产生来自多能干细胞的自组装人心脏类器官

摘要

在这里，我们描述了一种方案，通过自组织有效地使用人类多能干细胞来创建与发育相关的人类心脏类器官（hHO）。该协议依赖于发育线索的顺序激活，并产生高度复杂，功能相关的人体心脏组织。

摘要

研究人类心脏在健康和疾病中发育的能力受到 在体外模拟人类心脏复杂性的能力的高度限制。开发更有效的器官样平台，可以模拟复杂的 体内 表型，如类器官和器官芯片，将增强研究人类心脏发育和疾病的能力。本文描述了一种方案，通过使用人类多能干细胞的自组织和使用小分子抑制剂逐步激活发育途径来产生高度复杂的人心脏类器官（hHO）。胚胎体（EB）在具有圆底，超低附着孔的96孔板中产生，促进个体化结构的悬浮培养。

EB通过三步Wnt信号调节策略分化为hHO，该策略涉及初始Wnt通路激活以诱导心脏中胚层命运，第二步Wnt抑制以创建确定的心脏谱系，以及第三个Wnt激活步骤以诱导心前器官组织。这些步骤以96孔的形式进行，效率高，可重复，每次运行产生大量类器官。通过免疫荧光成像从第3天到第11天的分化分析揭示了第15天hHO内的第一和第二心场规格和高度复杂的组织，包括具有心房和心室心肌细胞区域的心肌组织，以及衬有心内膜组织的内腔。类器官还在整个结构和心外膜组织的外衬里中表现出复杂的血管网络。从功能的角度来看，hHO具有强大的水平，并表现出由Flu-4活体成像确定的正常钙活性。总体而言，该协议构成了人体器官样心脏组织 体外 研究的坚实平台。

引言

先天性心脏缺陷（CHDs）是人类最常见的先天性缺陷类型，影响约1%的活产^1，2，3。在大多数情况下，冠心病的原因仍然未知。在实验室中创建与发育中的人类心脏非常相似的人类心脏模型的能力是直接研究人类而不是代孕动物模型中CHDs的根本原因的重要一步。

实验室培养的组织模型的缩影是类器官，类似于细胞组成和生理功能中感兴趣的器官的3D细胞结构。类器官通常来自干细胞或祖细胞，并已成功用于模拟许多器官，如脑^4，5，肾⁶，⁷，肠^8，9，肺^10，11，肝脏^12，13和胰腺^14，15，仅举几例。最近的研究表明，创造自组装心脏类器官在体外研究心脏发育是可行的。这些模型包括使用小鼠胚胎干细胞（mESCs）对早期心脏发育^{进行建模16，17}直至房室规格¹⁸，并使用人类多能干细胞（hPSCs）来生成具有高度复杂细胞组成的多生殖层心内胚类器官¹⁹和腔室心形^体20。

本文提出了一种新颖的3步WNT调制方案，以高效且具有成本效益的方式生成高度复杂的hHO。类器官在96孔板中生成，从而形成一个可扩展的高通量系统，可以轻松自动化。该方法依赖于创建hPSC聚集体并触发心脏发生的发育步骤，包括中胚层和心脏中胚层形成，第一和第二心场规范，心前器官形成和房室规范。分化15天后，hHO包含心脏中发现的所有主要细胞谱系，明确定义的内腔，心房和心室腔以及整个类器官的血管网络。这种高度复杂且可重复的心脏类器官系统适合在心脏发育，疾病和药理学筛查研究中研究结构，功能，分子和转录组学分析。

研究方案

1. hPSC培养与维护

注意:人诱导的PSCs（hiPSCs）或人胚胎干细胞（hESCs）在解冻后需要培养至少连续传代2次，然后才能用于产生EB进行分化或进一步冷冻保存。hPSCs在PSC培养基（见 材料表）中基底膜 - 细胞外基质（BM-ECM）包被的6孔培养板上培养。当在6孔板中的hPSCs上进行培养基更换时，将培养基直接添加到孔的内侧，而不是直接在细胞顶部，以防止不必要的细胞脱离或应激。用户应警惕不应在37°C下加热的预热PSC介质;该协议中使用的所有PSC介质都是耐高温的。

1. 要用BM-ECM涂覆孔板，请在冰上解冻一个等分试样的BM-ECM（根据制造商的说明储存在-20°C），并将0.5mg的BM-ECM与12 mL冷的Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM）/ F12培养基（储存在4°C下）混合。将2mL的DMEM / F12-BM-ECM混合物分配到6孔板的每个孔上，并在37°C下孵育至少2小时。
2. 为了解冻细胞，首先，在37°C的珠子或水浴中解冻hPSC冷冻管1-2分钟，直到只有少量的冰可见。将解冻的细胞转移到离心管中，缓慢加入8-9mL补充有2μMROCK抑制剂噻唑维素（噻唑嗪）的PSC培养基，并以300× g 离心5分钟。除去上清液并将细胞沉淀重悬于补充有2μM噻唑的PSC培养基中。根据冷冻细胞浓度将培养基中的细胞分配到1-2个孔中，并在37°C，5%CO ₂ 下培养24小时，然后更换PSC培养基。
3. 每隔48小时更换细胞上的培养基。分别使用 DMEM/F12（1 mL/孔）和 PSC 培养基（2 mL/孔）进行洗涤和培养基更换。
   注意:洗涤有助于去除细胞废物和碎屑，而新鲜的培养基变化为细胞提供了新的营养来源。
4. 通过吸气培养基在亚汇合（60-80%汇合）时使细胞通过，然后用1mL的1x Dulbecco的磷酸盐缓冲溶液（无钙，无镁;DPBS）。吸出DPBS并加入1mL用于hPSCs的解离试剂（见 材料表），然后在10秒后抽吸除试剂薄膜以外的所有试剂。
5. 用hPSCs解离试剂的薄膜孵育2-5分钟，直到细胞之间形成间隙。
   注意:停止解离的时间取决于细胞系。
6. 向孔中加入1mL补充有2μM噻唑（PSC培养基+噻唑）的PSC培养基，轻轻敲击板以诱导细胞脱离。将分离的细胞移液至培养基中1-2次以分解任何大菌落，并以1:6孔比例将细胞重悬于PSC培养基+噻嗪中（来自1孔的细胞重悬于12mL培养基中）。将细胞重新放在BM-ECM包被的孔上。

2. 生成3D自组装人心脏类器官

1. 胚胎体（EB）形成:
   注意:在胚胎样体形成之前，必须限制可观察到的分化细胞。汇合度为60-80%的6孔板的两到三孔将产生足够的细胞用于单个96孔类器官板。在进行任何培养基变化之前，所有培养基均应等分并在37°C的微珠或水浴中加热，以尽量减少对EB或类器官的温度冲击（这不包括细胞解离试剂）。参见 图1A，B。
   1. 第-2天
      1. 为了产生EB，在第-2天，将亚汇合的hPSCs（60-80%汇合）与DPBS洗涤至少10秒，以洗涤任何细胞碎片并吸出DPBS。
      2. 为了分离细胞并将其释放到单细胞状态，向每个孔中加入1mL室温细胞解离试剂（见 材料表）3-6分钟。每分钟轻轻敲击板约5次，以诱导脱离，同时在显微镜下检查。加入1 mL PSC培养基+噻唑以停止反应。
      3. 为了收集细胞并分解任何剩余的聚集体，在孔中上下移取培养基2-3次以产生单细胞悬浮液。将单细胞悬浮液转移到离心管中，并在300× g下旋转5分钟。
      4. 为了获得所需的细胞浓度，弃去上清液并将细胞重悬于1mL PSC培养基+噻嗪中。使用细胞计数器或血细胞计数器计数细胞，并将PSC培养基+噻唑中的细胞稀释至100，000个细胞/ mL的浓度。
      5. 为了分配细胞以形成EB，使用多通道移液器向圆底超低连接96孔板的每个孔中加入100μL（10，000个细胞）。将板以100× g 离心3分钟，并在37°C，5%CO 2下孵育₂₄小时。
   2. 第-1天
      1. 小心地从每个孔中取出50μL培养基，并加入200μL升温至37°C的新鲜PSC培养基，以达到每孔250μL的最终体积。将细胞在37°C，5%CO 2下孵育₂₄小时。
         注意:小心地取出并添加孔侧的介质，以避免干扰孔底部的EB。由于EB的微妙性质和悬浮培养物，在更换培养基时，有必要在每个孔中留下少量液体，以避免干扰EB。
2. 人心脏类器官 （hHO） 分化:
   注:在更换任何介质之前，所有培养基均应在37°C的珠子或水浴中加热。小心地取出并在孔的侧面添加培养基，以避免干扰孔底部发育中的类器官。在介质更换之间不需要洗涤，以尽量减少搅拌并允许逐渐去除抑制剂和生长因子。在整个分化方案中使用含有2%B-27补充剂的RPMI（材料表）。除非另有说明，否则B-27补充剂含有胰岛素（第0-5天无胰岛素）。参见 图1C。
   1. 第 0 天
      1. 为了开始向中胚层谱系的分化，从每个孔中除去166μL培养基（约占总孔体积的2/3^）， 并加入166μL含有无胰岛素B-27补充剂的RPMI 1640，6μM CHIR99021，1.875ng / mL骨形态发生蛋白4（BMP4）和1.5ng / mL Activin A，最终孔浓度为4μM CHIR99021， 1.25 ng / mL BMP4和1 ng / mL Activin A.在37°C，5%CO 2下孵育₂₄小时。
   2. 第 1 天
      1. 从每个孔中取出166μL培养基，加入166μL新鲜RPMI 1640和无胰岛素B-27补充剂。在37°C，5%CO 2下孵育₂₄小时。
   3. 第 2 天
      1. 为了诱导心脏中胚层规格，从每个孔中取出166μL培养基，并加入166μL含有无胰岛素B-27补充剂的RPMI 1640和3μM Wnt-C59，最终孔浓度为2μM Wnt-C59_。
   4. 第 4 天
      1. 从每个孔中取出166μL培养基，加入166μL新鲜RPMI 1640和无胰岛素B-27补充剂。在37°C，5%CO ₂下孵育48小时。
   5. 第 6 天
      1. 从每个孔中取出166μL培养基，加入166μLRPMI 1640和B-27补充剂。在37°C，5%CO 2下孵育₂₄小时。
   6. 第 7 天
      1. 为了诱导心前分化，从每个孔中取出166μL培养基，并加入166μL含有B-27补充剂的新鲜RPMI 1640和3μM CHIR99021，最终孔浓度为2μM CHIR99021。在37°C，5%CO ₂下孵育1小时。
      2. 从每个孔中取出166μL培养基，并加入166μL含有B-27补充剂的新鲜RPMI 1640。在37°C，5%CO ₂下孵育48小时。
         注意:在第7天的第二次培养基更换时，建议格外小心，因为由于培养基的变化，类器官更容易运动。
      3. 从第7天开始，直到收集或转移用于分析或实验，每48小时进行一次培养基更换，从每个孔中取出166μL培养基，并加入166μL含有B-27补充剂的新鲜RPMI 1640。
         注意:类器官在第15天准备好进行分析和实验，除非对早期发育阶段感兴趣。它们可以在第15天之后培养，用于长期培养或成熟实验。

3. 类器官分析

1. 转移整个类器官（活的或固定的）
   注意:对于活体类器官移植，请确保使用的移液器吸头是无菌的。
   1. 将吸头从 P200 移液器吸头上切下，距吸头开口 5-10 mm，从而产生直径约为 2-3 mm 的宽开口。
   2. 将尖端直接插入含有类器官的圆底孔中，使移液器完全垂直（垂直于板）。在将吸头插入介质之前，请确保移液器柱塞已经完全按压。
   3. 缓慢释放移液器柱塞，吸收足够的培养基（100-200μL）以收集类器官。
   4. 将培养基中的类器官转移到目标目的地（例如，用于固定，实时成像，电生理学记录，新板培养）。
2. 固定类器官
   注意:固定和染色类器官可以在96孔培养板或微量离心管中进行。多聚甲醛（PFA）只能在通风橱中处理。
   1. 为了固定在微量离心管中，将活体类器官转移到每管1-8个类器官的分离管中。
      注意:每管不超过8个类器官。
   2. 小心地从管中取出并丢弃尽可能多的培养基，不要接触类器官。
   3. 向每个试管或孔中加入4%PFA（每个微量离心管300-400μL，96孔板每孔100-200μL）。在室温下孵育30-45分钟。
      注意:孵育时间超过1小时可能需要抗原检索步骤，不建议这样做。
   4. 安全地丢弃PFA而不干扰类器官。使用补充有1.5克/升甘氨酸（DPBS/Gly）的DPBS进行3次洗涤，使用与4%PFA相同的体积，在洗涤之间等待5分钟。除去DPBS / Gly并进行免疫染色或其他分析，或加入DPBS并在4°C下储存以备将来使用长达2周。
      注意:储存固定的类器官超过2周可能会导致组织退化和污染，不建议这样做。
3. 全贴合免疫荧光染色
   1. 向含有固定类器官的每个孔或管中加入100μL封闭/透化溶液（10%正常驴血清+ 0.5%牛血清白蛋白（BSA）+ 0.5%Triton X-100，1x DPBS）。在室温下在摇摇杯上孵育过夜。
      注意:每管不超过8个类器官。
   2. 小心地去除并丢弃尽可能多的封闭溶液，不要触摸类器官。用DPBS进行3次洗涤，两次洗涤之间等待5分钟。
   3. 以推荐浓度制备一抗溶液（1%正常驴血清+ 0.5%BSA + 0.5%Triton X-100，1x DPBS）和所需的一抗。在摇床上在4°C孵育24小时。
   4. 小心地取出并丢弃尽可能多的抗体溶液，不要接触类器官。用DPBS进行3次洗涤，两次洗涤之间等待5分钟。
   5. 以推荐浓度制备二抗溶液（1%正常驴血清+ 0.5%BSA + 0.5%Triton X-100，1x DPBS）和所需的二抗。如果抗体是荧光标记的，则在4°C的黑暗中（例如，用铝箔覆盖）在振荡器上孵育24小时。
   6. 小心地取出并丢弃尽可能多的抗体溶液，不要接触类器官。用DPBS进行3次洗涤，两次洗涤之间等待5分钟。
   7. 准备载玻片，将微珠（直径90-300μm）安装在安装介质（参见 材料表）中，靠近将放置带有类器官的盖玻片的边缘。
      注意:建议在继续之前让珠子周围的安装介质干燥;这将防止珠子四处移动。参见 图2。
   8. 使用切割的移液器尖端将染色的类器官转移到载玻片上，在磁珠之间，确保间距以避免在载玻片上一旦类器官之间接触。使用卷起的实验室湿巾的一角小心地去除类器官周围的多余液体。
   9. 用安装清除介质（果糖 - 甘油清除溶液为60%（体积/体积）甘油和2.5M果糖）³⁷ 覆盖类器官，每张载玻片使用120-150μL的安装清除介质。
      注意:使用安装清除介质时，建议使用切割的移液器吸头，因为它非常粘稠。
   10. 将盖玻片悬停在载玻片上，用安装清除溶液覆盖的类器官，然后将盖玻片缓慢地压在载玻片上，确保类器官位于安装的珠子之间。
   11. 使用面漆指甲油密封幻灯片上盖玻片的周边。让载玻片在室温下在黑暗中干燥1小时。在4°C的黑暗中储存以长期储存。
4. 活心脏类器官中的钙瞬时成像
   注:根据制造商的说明，将Fluo4-AM在二甲基亚砜（DMSO）中重组至最终储备溶液浓度为0.5mM。将Fluo4-AM直接添加到96孔板中的类器官孔中。
   1. 使用RPMI 1640培养基对类器官进行2次洗涤。
      1. 从孔中取出166μL用过的培养基。
      2. 加入166μL加热的RPMI 1640培养基，除去166μL培养基，并加入166μL新鲜的RPMI 1640培养基。
         注意:洗涤是为了去除废料和细胞碎屑。在洗涤过程中，从孔中除去三分之二的培养基，以避免在功能测定之前干扰孔底部的类器官。
   2. 将Fluo4-AM培养基加入类器官中。
      1. 将DMSO中复构的Fluo4-AM加入含有B-27补充剂的RPMI 1640中，以制备1.5μM溶液。
      2. 从孔中取出166μL培养基。
      3. 在含有B-27补充剂的RPMI 1640中加入166μL1.5μM氟4-AM，最终孔_浓度为 1μM。
   3. 按照步骤3.4.1进行2次洗涤。
   4. 向孔中加入166μL含有B-27补充剂的RPMI 1640。
   5. 使用P200移液器吸头的切割尖端，将类器官转移到玻璃底培养皿（例如，带有#1.5高性能盖玻片的8孔盖玻片）中，并含有100-200μL培养基。
      注意:参见关于转移整个类器官的第3.1节。
   6. 图像类器官生活在显微镜下，在37°C，5%_CO2的温度和_CO2控制室下。
   7. 在类器官的不同位置录制几个10-20秒的视频，显示钙进入和离开细胞时荧光强度水平的增加和减少。
      注意:对于高分辨率录制，建议以10 fps或更快的速度录制;建议使用 50 fps。
   8. 使用图像分析软件（例如，ImageJ）通过选择感兴趣区域并测量随时间变化的强度水平来分析视频。
   9. 使用 ΔF/_F0 与时间（以毫秒为单位）和绘图对强度记录进行归一化。

结果

为了在体外实现自组织hHO，我们使用Wnt通路调节剂修改和组合了先前描述的心肌细胞²¹和心外膜细胞^22的2D单层分化方案，以及使用生长因子BMP4和Activin A的3D心前类器官¹⁶。，优化了Wnt途径激活剂CHIR99021的浓度和暴露持续时间，以产生来自人类PSC的高度可重复性和复杂的hHO.hPSCs或hESCs在PSC培养基中培养至60-80%的融合在...

讨论

人类干细胞衍生的心肌细胞和其他心脏来源的细胞的最新进展已被用于模拟人类心脏发育^22，24，25 和疾病^26，27，28 ，并作为筛选治疗药物^{的工具29，30} 和有毒物质^31，32

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21202	1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21206	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21203	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21207	1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat	Invitrogen	A32849	1:200
HAND1	Abcam	ab196622	Rabbit; 1:200
HAND2	Abcam	ab200040	Rabbit; 1:200
NFAT2	Abcam	ab25916	Rabbit; 1:100
PECAM1	DSHB	P2B1	Rabbit; 1:50
TNNT2	Abcam	ab8295	Mouse; 1:200
THY1	Abcam	ab133350	Rabbit; 1:200
TJP1	Invitrogen	PA5-19090	Goat; 1:250
VIM	Abcam	ab11256	Goat; 1:250
WT1	Abcam	ab89901	Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase	Innovative Cell Technologies	NC9464543	cell dissociation reagent
Activin A	R&D Systems	338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin)	Gibco	A1895601	insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement	Gibco	17504-044	cell culture supplement
BMP-4	Gibco	PHC9534
Bovine Serum Albumin	Bioworld	50253966
CHIR-99021	Selleck	442310
D-(-)-Fructose	Millipore Sigma	F0127
DAPI	Thermo Scientific	62248	1:1000
Dimethyl Sulfoxide	Millipore Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	10566016
Essential 8 Flex Medium Kit	Gibco	A2858501	pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM	Invitrogen	F14201
Glycerol	Millipore Sigma	G5516
Glycine	Millipore Sigma	410225
Matrigel GFR	Corning	CB40230	Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum	Millipore Sigma	S30-100mL
Paraformaldehyde	MP Biomedicals	IC15014601	Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Solution	Gibco	10010049
Phosphate Buffer Solution (10x)	Gibco	70011044
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	73155	90 µm
ReLeSR	Stem Cell Technologies	NC0729236	dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640	Gibco	11875093
Thiazovivin	Millipore Sigma	SML1045
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Trypan Blue Solution	Gibco	1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H170010
WNT-C59	Selleck	NC0710557
Other
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02682002
15 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	1495970C
2 mL Cryogenic Vials	Corning	13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs	Fisherbrand	13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass	Cellvis	C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates	Costar	07201680
ImageJ	NIH		Image processing software
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	06-666	laboratory wipes
Micro Cover Glass	VWR	48393-241	24 x 50 mm No. 1.5
Microscope Slides	Fisherbrand	1255015
Moxi Cell Counter	Orflo Technologies	MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M	Orflo Technologies	MXC001
Multichannel Pipettes	Fisherbrand	FBE1200300	30-300 µL
Olympus cellVivo	Olympus		For Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004261
Thermal Mixer	ThermoFisher Scientific	13-687-717
Top Coat Nail Varish	Seche Vite		Can purchase from any supermarket