באמצעות שיטות תרבות שונות. איור 4A,B מציג את חומצות BMSCs בתנאי מגע ישירים ועקיפים לאחר אותה תרבות ישירה של 24 שעות עם סגסוגות מגנזיום ZC21111. סגסוגות ZC21 מורכבות מ-9...
שיטות שונות של תרבית תאים יכולות לשמש כדי להעריך את ציטו-תאימות במבחנה של ביו-חומרים של עניין עבור היבטים שונים של יישומים ב vivo. מאמר זה מדגים שלוש שיטות תרבות הפריה חוץ גופית , כלומר תרבות ישירה, תרבות חשיפה ישירה ותרבות חשיפה, כדי לחקות תרחישים שונים של vivo שבהם נעשה שימ?...
למחברים אין ניגודי עניינים.
המחברים מעריכים את התמיכה הכספית של הקרן הלאומית למדע של ארה"ב (פרס NSF CBET 1512764 ו- NSF PIRE 1545852), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH NIDCR 1R03DE028631), מלגת הפיתוח של הפקולטה לפקולטה לריג'נטים באוניברסיטת קליפורניה (UC) והוועדה למענק זרעי מחקר (Huinan Liu), ומענק מחקר עבודת הדוקטורט של UC-ריברסייד (Jiajia Lin). המחברים מעריכים את המתקן המרכזי למיקרוסקופיה מתקדמת ומיקרואנליזה (CFAMM) באוניברסיטת קליפורניה ריברסייד לשימוש ב- SEM / EDS וד"ר פרי צ'ונג לשימוש במכשירי XRD. המחברים מעריכים גם את תאן וי נגוין וקוויני שו על עריכה חלקית. המחברים גם רוצים להודות לסינדי לי על הקלטת הקריינות לסרטון. כל הדעות, הממצאים והמסקנות, או ההמלצות המובעות במאמר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את השקפותיהם של הקרן הלאומית למדע או המכונים הלאומיים לבריאות.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
18 G needle | BD | 305196 | |
25½ G needle | BD | 305122 | |
4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | Optima 8000 | |
Optical microscope | VWR | VistaVision | |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
pH meter | VWR | model SB70P | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
surgical blade | VWR | 76353-728 | |
Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
Transwell inserts | Corning | 3460 | |
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved