JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים שלוש שיטות של תרבות ישירה, תרבות חשיפה ישירה ותרבות חשיפה להערכת תאימות במבחנה של חומרי שתל מתכלים מתכלים. שיטות הפריה חוץ גופית אלה מחקות אינטראקציות שונות של שתל תא vivo וניתן ליישם אותן כדי ללמוד חומרים מתכלים שונים.

Abstract

במהלך העשורים האחרונים, חומרים מתכלים נחקרו בהרחבה עבור יישומים ביו-רפואיים כגון שתלים אורתופדיים, דנטליים וקרניומקסיופסיאליים. כדי לסנן חומרים מתכלים עבור יישומים ביו-רפואיים, יש צורך להעריך חומרים אלה במונחים של תגובות תא במבחנה , ציטוקי תאימות, ו ציטוטוקסיות. תקני הארגון הבינלאומי לתקנון (ISO) נוצלו באופן נרחב בהערכת ביו-חומרים. עם זאת, רוב תקני ISO נקבעו במקור כדי להעריך את הציטוטוקסיות של חומרים שאינם מתכלים, ובכך לספק ערך מוגבל לסינון חומרים מתכלים.

מאמר זה מציג ודן בשלוש שיטות תרבות שונות, כלומר, שיטת תרבות ישירה, שיטת תרבות חשיפה ישירה ושיטת תרבות חשיפה להערכת תאימות במבחנה של חומרי שתל מתכלים מתכלים, כולל פולימרים מתכלים, קרמיקה, מתכות ומרוכבים שלהם, עם סוגי תאים שונים. מחקרים הראו כי שיטות תרבות משפיעות על תגובות התאים לחומרים מתכלים מכיוון שהשפלה הדינמית שלהם גורמת להבדלים מרחביים בממשק ובסביבה המקומית. באופן ספציפי, שיטת התרבות הישירה חושפת את התגובות של תאים שנזרעו ישירות על השתלים; שיטת תרבות החשיפה הישירה מבהירה את התגובות של תאים מארחים מבוססים שבאים במגע עם השתלים; ושיטת תרבות החשיפה מעריכה את התאים המארחים שנקבעו שאינם נמצאים במגע ישיר עם השתלים אך מושפעים מהשינויים בסביבה המקומית עקב התדרדרות השתל.

מאמר זה מספק דוגמאות לשלוש שיטות תרבית אלה לחקר הציות במבחנה של חומרי שתל מתכלים והאינטראקציות שלהם עם תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (BMSCs). הוא גם מתאר כיצד לקצור, מעבר, תרבות, זרע, זרע, לתקן, כתם, לאפיין את התאים, ולנתח מדיה וחומרים פוסט תרבותיים. שיטות הפריה חוץ גופית המתוארות במאמר זה מחקות תרחישים שונים של סביבת in vivo , הרחבת הישימות והרלוונטיות של בדיקות ציטו-תאימות במבחנה של ביו-חומרים שונים עבור יישומים ביו-רפואיים שונים.

Introduction

במשך עשרות שנים, חומרים מתכלים נחקרו בהרחבה ונעשה בהם שימוש ביישומים ביו-רפואיים כגון יישומים אורתופדיים כגון אורתופדיים 1,2, שיניים, 3,4, ו craniomaxillofacial5 יישומים. שלא כמו שתלים וחומרים קבועים, מתכות מתכלות, קרמיקה, פולימרים ומרוכבים שלהם בהדרגה להתפרק בגוף לאורך זמן באמצעות תגובות כימיות שונות בסביבה הפיזיולוגית. לדוגמה, מתכות מתכלות כגון סגסוגות מגנזיום (מ"ג)1,6,7 ואבץ (Zn) סגסוגות8,9 הם חומרים מבטיחים עבור מכשירי קיבוע עצם. ההתכלות שלהם יכולה לבטל את הצורך בניתוחים משניים כדי להסיר את השתלים לאחר ריפוי העצם. קרמיקה מתכלה כגון מלט סידן פוספט (CPCs) הראו פוטנציאל מרגש לטיפול בשברים דחיסת חוליות אוסטאופורוטית בקיפופלסטיקה מלעורית10. ה- CPCs מספקים תמיכה מכנית לגוף החוליות השבור ומתפרקים בהדרגה לאחר שהשבר החלים.

פולימרים מתכלים, כגון כמה פוליסכרידים ופוליאסטרים, נחקרו גם הם בהרחבה עבור יישומים ביו-רפואיים. לדוגמה, הידרוג'ל צ'יטוסן כפוליסכריד מתכלה הפגין את יכולותיו למניעת זיהום והתחדשות רקמת העור11. חומצה פולי-L-לקטית (PLLA), פולי(חומצה גליקולית) (PGA) וחומצה פולי(לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) נחקרות באופן נרחב עבור ייצור פיגומים נקבוביים דו-ממדיים או תלת-ממדיים עבור יישומי הנדסת רקמות12,13,144. יתר על כן, חומרים מרוכבים לשלב שני שלבים או יותר של מתכות, קרמיקה, ופולימרים כדי לספק פונקציות מתקדמות עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים15,16,17. לדוגמה, PLGA וסידן פוספט מרוכבים ניתן להשתמש כדי לפברק פיגומים מתכלים עבור יישומים כגון תיקון פגמים עצם הגולגולת18. פיגומים ושתלים מתכלים אלה יכולים לתמוך ולקדם את הצמיחה של תאים ורקמות ולאחר מכן בהדרגה להתפרק בגוף לאורך זמן.

כפי שמוצג בטבלה משלימה 1, חומרים מתכלים שונים עשויים להיות בעלי מנגנוני השפלה, מוצרים ותעריפים מגוונים. לדוגמה, סגסוגות מגנזיום, כגון Mg-2 wt % Zn-0.5 wt % Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19, ו Mg-9 wt% Al-1 wt% אבץ (AZ91)20, להתפרק על ידי תגובה עם מים, ומוצרי השפלה שלהם כוללים בעיקר Mg2 + יונים, OH- יונים, גז H2, ותצהירים מינרליים. שיעור ההשפלה של מתכות מתכלות משתנה בהתאם להרכבים, הגיאומטריות וסביבות ההשפלה השונות שלהן. לדוגמה, Cipriano et al.19 דיווח כי חוטי ZSr41 (Ø1.1 × 15 מ"מ) איבדו 85% מסה בעוד חוטי Mg טהורים עם אותה גיאומטריה איבדו 40% מסה לאחר שהושתלו בשוקה החולדה במשך 47 ימים. חומרים קרמיים מתכלים כגון הידרוקסיאפטיט (HA) ופוספט β-טריקלציום (β-TCP) יכולים להתפרק באמצעות פירוק נוזלי חוץ-תאי מונחה פתרון או להתפרק לחלקיקים קטנים ולאחר מכן להתפרק באמצעות פירוק נוזלים חוץ-תאיים ותהליכי ספיגה בתיווך תאים. מוצרי השפלה של קרמיקה מבוססת סידן פוספט אלה עשויים לכלול Ca2 + יונים, (PO4)3- יונים, OH- יונים, תצהירים מינרליים21. שיעור ההשפלה עבור קרמיקה סידן פוספט מושפע באופן משמעותי על ידי מבני הגביש שלהם. לדוגמה, ואן Blitterswijk et al.22 דיווח כי HA עם 40 vol.% micropores לא לאבד שום מסה בעוד β-TCP עם 40 vol.% מיקרופוריות איבדו 30 ± 4% מסה לאחר שהושתל בשוקה של ארנבות במשך 3 חודשים. פולימרים כגון PLGA14,23 עלולים להתפרק עקב הידרוליזה של הצמדות אסתר בנוכחות מים, ומוצרי השפלה כוללים בעיקר חומצות לקטיות וגליקוליות. זה יכול לקחת חודש אחד עבור PLGA 50/50 וכמה חודשים עבור PLGA 95/5 כדי להשיג השפלה מלאה24.

תגובה תאית ובדיקות תאימות הן קריטיות להערכה וסינון של חומרי שתל מתכלים אלה עבור יישומים ביו-רפואיים. עם זאת, הסטנדרטים הנוכחיים של הארגון הבינלאומי לתקנות (ISO), כגון ISO 10993-5:2009 "הערכה ביולוגית של מכשירים רפואיים-חלק 5 בדיקות עבור ציטוטוקסיות במבחנה", תוכננו בתחילה כדי להעריך את הציטוטוקסיות של ביו-חומרים מתכלים כגון סגסוגות Ti וסגסוגות Cr-Co במבחנה25. באופן ספציפי, ISO 10993-5:2009 מכסה רק את בדיקות הציטוטוקסיות במבחנה של התמצית, מגע ישיר, ובדיקות מגע עקיפות. בבדיקת התמצית, התמצית מוכנה על ידי טבילת דגימות בנוזלי מיצוי כגון מדיה תרבותית עם סרום ופתרונות מלוחים פיזיולוגיים תחת אחד מתנאי הזמן והטמפרטורה הסטנדרטיים. התמצית או הדילול שנאספו מתווספים לאחר מכן לתרבות התא כדי ללמוד ציטוטוקסיות. עבור בדיקת מגע ישיר, מגע ישיר בין מדגם ותאים מושגת על ידי הצבת דגימת הבדיקה על שכבת התא הוקמה (דבק). במבחן המגע העקיף, מדיה התרבות המכילה סרום אגר מומס הוא pipetted כדי לכסות את התאים שנקבעו. לאחר מכן המדגם ממוקם על שכבת אגר המוצקה עם או בלי מסנן.

תקני ISO הראו מגבלות מסוימות כאשר מוחלים על הערכת חומרים מתכלים במבחנה. שלא כמו חומרים בלתי מתכלים, התנהגויות ההשפלה של חומרים מתכלים הן דינמיות ועשויות להשתנות בזמן אחר או בתנאים סביבתיים מגוונים (למשל, טמפרטורה, לחות, הרכב מדיה וסוג תא). בדיקת התמצית רק מעריכה את הציטוטוקסיות של תוצרי השפלה של החומר ואינה משקפת את התהליך הדינמי של השפלה מדגם. בדיקות מגע ישירות ועקיפות של תקן ISO מאפיינות רק את האינטראקציות בין התאים והדגימות שנקבעו. יתר על כן, במבחן המגע העקיף, החומרים והתאים נמצאים במיקרו-סביבה שונים שאינם משקפים את סביבת in vivo ואינם לוכדים את ההשפלה הדינמית של חומרים מתכלים.

מטרת מאמר זה היא להציג ולדון בשיטות בדיקת הציטו-תאימות לחומרי שתל מתכלים שונים כדי לטפל במגבלות הנ"ל של השיטות המתוארות בתקני ISO הנוכחיים. השיטות המוצגות במאמר זה מתייחסות להתנהגות ההשפלה הדינמית של חומרי השתלה ולנסיבות השונות של אינטראקציות בין תאים לחומרים ב- vivo. באופן ספציפי, מאמר זה מספק שלוש שיטות לבדיקת ציטושים, כלומר תרבות ישירה, תרבות חשיפה ישירה ותרבות חשיפה לחומרים מתכלים שונים, כולל פולימרים מתכלים, קרמיקה, מתכות ומרוכבים שלהם ליישומי שתלים רפואיים.

בשיטת התרבות הישירה, תאים התלויים בתקשורת התרבות נזרעים ישירות על הדגימות, ובכך מעריכים את האינטראקציות בין תאים חדשים שנזרעו לבין השתלים. בתרבית החשיפה הישירה, הדגימות ממוקמות ישירות על שכבת התא שנקבעה כדי לחקות את האינטראקציות של שתלים עם תאים מארחים מבוססים בגוף. בתרבית החשיפה, הדגימות ממוקמות בתוספות הבאר שלהם ולאחר מכן מוצגות לבארות התרבות עם תאים מבוססים, המאפיינים את התגובות של תאים מבוססים לשינויים בסביבה המקומית הנגרמים על ידי השפלת שתל כאשר אין להם מגע ישיר עם שתלים. התרבות הישירה ושיטות תרבית החשיפה הישירה מעריכות את התאים במישרין או בעקיפין במגע עם חומרי השתל באותה תרבות היטב. תרבית החשיפה מאפיינת את התאים במגע עקיף עם חומרי השתל במרחק שנקבע באותה תרבות היטב.

מאמר זה מציג תיאור מפורט של בדיקות הציטו-תאימות לחומרים מתכלים שונים והאינטראקציות שלהם עם תאי מודל, כלומר, תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (BMSCs). הפרוטוקולים כוללים קצירה, פולחן, זריעה, תיקון, הכתמה והדמיה של התאים, יחד עם ניתוחים של חומרים פוסט-תרבותיים ומדיה, החלים על מגוון חומרי שתל מתכלים ומגוון רחב של סוגי תאים. שיטות אלה שימושיות לסינון חומרים מתכלים עבור יישומים ביו-רפואיים שונים במונחים של תגובות תאים וציות במבחנה.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה בריברסייד (UCR) לקצירת תאים ורקמות. חולדת ספראג-דולי (SD) בת 12 שבועות מוצגת כדוגמה בסרטון. נקבות צעירות יותר ועכברושים זכרים עדיפים.

1. הכנה לתרבות התא

הערה: שלוש שיטות התרבות המתוארות במאמר זה ישימות בדרך כלל עבור סוגי תאים שונים התואמים. כאן, BMSCs שנקטפו מגמילה חולדה יוצגו כדוגמה להכנת תרבית תאים. בהתאם לרלוונטיות שלהם עבור יישומים רפואיים ספציפיים, סוגים שונים של תאים עשויים להיות מנוצלים, כולל תאים ראשוניים שנקטפו מבעלי חיים או תורמים אנושיים וקווי תאים מבנק תאים / רקמות.

  1. קצירת BMSCs מגמילה מעכברושים
    הערה: הדיאגרמה השרטוטית באיור 1 מציגה את השלבים לקציר BMSCs מגמילה מעכברושים.
    1. המתת חסד החולדה Sprague דולי (SD) על ידי שאיפת CO2 .
    2. הסר את העור והשרירים ורקמות החיבור כדי לנתח את עצם הירך מתוך החולדה המתת חסד. מניחים את עצמות הירך בצינור חרוטי 15 מ"ל (פוליפרופילן) המכיל מדיום תרבית תאים. מניחים את הצינורות החרוטיים על קרח עד למועד ביצוע חילוץ התא.
      הערה: שוקה יכולה לשמש גם כדי לקצור BMSCs. מדיום תרבית התאים הוא מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S).
    3. מעבירים את העצמות לצלחת פטרי בארון הבטיחות הביולוגי. חותכים את קצות העצם באמצעות להב כירורגי ולשטוף את מוח העצם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל (פוליפרופילן) על ידי שטיפת חלל מח העצם עם מדיה תרבית התא באמצעות מזרק עם מחט 251/2 G.
      הערה: הכנס מזרק עם מחט של 18 גרם למדיה עם מח עצם. לאט ובעדינות, לקחת ולחלק את המדיה כדי לשבור את הנתח הגדול של מח העצם עד שאין תאים גלויים / רקמה agglomerates נוכחים.
    4. לסנן את ההשעיה התא באמצעות מסנן 70 מיקרומטר, ואחריו צנטריפוגה ב 126 × גרם (1,000 סל"ד) במשך 5 דקות כדי לקבל את כדורי התא.
    5. שאפו את המדיה העל-טבעית וחידשו עם 10 מ"ל של מדיה טרייה. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי resuspend התאים באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל.
    6. פיפטה המתלה ישירות בחלק התחתון הפנימי של בקבוקון T-75 ולהוסיף מדיה כדי להביא את עוצמת הקול עד 25 מ"ל. תרבית את התאים באינקובטור בסביבת תרבית תאים סטרילית סטנדרטית (כלומר, 37 מעלות צלזיוס, אטמוספרה לחה עם 5% CO2 ו-95% אוויר).
    7. לאחר 3-7 ימים, לשטוף את התאים שאינם טהורים על ידי שאיפה המדיום הישן וחידוש עם מדיום טרי. המשך להקדיש ולהאכיל את התאים במדיום טרי עד שיהיו מוכנים למעבר תאים, הקפאה או שימוש בניסוי.
  2. תחזוקת תאים
    1. שנה את מדיום תרבית התא באופן קבוע כדי להסיר מוצרי פסולת תאית ולחדש את החומרים המזינים בערך כל יומיים עד שהתאים הם 90%-100% יחד. ב 90% מפגש, מעבר, להקפיא, או להשתמש בתאים בניסוי.
    2. תאים חולפים
      הערה: Passaging, המכונה גם תת-תרבות, הוא מונח החל בכל פעם שתאים מועברים מתרבות אחת לאחרת. תאים שנקטפו זה עתה נמצאים בשלב המעבר 0 (P0). הכמויות של פתרון חומצה טריפסין-אתילנדימינטטראצטט (טריפסין-EDTA) ומדיה המתוארת במאמר זה הן עבור בקבוקון T-75.
      1. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר כי התאים הם 90% יחד.
      2. שאפו את המדיום מבקבוק התא.
      3. יש לפזר 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) לתוך הבקבוקון באמצעות פיפטה סרולוגית. בעדינות לטלטל את הבקבוק כדי לשטוף את התאים עם PBS; לשאוף את כל PBS.
        הערה: שלב זה משמש כשטיפה נוספת כדי להבטיח שלא יועברו תאים מתים או פסולת תאית במהלך המעבר.
      4. יש לפזר 3 מ"ל של טריפסין-EDTA לתוך בקבוקון התא ישירות על פני השטח של התאים. נענעו בעדינות את הבקבוקון כדי להבטיח שכל פני השטח עם התאים מכוסים על ידי הטריפסין-EDTA.
      5. מניחים את בקבוקון התא עם טריפסין-EDTA לתוך האינקובטור במשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק.
      6. לאחר 5 דקות באינקובטור, בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר כי התאים מנותקים. אם חלק מהתאים לא התנתקו, הקישו בעדינות על הצד של בקבוקון התא ובדקו שוב את הבקבוקון.
      7. הוסיפו 9 מ"ל של מדיום טרי לבקבוקון התא כדי לדלל את הטריפסין-EDTA. זה מספק חלבונים נגישים יותר עבור טריפסין-EDTA להיקשר במקום lysing התאים.
      8. פיפטה את התאים במדיה טריפסין-EDTA ולחלק אותם לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה התאים ב 126 × גרם (1,000 סל"ד) במשך 5 דקות.
      9. מבלי להפריע לכדור התא, שאפו את המדיום עם טריפסין-EDTA.
      10. הוסיפו 5-10 מ"ל של מדיה טרייה לצינור הצנטריפוגה והוסיפו בעדינות את התאים במדיום באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
      11. פיפטה התאים תלויים בינוני מתוך צינור הצנטריפוגה לפצל את הנפח לתוך 2-3 בקבוקונים תרבית טריים. הוסף מספיק בינוני כדי להביא את הנפח הבינוני הכולל ל-25 מ"ל עבור כל בקבוקון.
        הערה: יחס הפיצול במהלך תת-תרבות עשוי להשתנות בהתאם לסוגי התאים ולמאפייני הצמיחה הספציפיים.
      12. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי והחזר אותם לאינקובטור.
    3. הקפאת תאים
      1. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר כי התאים הם 90% יחד.
      2. חזור על שלבים 1.2.2.2 עד 1.2.2.9.
      3. הוסף 900 μL של בינוני טרי לצינור הצנטריפוגה עם 100-1000 μL micropipette. לאט ובעדינות מחדש תאים במדיום באמצעות אותה מיקרופיפט.
      4. העבר את ההשעיה תא 900 μL לתוך cryovial. הוסף 100 μL של דימתילסולפוקסיד (DMSO).
      5. בהקדם האפשרי, למקם את cryovial לתוך מיכל קצף גלילי שנועד לווסת את ירידת הטמפרטורה (ראה את טבלת החומרים). מניחים את מיכל הקצף במקפיא -80 °C (80 °F).
    4. הפשרת תאים
      1. להפשיר את התאים הקפואים באמבט המים. קח צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל מלא 5 מ"ל של בינוני טרי, למקם את התאים בצינור החרוטי, וצנטריפוגה ב 126 × גרם (1,000 סל"ד) במשך 5 דקות.
      2. שאפו את המדיום המכיל את DMSO.
      3. הוסף 5-10 מ"ל של מדיום טרי לצינור החרוטי 15 מ"ל של תאים. לאט ובעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי respend התאים.
      4. פיפטה התאים תלויים בינוני מתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ולחלק לתוך בקבוקון T-75 חדש. בעת חלוקת תאים, השתמש בתנועה גורפת כדי להפיץ את התאים באופן שווה ככל האפשר בתחתית בקבוקון התא.
      5. הוסיפו מספיק מדיום טרי כדי להביא את הנפח הבינוני הכולל ל-25 מ"ל עבור כל בקבוק T-75.
      6. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי והנח את בקבוקון התא בחזרה לתוך האינקובטור.

2. הכנה ועיקור מדגם

  1. הכנה לדוגמה
    1. השתמש בלוחות שטופלו בתרבית רקמות כגון לוחות שטופלו בתרבית רקמות כגון 6, 12, 24, 48 או 96 well עבור ניסויים בתרבית תאים המתוארים במאמר זה. בחר את סוג לוחות תרבית הרקמות ואת נפח המדיום בכל באר בהתבסס על עיצובים ניסיוניים שונים כגון ממד מדגם.
  2. לחטא או לחטא את כל הדגימות המתכלות לפני תרבית התא.
    הערה: חיטוי מקובל עבור in vitro מחקרים כאשר הדגימות נוטות לשינויים כימיים ו/או פני השטח בתנאי עיקור מסוימים הכוללים חום גבוה, חמצון ו/או רדיקלים. שיטות עיקור או חיטוי עבור סוגי מדגמים שונים משתנות בהתאם למאפיינים השונים של החומרים, כגון פולימרים, מתכות וקרמיקה. תהליך העיקור או החיטוי יכול לכלול חום, גז, קרינה, כימיקלים, לחץ גבוה או שילוב של אלה.
    1. מתכות מתכלות
      1. באופן כללי, השתמש בקרינה אולטרה סגולה (UV) לחיטוי מתכות מתכלות למחקרי הפריה חוץ גופית .
        הערה: לדוגמה, ג'אנג ואח ' דיווח כי מגנזיום טהור (מ"ג) ו ZC21 דגימות סגסוגת מ ג עברו חיטוי תחת קרינת UV במשך 4 שעות לפני שהם נוצלו במחקרי התא1. עבור במחקרים vivo , הדגימות נדרשות בדרך כלל להיות מעוקר. עבור מתכות מתכלות רבות כגון מגנזיום או סגסוגות מגנזיום, יש להימנע משעבוד אוטומטי באמצעות קיטור מכיוון שדגימות אלה יכולות להיות מחומצנות או חלודות במים6. צלחת קוורץ מומלצת לחיטוי UV מכיוון שהיא מספקת שקיפות UV טובה יותר מרוב הכוסות והפלסטיק.
      2. לחטא דגימות סגסוגת Mg תחת חום יבש בתנור או autoclave בטווח הטמפרטורה של 100-200 °C (600 °F).
        הערה: כמו כמה סגסוגות מתכתיות עדיין יכול להיות מחומצן על פני השטח בטמפרטורות גבוהות באוויר, קרינה בעוצמה גבוהה עשוי לשמש כחלופה במקרים מסוימים. עם זאת, קרינה בעוצמה גבוהה כגון קרינת אלפא או גמא יש להימנע בעת עיקור רדידים מתכתיים דקים. זה עלול לגרום תזוזת אטום בתוך החומרים, שינוי המבנה הזעיר של חומרים.
      3. השתמש עיקור גז תחמוצת אתילן (EtO) כשיטה חלופית למתכות מתכלות רגישות לחום וקרינה26.
    2. קרמיקה מתכלה
      1. בדרך כלל, לחטא קרמיקה מתכלה באמצעות קרינת UV או 70% פתרון אתנול לפני מחקרי הפריה חוץ גופית .
        הערה: לדוגמה, ליו ואח ' דיווח כי דגימות סידן פוספט היו מחוטאים באמצעות טבילה 70% אתנול עבור 1 שעה וחשיפה לאור UV במשך 12 שעות בכל צד לפני שהם שימשו במבחן vitro ציטו תאימות27.
      2. השתמש autoclaves כדי לחטא קרמיקה מתכלה אם טמפרטורה גבוהה אדי מים אינם פוגעים קומפוסטים שלהם מיקרו מבנים.
        הערה: חלק מהקרמיקה עשויה להיות מושפעת מהליכה אוטומטית. לדוגמה, שינוי פאזה וגסות פני השטח נמצאו כאשר קרמיקה זירקוניה מיוצבת yttria היו autoclaved ב 121 °C (60 °F) במשך 15 דקות. בנוסף, לא ניתן לעקר CPCs באמצעות autoclaving עם קיטור כי הדגימות יגיבו עם מים.
      3. השתמש בשיטות עיקור חלופיות כגון קרינת קובלט-60 עבור קרמיקת זירקוניה המיוצבת לעיל ודגימות CPC28.
    3. פולימרים מתכלים
      1. באופן כללי, לחטא פולימרים מתכלים באמצעות קרינת UV או 70% אתנול לפני השימוש בהם במחקרי תאים במבחנה.
        הערה: פולימרים מסוימים עשויים לעבור שינויים כימיים תחת קרינת UV. עבור עיקור, טיפול קרני גמא כגון קרינת קובלט-60 עשוי לשמש. לדוגמה, אבקות עמילן עוקרו תחת קרינת קובלט-60 לפני שנעשה בהם שימוש במחקרי אין ויטרו תאים29.
      2. חומרים פולימריים אוטומטיים שיכולים לעמוד בטמפרטורה ולחות גבוהות.
        הערה: לדוגמה, פולימרים כגון פוליפרופילן יכולים להיות autoclaved כפי שהם יכולים לסבול טמפרטורות autoclaving (כלומר, 121-134 °C (65 °F). פולימרים מסוימים כגון polycaprolactone (PCL) לא ניתן autoclaved בגלל נקודות ההיתוך הנמוכות יחסית שלהם (כלומר, סביב 60 °C)30.
      3. השתמש בגז EtO כדי לחטא חומרים פולימריים רגישים לחיטוי חום או קרינה.

3. שיטות תרבית תאים

  1. שיטות תרבות ישירה
    הערה: הדיאגרמה הסכמטית באיור 2A מציגה את שלבי שיטת התרבות הישירה. במאמר זה, BMSCs היו תרבית על צלחת נגזר Mg להציב בתוך הבארות של צלחת 12-well-תרבות רקמות מטופלים כדוגמה כדי להמחיש את שיטת התרבות.
    1. בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.2.2.1-1.2.2.10 כדי לקבל את ההשעיה הסלולרית.
    2. השתמש בקבוקון 90% confluent כדי לקבוע את ריכוז התא בהשעיית התא באמצעות hemocytometer. לדלל את ההשעיה התא באמצעות בינוני טרי לריכוז התא שנקבע הדרוש למחקר התא במבחנה.
      הערה: צפיפות הזריעה של תאים נקבעת על ידי התכנון הניסיוני. לדוגמה, צפיפות תאים של 2,000-40,000 תאים / cm2 שימשו במחקרי תאים שונים עם חומרים מתכלים.
    3. מניחים את הדגימות (צלחת Mg) במרכז לוחות תרבית רקמות מטופלים היטב. ברצף, לשטוף את לוחות התרבות עם 2 מ"ל של PBS ו 2 מ"ל של DMEM כדי לכייל את הלחץ האוסמוטי בתנאים סטריליים. הוסף 3 מ"ל של השעיית התא המדולל לתוך כל באר על דגימות של עניין.
    4. תרבית התאים באינקובטור בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות.
      הערה: זמן התרבות עשוי להיות ארוך או קצר יותר מ- 24 שעות בהתאם לעיצוב הניסיוני.
  2. תרביות חשיפה ישירה
    הערה: הדיאגרמה הסכמטית באיור 2B מציגה את השלבים של תרבות החשיפה הישירה.
    1. כפי שמתואר בשלבים 3.1.1.1 ו 3.1.2, להכין את ההשעיה התא עם הריכוזים הנדרשים של תאים המבוססים על העיצוב הניסיוני עבור סוגי תאים שונים ויישומים מיועדים.
    2. יש לשטוף את לוחות התרבות עם 2 מ"ל של PBS ו-2 מ"ל של DMEM ברצף כדי לכייל את הלחץ האוסמוטי בתנאים סטריליים. הוסף 3 מ"ל של השעיית התא המדולל לתוך כל באר. תרבית התאים באינקובטור הלח בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים במשך 24 שעות או עד שהתאים מגיעים למפגש של 50-80%.
      הערה: רמת המפגש בין התאים עשויה להשתנות עבור סוגי תאים שונים ועיצוב ניסיוני.
    3. לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים בצלחת הבאר עם PBS באמצעות פיפטה כדי להסיר תאים מתים צפים.
    4. מניחים את הדגימות המחוטאות או המעוקרות ישירות על התאים הדבוקים. מוסיפים 3 מ"ל של מדיום טרי לתוך כל באר.
    5. תרבית את התאים בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות נוספות.
      הערה: זמן התרבות עשוי להיות ארוך או קצר יותר מ- 24 שעות בהתאם לעיצוב הניסיוני.
  3. תרביות חשיפה
    הערה: הדיאגרמה השרטוטית באיור 2C מציגה את שלבי שיטת תרבות החשיפה.
    1. השלבים הראשוניים להכנת התא זהים לתרבות החשיפה. כמתואר בשלבים 3.1.1 ו 3.1.2, להכין את השעיית התא עם התאים הרצויים. בדומה לשלבים 3.2.1 ו 3.2.2, זרעו את התאים בצלחת הבאר בצפיפות הרצויה ותרבית אותם בחממה בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות.
    2. לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים דבקים עם PBS כדי להסיר תאים מתים צפים, ואחריו תוספת של 3 מ"ל של מדיום טרי לתוך כל באר.
    3. לאחר מכן, מניחים את הדגימות בתוספות באר עם גודל נקבובית ממברנה של 0.4 מיקרומטר ומניחים את התוספות היטב עם הדגימות לתוך כל באר עם התאים.
    4. תרבית את התאים בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות נוספות.
      הערה: זמן התרבות עשוי להיות ארוך או קצר יותר מ- 24 שעות בהתאם לעיצוב הניסיוני.

4. אפיון פוסט-תרבותי של תאים

הערה: לתרבות ישירה ולתרבית חשיפה ישירה, תקן, כתם, תמונה וניתח את התאים הנדבקים הן בלוחות והן בדגימות. לתרבית החשיפה, נתחו את התאים שנדבקו ללוחות הבאר.

  1. קיבוע תאים
    1. לאסוף את המדיום postculture מכל באר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המתאים לניתוח נוסף. לאסוף את כל הדגימות לאחר התרבות לניתוח נוסף.
    2. לשטוף את התאים דבק על שתי דגימות וצלחות היטב 3 פעמים באמצעות PBS.
    3. הוסף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA, 10% פורמלין חוצץ נייטרלי) לתוך כל צלחת באר. שים את המכסה בחזרה על צלחת הבאר ולאפשר PFA להגיב במשך 20 דקות.
    4. לאחר 20 דקות, לשאוף PFA ולחלק אותו לתוך בקבוק פסולת. לשטוף את צלחת הבאר 3 פעמים באמצעות PBS כדי להסיר את PFA, ולהעביר את הפסולת לבקבוק הפסולת.
  2. כתמי תאים
    1. הכן את מלאי העבודה של סוכני הכתמים בהתאם להוראות היצרנים.
      הערה: לדוגמה, Alexa Fluor 488 Phalloidin משמש להכתמת F-actin, ו 4′, 6-diamidino-2-פנילינדולה (DAPI) משמש להכתמת גרעיני תאים. זמן ההכתמה עשוי להצטמצם אם הדגימות מתפרקות במהירות בתמיסות ההכתמה.
    2. הוסף 200-400 μL של אלקסה פלואור מדולל 488 Phalloidin מכתים סוכן לכל באר כדי לכסות את התאים על צלחת הבאר ואת המדגם. לעטוף את צלחת הבאר בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור, ולאפשר Alexa Fluor 488 Phalloidin להגיב במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לאסוף את Alexa פלואור 488 Phalloidin מכתים סוכן ולחלק אותו לתוך בקבוק הפסולת המתאים. לשטוף את צלחת הבאר 3 פעמים באמצעות PBS כדי להסיר את עודף Alexa Fluor 488 Phalloidin, ולחלק את PBS בשימוש לתוך בקבוק הפסולת המתאים.
    4. הוסף 200-400 μL של DAPI מדולל לכל באר כדי לכסות את התאים בבאר ועל המדגם. לעטוף את צלחת הבאר בנייר אלומיניום ולאפשר DAPI להגיב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. לאסוף את DAPI ולחלק אותו לתוך בקבוק הפסולת המתאים. לשטוף את צלחת הבאר 3 פעמים באמצעות PBS כדי להסיר את DAPI, ולחלק את PBS בשימוש לתוך בקבוק הפסולת המתאים.
  3. הדמיה סלולרית
    1. לאחר ההכתמה, דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. במידת האפשר, צלמו תמונות ניגודיות פאזה של תאים בנוסף לתמונות פלואורסצנטיות. דמיינו את התאים על הדגימות המתכלות בהקדם האפשרי או מיד לאחר ההכתמה כדי למנוע או להפחית שינויים אפשריים הנגרמים על ידי השפלה מתמשכת של דגימות. אחסן את התאים בלוחות הבאר בתמיסת חיץ בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס לאחר הקיבעון, וצלם את התאים בהקדם האפשרי לאחר ההכתמה כדי למנוע אובדן אותות פלואורסצנטיים.
    2. עבור תרבות ישירה ותרבות חשיפה ישירה, דמיינו והעריכו שני סוגי תאים: (1) התאים על הדגימות (במגע ישיר עם הדגימות) ו-(2) התאים הנדבקים בלוח הבאר המקיף את הדגימות (מגע עקיף עם הדגימות), כפי שמוצג באיור 3A.
    3. לתרבות החשיפה, כפי שמוצג באיור 3B, השתמשו במדריך תמונה בעת צילום תמונות הפלואורסצנטיות של תאים כדי לקבוע אם תגובת התא תהיה שונה בתגובה למעבר ההשפלה הדינמי של הדגימות. צלם וניתח את התאים הממוקמים באזור בתוך הטבעת הפנימית (במרחק של 3.5 מ"מ מהמרכז) ואת הטבעת החיצונית (במרחק של 7 מ"מ מהמרכז) בנפרד.
      הערה: מדריך התמונה משמש להגדרת המרחק בין התאים והדגימות.
    4. עבור כל דגימה וגם בלוחות התרבות, צלם באופן אקראי לפחות חמש תמונות מכל אזור מעניין שבו התאים נמצאים במגע ישיר או במגע עקיף עם הדגימות במרחק מוגדר מראש.
  4. ניתוח תמונה
    1. עבור כל תמונות התא המתקבלות משלב 4.3, כימת את המורפולוגיה של התא על-ידי מדידת אזור התפשטות התא ויחס הגובה-רוחב באמצעות תוכנה כגון ImageJ לניתוח תמונה.
    2. ספור את מספר התאים בכל אזור תמונה. חשב את צפיפות ההדבקה בתא בתנאי מגע ישירים ועקיפים כמספר התאים ליחידת שטח.

5. ניתוחים פוסט-תרבותיים של מדיה ודגימות

  1. מדוד את ה- pH של מדיום פוסט-תרבותי.
    הערה: דגימות מסוימות משנות את ערך ה- pH של המדיום במהלך השפלתן. לדוגמה, מתכות מתכלות כגון סגסוגות מגנזיום בדרך כלל להגדיל את ערך ה- pH של המדיום בשל השפלה שלהם31. לעומת זאת, פולימרים מתכלים כגון PLGA לעתים קרובות להקטין את ערך ה- pH של המדיום כאשר הם משפילים 32. מדידת ערך ה- pH של מדיום פוסט-תרבותי יכולה להצביע על השפלה של דגימות אלה במבחנה.
    1. לפני קיבוע תאים, לאסוף את המדיום פוסט-תרבותי כמו בשלב 4.1.1.
    2. מדוד את ערכי ה- pH של מדיום הפוסט-תרבותי בכל באר מיד לאחר האיסוף, באמצעות מד pH מכויל מראש.
      הערה: ה- pH של התקשורת עלול להיסחף לאורך זמן בגלל תנאים סביבתיים כגון רמת CO2 וטמפרטורה, אשר יש לקחת בחשבון.
  2. לנתח את הרכבים בינוניים עבור התנהגות השפלה של דגימות מתכלות. עבור דגימות מסוימות הגורמות לשינוי צבע של המדיום, מדוד את ערך הצפיפות האופטית (O.D.) של המדיום שלאחר התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר או קורא מיקרופלט כדי לקבוע את התנהגות ההשפלה. לחלופין, יש להשתמש בספקטרוסקופיה גלויה אולטרה סגולה (UV-VIS) וב-Fourier transform infrared spectroscopy-מוחלשת של רפלקטוריה כוללת (FTIR-ATR) כדי לנתח את מוצרי ההשפלה במדיום הפוסט-תרבותי.
    הערה: מדידת מוצרי השפלה במדיום שלאחר התרבות היא בעלת ערך להבנת התנהגות ההשפלה של הדגימות. אחת הגישות הנפוצות ביותר היא למדוד את יוני העניין במדיום הפוסט-תרבותי באמצעות ספקטרומטר פליטת פלזמה אופטית מצמידה אינדוקטיבית (ICP-OES). ניתן להשתמש ב- ICP-OES כדי למדוד את הרכבי המדיום הפוסט-תרבותי של מתכות וקרמיקה, אך ייתכן שאינו מתאים לפולימרים. פולימרים מורכבים בדרך כלל מפחמן, מימן וחמצן, וכימות מדויק של יסודות אלה קשה עבור ICP-OES.
    1. לאחר שלב 5.1.2 למדידת pH, לאסוף ולדלל את המדיום באמצעות גורם דילול רצוי למדידות אופטימליות של ריכוזי יונים.
    2. מדוד את הריכוזים של יונים של עניין במדיום שלאחר התרבות באמצעות ICP-OES.
  3. ניתוח פוסט-תרבותי של דגימות
    הערה: לאחר מחקר תאי הפריה חוץ גופית , הדגימות המתכלות עשויות להשתנות בממד, במסה, במורפולוגיה של פני השטח, במיקרו-מבנה ובהרכב. ניתוח פוסט-תרבותי של דגימות מסייע להבין את מנגנון ההשפלה של דגימות.
    1. לאחר תרבית התא, צלם את תצלומי הדגימות כדי להציג שינויים אפשריים בממד המדגם, בצבע, במורפולוגיה ובמאפיינים גלויים אחרים.
    2. יבש או ייבש את דגימות הפוסט-תרבותיות ומדוד את מסת המדגם, הממד והנפח כדי לכמת כל שינוי במסה, בממד ובנפח.
    3. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לאפיין את המיקרו-מבנה והמורפולוגיה של הדגימות. השתמש ספקטרוסקופיה רנטגן פיזור אנרגיה (EDX) ו עקיפה רנטגן (XRD) כדי לאפיין את ההרכב ואת השלב של מוצרי השפלה על הדגימות. השתמש FTIR-ATR כדי לזהות את מליטה כימית על משטחי המדגם.

תוצאות

איור 4 מציג את תמונות הפלואורסצנטיות הייצוגיות של BMSCs בתנאי מגע ישירים ועקיפים באמצעות שיטות תרבות שונות. איור 4A,B מציג את חומצות BMSCs בתנאי מגע ישירים ועקיפים לאחר אותה תרבות ישירה של 24 שעות עם סגסוגות מגנזיום ZC21111. סגסוגות ZC21 מורכבות מ-9...

Discussion

שיטות שונות של תרבית תאים יכולות לשמש כדי להעריך את ציטו-תאימות במבחנה של ביו-חומרים של עניין עבור היבטים שונים של יישומים ב vivo. מאמר זה מדגים שלוש שיטות תרבות הפריה חוץ גופית , כלומר תרבות ישירה, תרבות חשיפה ישירה ותרבות חשיפה, כדי לחקות תרחישים שונים של vivo שבהם נעשה שימ?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

המחברים מעריכים את התמיכה הכספית של הקרן הלאומית למדע של ארה"ב (פרס NSF CBET 1512764 ו- NSF PIRE 1545852), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH NIDCR 1R03DE028631), מלגת הפיתוח של הפקולטה לפקולטה לריג'נטים באוניברסיטת קליפורניה (UC) והוועדה למענק זרעי מחקר (Huinan Liu), ומענק מחקר עבודת הדוקטורט של UC-ריברסייד (Jiajia Lin). המחברים מעריכים את המתקן המרכזי למיקרוסקופיה מתקדמת ומיקרואנליזה (CFAMM) באוניברסיטת קליפורניה ריברסייד לשימוש ב- SEM / EDS וד"ר פרי צ'ונג לשימוש במכשירי XRD. המחברים מעריכים גם את תאן וי נגוין וקוויני שו על עריכה חלקית. המחברים גם רוצים להודות לסינדי לי על הקלטת הקריינות לסרטון. כל הדעות, הממצאים והמסקנות, או ההמלצות המובעות במאמר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את השקפותיהם של הקרן הלאומית למדע או המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL serological pipetteVWR490019-704
12-well tissue-culture-treated platesThermo Fisher Scientific353043
15 mL conical tube (Polypropylene)VWR89039-666
18 G needleBD305196
25½ G needleBD305122
4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI)InvitrogenD3571
50 mL conical tube (Polypropylene)VWR89039-658
70 μm nylon strainerFisher Scientific50-105-0135
Alexa Flour 488-phalloidinLife technologiesA12379
Biological safety cabinetLABCONCOClass II, Type A2
CentrifugeEppendorfRotor F-35-6-30, Centrifuge5430
Clear Fused Quartz Round DishAdValue TechnologyFQ-4085
CO2 incubatorSANYOMCO-19AIC
CoolCell Freezer ContainerCorning432000foam container designed to regulate temperature decrease
CryovialThermo Fisher Scientific5000-1020
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5648
EDX analysis softwareOxford InstrumentsAztecSynergy
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX)FEI50mm2 X-Max50 SDD
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.SH30910
Fluorescence microscopeNikonEclipse Ti
FormaldehydeVWR100496-496
HemacytometerHausser Scientific3520
ImageJ softwareNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)
Inductively coupled plasma
optical emission spectrometry (ICP-OES)		PerkinElmerOptima 8000
Optical microscopeVWRVistaVision
Penicillin/streptomycin (P/S)Thermo Fisher Scientific, Inc.,15070063
pH meterVWRmodel SB70P
Phosphate Buffered Saline (PBS)VWR97062-730
Scanning electronic microscope (SEM)FEINova NanoSEM 450
surgical bladeVWR76353-728
Tissue Culture FlasksVWRT-75, MSPP-90076
Transwell insertsCorning3460
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA)Sigma-AldrichT4049
X-ray diffraction instrument (XRD)PANalyticalEmpyrean Series 2

References

  1. Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
  2. Xu, C., et al. A green biocompatible fabrication of highly porous functional ceramics with high strength and controllable pore structures. Journal of Materials Science & Technology. 32 (8), 729-732 (2016).
  3. Asgari, M., et al. Biodegradable metallic wires in dental and orthopedic applications: a review. Metals. 8 (4), 212 (2018).
  4. Shi, Y., Liu, J., Yu, L., Zhong, L. Z., Jiang, H. B. β-TCP scaffold coated with PCL as biodegradable materials for dental applications. Ceramics International. 44 (13), 15086-15091 (2018).
  5. Wu, C. -. C., et al. A self-reinforcing biodegradable implant made of poly (ɛ-caprolactone)/calcium phosphate ceramic composite for craniomaxillofacial fracture fixation. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery. 44 (9), 1333-1341 (2016).
  6. Jiang, W., et al. In vitro evaluation of MgSr and MgCaSr alloys via direct culture with bone marrow derived mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 72, 407-423 (2018).
  7. Zhang, C., et al. Magnesium-based biodegradable microelectrodes for neural recording. Materials Science and Engineering: C. 110, 110614 (2020).
  8. Jia, B., et al. In vitro and in vivo studies of Zn-Mn biodegradable metals designed for orthopedic applications. Acta Biomaterialia. 108, 358-372 (2020).
  9. Yang, H., et al. Alloying design of biodegradable zinc as promising bone implants for load-bearing applications. Nature Communications. 11 (1), 1-16 (2020).
  10. Liu, H., et al. Injectable, biomechanically robust, biodegradable and osseointegrative bone cement for percutaneous kyphoplasty and vertebroplasty. International Orthopaedics. 42 (1), 125-132 (2018).
  11. Anjum, S., Arora, A., Alam, M., Gupta, B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. International Journal of Pharmaceutics. 508 (1-2), 92-101 (2016).
  12. Barroca, N., et al. Electrically polarized PLLA nanofibers as neural tissue engineering scaffolds with improved neuritogenesis. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167, 93-103 (2018).
  13. Liu, Y., et al. Polydopamine-modified poly (l-lactic acid) nanofiber scaffolds immobilized with an osteogenic growth peptide for bone tissue regeneration. RSC Advances. 9 (21), 11722-11736 (2019).
  14. Liu, H., Webster, T. J. Enhanced biological and mechanical properties of well-dispersed nanophase ceramics in polymer composites: from 2D to 3D printed structures. Materials Science and Engineering: C. 31 (2), 77-89 (2011).
  15. Xu, C., et al. Bioinspired mechano-sensitive macroporous ceramic sponge for logical drug and cell delivery. Advanced Science. 4 (6), 1600410 (2017).
  16. Xu, C., Bai, Y., Yang, H., Yang, L. Mechanically modulated, ultra-high precision logic delivery of molecules by bio-inspired macroporous ceramic sponge. MRS Advances. 2 (19-20), 1125-1130 (2017).
  17. Zhang, N., Xu, C., Azer, A., Liu, H. Dispersibility and characterization of polyvinyl alcohol-coated magnetic nanoparticles in poly (glycerol sebacate) for biomedical applications. Journal of Nanoparticle Research. 21 (12), 1-11 (2019).
  18. Kim, S. S., et al. A poly (lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite scaffold with enhanced osteoconductivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 206-215 (2007).
  19. Cipriano, A. F., et al. Degradation of bioresorbable Mg-4Zn-1Sr intramedullary pins and associated biological responses in vitro and in vivo. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (51), 44332-44355 (2017).
  20. Surmeneva, M. A., et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cell response to the RF magnetron sputter deposited hydroxyapatite coating on AZ91 magnesium alloy. Materials Chemistry and Physics. 221, 89-98 (2019).
  21. Sheikh, Z., et al. Mechanisms of in vivo degradation and resorption of calcium phosphate based biomaterials. Materials. 8 (11), 7913-7925 (2015).
  22. Klein, C., Driessen, A., De Groot, K., Van den Hooff, A. Biodegradation behavior of various calcium phosphate materials in bone tissue. Journal of Biomedical Materials Research. 17 (5), 769-784 (1983).
  23. Lanao, R. P. F., Leeuwenburgh, S. C., Wolke, J. G., Jansen, J. A. Bone response to fast-degrading, injectable calcium phosphate cements containing PLGA microparticles. Biomaterials. 32 (34), 8839-8847 (2011).
  24. Vey, E., et al. Degradation kinetics of poly (lactic-co-glycolic) acid block copolymer cast films in phosphate buffer solution as revealed by infrared and Raman spectroscopies. Polymer Degradation and Stability. 96 (10), 1882-1889 (2011).
  25. Standard, I. Biological evaluation of medical devices-Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Geneve, Switzerland: International Organization for Standardization. , (2009).
  26. Liu, X., Zhou, W., Wu, Y., Cheng, Y., Zheng, Y. Effect of sterilization process on surface characteristics and biocompatibility of pure Mg and MgCa alloys. Materials Science and Engineering: C. 33 (7), 4144-4154 (2013).
  27. Liu, H., Yazici, H., Ergun, C., Webster, T. J., Bermek, H. An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 4 (5), 1472-1479 (2008).
  28. Liu, H., et al. Enhancing effects of radiopaque agent BaSO4 on mechanical and biocompatibility properties of injectable calcium phosphate composite cement. Materials Science and Engineering: C. 116, 110904 (2020).
  29. Xu, C., et al. A versatile three-dimensional foam fabrication strategy for soft and hard tissue engineering. Biomedical Materials. 13 (2), 025018 (2018).
  30. Speranza, V., Sorrentino, A., De Santis, F., Pantani, R. Characterization of the polycaprolactone melt crystallization: complementary optical microscopy, DSC, and AFM studies. The Scientific World Journal. , 720157 (2014).
  31. Cipriano, A. F., et al. Anodization of magnesium for biomedical applications-Processing, characterization, degradation and cytocompatibility. Acta Biomaterialia. 62, 397-417 (2017).
  32. Li, H., Chang, J. pH-compensation effect of bioactive inorganic fillers on the degradation of PLGA. Composites science and technology. 65 (14), 2226-2232 (2005).
  33. Xu, C., Hung, C., Cao, Y., Liu, H. H. Tunable crosslinking, reversible phase transition, and 3D printing of hyaluronic acid hydrogels via dynamic coordination of innate carboxyl groups and metallic ions. ACS Applied Bio Materials. 4 (3), 2408-2428 (2021).
  34. Cortez Alcaraz, M. C., et al. Electrophoretic deposition of magnesium oxide nanoparticles on magnesium: processing parameters, microstructures, degradation, and cytocompatibility. ACS Applied Bio Materials. 2 (12), 5634-5652 (2019).
  35. Rutherford, D., et al. Synthesis, characterization, and cytocompatibility of yttria stabilized zirconia nanopowders for creating a window to the brain. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 108 (3), 925-938 (2020).
  36. Tian, Q., Deo, M., Rivera-Castaneda, L., Liu, H. Cytocompatibility of magnesium alloys with human urothelial cells: a comparison of three culture methodologies. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (9), 1559-1571 (2016).
  37. Nguyen, T., Cipriano, A., Guan, R. G., Zhao, Z. Y., Liu, H. In vitro interactions of blood, platelet, and fibroblast with biodegradable magnesium-zinc-strontium alloys. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2974-2986 (2015).
  38. Jiang, W., Lin, J., Chen, A. H., Pan, J., Liu, H. A portable device for studying the effects of fluid flow on degradation properties of biomaterials inside cell incubators. Regenerative Biomaterials. 6 (1), 39-48 (2019).
  39. Tian, Q., et al. Responses of human urothelial cells to magnesium-zinc-strontium alloys and associated insoluble degradation products for urological stent applications. Materials Science and Engineering: C. 96, 248-262 (2019).
  40. Wetteland, C. L., Liu, H. Optical and biological properties of polymer-based nanocomposites with improved dispersion of ceramic nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (10), 2692-2707 (2018).
  41. Wetteland, C. L., Nguyen, N. -. Y. T., Liu, H. Concentration-dependent behaviors of bone marrow derived mesenchymal stem cells and infectious bacteria toward magnesium oxide nanoparticles. Acta Biomaterialia. 35, 341-356 (2016).
  42. Aoi, W., Marunaka, Y. The importance of regulation of body fluid pH in the development and progression of metabolic diseases. Advances in Medicine and Biology. 77, 177-189 (2014).
  43. Wang, H. . Hydroxyapatite degradation and biocompatibility. , (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182BMSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved