Gerando organoides cardíacos humanos auto-montados derivados de células-tronco pluripotentes

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para criar organoides cardíacos humanos relevantes de desenvolvimento (hHOs) usando eficientemente células-tronco pluripotentes humanas por auto-organização. O protocolo conta com a ativação sequencial de pistas de desenvolvimento e produz tecidos cardíacos humanos altamente complexos e funcionalmente relevantes.

Resumo

A capacidade de estudar o desenvolvimento cardíaco humano em saúde e doença é altamente limitada pela capacidade de modelar a complexidade do coração humano in vitro. O desenvolvimento de plataformas mais eficientes semelhantes a órgãos que podem modelar fenótipos complexos in vivo , como organoides e órgãos em um chip, aumentará a capacidade de estudar o desenvolvimento cardíaco humano e doenças. Este artigo descreve um protocolo para gerar organoides cardíacos humanos altamente complexos (hHOs) por auto-organização usando células-tronco pluripotentes humanas e ativação de caminhos de desenvolvimento stepwise usando inibidores de pequenas moléculas. Os corpos embrionários (EBs) são gerados em uma placa de 96 poços com fundo redondo, poços de fixação ultra-baixo, facilitando a cultura de suspensão de construções individualizadas.

Os EBs sofrem diferenciação em hHOs por uma estratégia de modulação de sinalização WNT de três etapas, que envolve uma ativação inicial da via WNT para induzir o destino do mesoderm cardíaco, um segundo passo da inibição de Wnt para criar linhagens cardíacas definitivas, e um terceiro passo de ativação wnt para induzir tecidos proepicardiais de órgãos. Essas etapas, realizadas em formato de 96 poços, são altamente eficientes, reprodutíveis e produzem grandes quantidades de organoides por execução. A análise por imagens de imunofluorescência do dia 3 ao dia 11 de diferenciação revela especificações de campo cardíaco de primeiro e segundo e tecidos de alta complexidade dentro dos HHOs no dia 15, incluindo tecido miocárdio com regiões de cardiomiócitos atrial e ventricular, bem como câmaras internas forradas com tecido endocardial. Os organoides também exibem uma intrincada rede vascular em toda a estrutura e um revestimento externo de tecido epicártico. Do ponto de vista funcional, os HHOs batem robustamente e apresentam atividade normal de cálcio, conforme determinado pela imagem ao vivo fluo-4. No geral, este protocolo constitui uma plataforma sólida para estudos in vitro em tecidos cardíacos semelhantes a órgãos humanos.

Introdução

Os defeitos cardíacos congênitos (CHDs) são o tipo mais comum de defeito congênito em humanos e afetam aproximadamente 1% de todos os nascidos ^vivos1,2,3. Na maioria das circunstâncias, as razões para os CHDs permanecem desconhecidas. A capacidade de criar modelos de coração humano no laboratório que se assemelham muito ao coração humano em desenvolvimento constitui um passo significativo para estudar diretamente as causas subjacentes dos CHDs em humanos e não em modelos animais substitutos.

O epítome de modelos de tecido cultivados em laboratório são organoides, construções de células 3D que se assemelham a um órgão de interesse na composição celular e função fisiológica. Organoides são frequentemente derivados de células-tronco ou células progenitoras e têm sido usados com sucesso para modelar muitos órgãos como o ^cérebro4,5, ^rim6,7, ^intestino8,9, ^pulmão10,11, ^fígado12,13 e ^{pâncreas14,15} , só para citar alguns. Estudos recentes surgiram demonstrando a viabilidade de criar organoides cardíacos auto-montados para estudar o desenvolvimento cardíaco in vitro. Esses modelos incluem o uso de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) para modelar o desenvolvimento cardíaco ^precoce16,17 até especificações atrioventriculares18 e células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para gerar organoides de endoderme de camada plamífica de camada plamícidos ¹⁹ e cardiodos ^{de câmara20} com composição celular altamente complexa.

Este artigo apresenta um novo protocolo de modulação WNT de 3 passos para gerar hHOs altamente complexos de forma eficiente e econômica. Organoides são gerados em placas de 96 poços, resultando em um sistema escalável e de alta produtividade que pode ser facilmente automatizado. Este método se baseia na criação de agregados de hPSC e no desencadeamento de etapas de desenvolvimento da cardiogênese, incluindo mesodermia e formação de mesoderm cardíaco, especificação de primeiro e segundo campo cardíaco, formação de órgãos proepicardial e especificação atrioventricular. Após 15 dias de diferenciação, os HHOs contêm todas as principais linhagens celulares encontradas no coração, câmaras internas bem definidas, câmaras atrial e ventricular, e uma rede vascular em todo o organoide. Este sistema organoide cardíaco altamente sofisticado e reprodutível é favorável à investigação de análises estruturais, funcionais, moleculares e transcriômicas no estudo do desenvolvimento cardíaco e doenças e rastreamento farmacológico.

Protocolo

1. cultura e manutenção hPSC

NOTA: Os PSCs induzidos por humanos (hiPSCs) ou células-tronco embrionárias humanas (hESCs) precisam ser cultivados por pelo menos 2 passagens consecutivas após o descongelamento antes de serem usados para gerar EBs para diferenciação ou criopreservação. hPSCs são cultivados em meio PSC (ver a Tabela de Materiais) em placas de cultura de 6 poços revestidos de membrana de porão (BM-ECM) revestidos de 6 poços. Ao realizar alterações médias em hPSCs em placas de 6 poços, adicione o meio diretamente ao lado interno do poço, em vez de diretamente em cima das células para evitar o descolamento ou estresse celular indesejado. Os usuários devem ter cuidado com a mídia PSC pré-aquecimento que não deve ser aquecida a 37 °C; todos os meios de PSC usados neste protocolo eram termoestáveis.

1. Para revestir as placas de bem com o BM-ECM, descongele uma alíquota do BM-ECM (armazenado a -20 °C de acordo com as instruções do fabricante) no gelo e misture 0,5 mg do BM-ECM com 12 mL de meio de Águia modificada de Dulbecco (DMEM)/F12 (armazenado a 4 °C). Distribua 2 mL da mistura DMEM/F12-BM-ECM em cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a 37 °C por pelo menos 2 h.
2. Para descongelar as células, primeiro, descongelar o criovial hPSC em uma pérola de 37 °C ou banho de água por 1-2 min até que apenas uma pequena quantidade de gelo seja visível. Transfira as células descongeladas para um tubo de centrífuga e adicione lentamente 8-9 mL do meio PSC suplementado com 2 μM do inibidor de ROCHA, thiazovivin (Thiaz), e centrífuga a 300 × g por 5 min. Remova o supernatante e resuspense a pelota celular no meio PSC complementado com 2 μM de Thiaz. Distribua as células no meio de cultura em 1-2 poços dependendo da concentração e cultura das células criviais a 37 °C, 5% de _CO2 por 24 h antes de mudar o meio PSC.
3. Altere o meio nas células em intervalos de 48h. Realizar lavagens e alterações médias utilizando DMEM/F12 (1 mL/bem) e o meio PSC (2 mL/well), respectivamente.
   NOTA: As lavagens ajudam a remover resíduos e detritos celulares, enquanto as alterações frescas da mídia fornecem às células uma fonte renovada de nutrientes.
4. Passar as células sobre a subconfluência (60-80% confluente) aspirando o meio, depois lavando cada poço com 1 mL de solução tamponada de fosfato de 1x Dulbecco (sem cálcio, sem magnésio; DPBS). Aspire o DPBS e adicione 1 mL do reagente de dissociação para hPSCs (ver a Tabela de Materiais), seguido pela aspiração de todos, exceto uma película fina do reagente após os 10 s.
5. Incubar por 2-5 min com o filme fino do reagente de dissociação para hPSCs até que as lacunas se formem entre as células.
   NOTA: A hora de parar a dissociação é dependente da linha celular.
6. Adicione 1 mL do meio PSC suplementado com 2 μM de Thiaz (meio PSC+Thiaz) ao poço e toque suavemente na placa para induzir o descolamento celular. Pipetizar as células separadas no meio 1-2 vezes para quebrar quaisquer grandes colônias, e resuspende as células em psc médio+Thiaz em uma proporção de poço de 1:6 (células de 1 poço resuspended em 12 mL de meio de cultura). Replate as células em poços revestidos de BM-ECM.

2. Geração de organoides cardíacos humanos auto-montados em 3D

1. Formação do corpo embrionário (EB):
   NOTA: É imprescindível limitar as células diferenciadas observáveis antes da formação do corpo embrionário. Dois a três poços de uma placa de 6 poços a uma confluência de 60-80% produzirão células suficientes para uma única placa de 96 poços de organoides. Todas as mídias devem ser aliquoadas e aquecidas em um banho de 37 °C ou água antes de qualquer alteração média para minimizar o choque de temperatura para os EBs ou organoides (isso não inclui reagentes de dissociação celular). Veja a Figura 1A,B.
   1. Dia -2
      1. Para criar EBs, no dia -2, lave hPSCs subconfluentes (60-80% confluentes) com DPBS por pelo menos 10 s para lavar quaisquer detritos celulares e aspirar o DPBS.
      2. Para desprender as células e liberá-las em um estado de célula única, adicione 1 mL de reagente de dissociação celular de temperatura ambiente (veja a Tabela de Materiais) a cada poço por 3-6 min. Toque suavemente na placa ~5 vezes por minuto para induzir o desprendimento enquanto verifica sob o microscópio. Adicione 1 mL de PSC médio+Thiaz para parar a reação.
      3. Para coletar as células e quebrar quaisquer agregados restantes, pipete a mídia para cima e para baixo no poço 2-3 vezes para gerar uma suspensão unicelular. Transfira a suspensão unicelular para um tubo de centrífuga e gire por 5 min a 300 × g.
      4. Para obter a concentração celular desejada, descarte o sobrenadante e resuspenque as células em 1 mL de PSC médio+Thiaz. Conte as células usando um contador celular ou hemótmetro e dilua as células em PSC médio+Thiaz a uma concentração de 100.000 células/mL.
      5. Para distribuir as células para formação de EB, use uma pipeta multicanal para adicionar 100 μL (10.000 células) a cada poço de uma placa ultra-baixa de fundo redondo de 96 poços. Centrifugar a placa a 100 × g por 3 min e incubar por 24 h a 37 °C, 5% de _CO2.
   2. Dia -1
      1. Remova cuidadosamente 50 μL de meio de cada poço e adicione 200 μL de médio PSC fresco aquecido a 37 °C para alcançar um volume final de 250 μL por poço. Incubar as células por 24 h a 37 °C, 5% de _CO2.
         NOTA: Remova e adicione o meio cuidadosamente na lateral do poço para evitar perturbar os EBs na parte inferior do poço. Devido à natureza delicada dos EBs e à cultura de suspensão, é necessário deixar um pequeno volume de líquido em cada poço ao trocar o meio para evitar perturbar os EBs.
2. Diferenciação do Coração Humano (hHO):
   NOTA: Todos os meios de comunicação devem ser aquecidos em uma conta de 37 °C ou banho de água antes de qualquer alteração de mídia. Remova e adicione o meio cuidadosamente na lateral do poço para evitar perturbar os organoides em desenvolvimento na parte inferior do poço. As lavagens não são necessárias entre as mudanças de mídia para minimizar a agitação e permitir a remoção gradual de inibidores e fatores de crescimento. O RPMI com 2% de suplemento B-27 (Tabela de Materiais) foi utilizado em todo o protocolo de diferenciação. O suplemento B-27 contém insulina a menos que especificado (sem insulina nos dias 0-5). Veja a Figura 1C.
   1. Dia 0
      1. Para iniciar a diferenciação em relação a uma linhagem de mesoderm, remova 166 μL de meio de cada poço (~2/^3º do volume total do poço) e adicione 166 μL de RPMI 1640 contendo suplemento B-27 sem insulina, 6 μM CHIR99021, 1.875 ng/mL proteína morfogenética óssea 4 (BMP4), e 1,5 ng/mL Activin A para uma concentração final de poço de 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/mL BMP4 e 1 ng/mL Activin A. Incubar por 24 h a 37 °C, 5% de _CO2.
   2. Dia 1º
      1. Remova 166 μL de médio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI fresco 1640 com suplemento B-27 sem insulina. Incubar por 24 h a 37 °C, 5% de _CO2.
   3. Dia 2.
      1. Para induzir a especificação do mesoderme cardíaco, remova 166 μL de médio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI 1640 contendo suplemento B-27 sem insulina e 3 μM Wnt-C59 para uma concentração final de 2 μM Wnt-C59. Incubar por 48 h a 37 °C, 5% de _CO2.
   4. Dia 4.
      1. Remova 166 μL de médio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI fresco 1640 com suplemento B-27 sem insulina. Incubar por 48 h a 37 °C, 5% de _CO2.
   5. Dia 6.
      1. Remova 166 μL de meio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI 1640 com suplemento B-27. Incubar por 24 h a 37 °C, 5% de _CO2.
   6. Dia 7.
      1. Para induzir a diferenciação proepicardial, remova 166 μL de meio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B-27 e 3 μM CHIR99021 para uma concentração final de poço de 2 μM CHIR99021. Incubar por 1h a 37 °C, 5% de _CO2.
      2. Remova 166 μL de meio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B-27. Incubar por 48 h a 37 °C, 5% de _CO2.
         NOTA: A cautela extra é aconselhada nesta segunda mudança média no dia 7, pois os organoides são mais propensos ao movimento devido às mudanças na mídia.
      3. A partir do dia 7 até a coleta ou transferência para análises ou experimentações, realize alterações médias a cada 48 h removendo 166 μL de meio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B-27.
         NOTA: Os organoides estão prontos para análises e experimentações no dia 15, a menos que estágios de desenvolvimento anteriores sejam de interesse. Eles podem ser cultivados no último dia 15 para experimentos de cultura ou maturação de longo prazo.

3. Análise organoide

1. Transferência de organoides inteiros (vivos ou fixos)
   NOTA: Para transferência de organoides vivos, certifique-se de que as pontas de pipeta utilizadas são estéreis.
   1. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P200 de 5-10 mm da abertura da ponta, resultando em uma ampla abertura de ~2-3 mm de diâmetro.
   2. Insira a ponta diretamente no poço de fundo redondo contendo o organoide para que a pipeta seja completamente vertical (perpendicular à placa). Certifique-se de que o êmbolo da pipeta já está pressionado até o fim antes de inserir a ponta no meio.
   3. Solte lentamente o êmbolo da pipeta, ocupando o suficiente médio (100-200 μL) para coletar o organoide.
   4. Transfisi o organoide em médio para o destino alvo (por exemplo, para fixação, imagem ao vivo, gravação de eletrofisiologia, nova cultura de placa).
2. Fixação de organoides
   NOTA: Os organoides de fixação e coloração podem ser feitos tanto na placa de cultura de 96 poços quanto nos tubos de microcentrifuuge. Paraformaldeído (PFA) deve ser manuseado apenas em um capô de fumaça.
   1. Para fixação em tubos de microcentrifuge, transfira organoides vivos para tubos separados com 1-8 organoides por tubo.
      NOTA: Não exceda 8 organoides por tubo.
   2. Remova e descarte cuidadosamente o máximo possível do tubo sem tocar nos organoides.
   3. Adicione 4% de PFA a cada tubo ou bem (300-400 μL por tubo de microcentrifus de microcentragem e 100-200 μL por poço de uma placa de 96 poços). Incubar em temperatura ambiente por 30-45 min.
      NOTA: Os tempos de incubação acima de 1h podem exigir etapas de recuperação de antígenos e não são recomendados.
   4. Descarte com segurança o PFA sem perturbar os organoides. Realizar 3 lavagens com DPBS suplementada com 1,5 g/L de glycina (DPBS/Gly), utilizando o mesmo volume utilizado para o PFA de 4%, esperando 5 min entre as lavagens. Remova o DPBS/Gly e prossiga para imunossuagem ou outras análises ou adicione DPBS e armazene a 4 °C para uso futuro por até 2 semanas.
      NOTA: Armazenar organoides fixos por mais de 2 semanas pode resultar em degradação e contaminação do tecido e não é recomendado.
3. Coloração imunofluorescente de montagem inteira
   1. Adicione 100 μL de solução de bloqueio/permeabilização (10% de soro normal de burro + 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) + 0,5% Triton X-100 em 1x DPBS) em cada poço ou tubo contendo os organoides fixos. Incubar à temperatura ambiente durante a noite em um shaker.
      NOTA: Não exceda 8 organoides por tubo.
   2. Remova e descarte cuidadosamente o máximo possível da solução de bloqueio sem tocar nos organoides. Realizar 3 lavagens com DPBS, esperando 5 min entre as lavagens.
   3. Prepare a solução de anticorpos primários (1% soro normal de burro + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 em 1x DPBS) com os anticorpos primários desejados nas concentrações recomendadas. Incubar a 4 °C por 24 h em um shaker.
   4. Remova e descarte cuidadosamente o máximo possível da solução de anticorpos sem tocar nos organoides. Realizar 3 lavagens com DPBS, esperando 5 min entre as lavagens.
   5. Prepare a solução secundária de anticorpos (1% soro normal de burro + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 em 1x DPBS) com os anticorpos secundários desejados nas concentrações recomendadas. Se os anticorpos forem rotulados fluorescentemente, incubar a 4 °C no escuro (por exemplo, coberto de papel alumínio) por 24 h em um agitador.
   6. Remova e descarte cuidadosamente o máximo possível da solução de anticorpos sem tocar nos organoides. Realizar 3 lavagens com DPBS, esperando 5 min entre as lavagens.
   7. Prepare slides com contas (90-300 μm de diâmetro) montadas em um meio de montagem (ver a Tabela de Materiais) perto das bordas do slide onde o deslizamento de cobertura com os organoides será colocado.
      NOTA: Recomenda-se permitir que o meio de montagem ao redor das contas seque antes de prosseguir; isso evitará que as contas se movam. Veja a Figura 2.
   8. Transfira os organoides manchados usando uma ponta de pipeta cortada para o slide, entre as contas, garantindo o espaçamento para evitar o contato entre os organoides uma vez na lâmina. Use o canto de uma limpeza de laboratório enrolada para remover cuidadosamente o excesso de líquido ao redor do organoide.
   9. Cubra os organoides com meio de compensação de montagem (solução de compensação de frutose-glicerol é 60% (vol/vol) glicerol e 2,5 M de frutose)³⁷ utilizando 120-150 μL do meio de montagem por slide.
      NOTA: Recomenda-se usar uma ponta de pipeta cortada ao trabalhar com o meio de limpeza de montagem, pois é muito viscoso.
   10. Passe o deslizamento sobre o slide com os organoides cobertos com solução de limpeza de montagem e pressione lentamente o deslizamento sobre o slide, garantindo que os organoides estejam entre as contas montadas.
   11. Sele o perímetro da mancha de cobertura no slide usando verniz de unha de casaco superior. Deixe o slide secar no escuro à temperatura ambiente por 1h. Armazene a 4 °C no escuro para armazenamento a longo prazo.
4. Imagem transitória de cálcio em organoides cardíacos vivos
   NOTA: De acordo com as instruções do fabricante, o Fluo4-AM foi reconstituído em sulfóxido de dimetila (DMSO) para uma concentração final de solução de estoque de 0,5 mM. Fluo4-AM foi adicionado diretamente ao poço organoide na placa de 96 poços.
   1. Realize 2 lavagens nos organoides utilizando meio RPMI 1640.
      1. Remova 166 μL do meio gasto do poço.
      2. Adicione 166 μL de meio RPMI 1640 aquecido, remova 166 μL de meio e adicione 166 μL de meio RPMI 1640 fresco.
         NOTA: As lavagens são feitas para remover o material residuais e os detritos celulares. Dois terços do meio são removidos dos poços durante as lavagens para evitar perturbar os organoides na parte inferior do poço antes do ensaio funcional.
   2. Adicione fluo4-AM médio aos organoides.
      1. Adicione Fluo4-AM reconstituído em DMSO ao RPMI 1640 contendo suplemento B-27 para preparar uma solução de 1,5 μM.
      2. Remova 166 μL de meio do poço.
      3. Adicione 166 μL de 1,5 μM Fluo4-AM em RPMI 1640 contendo suplemento B-27 para uma concentração final de poço de 1 μM. Incubar a 37 °C, 5% de _CO2 por 30 min.
   3. Realize 2 lavagens como na etapa 3.4.1.
   4. Adicione 166 μL de RPMI 1640 contendo suplemento B-27 ao poço.
   5. Usando uma ponta de corte de uma ponta de pipeta P200, transfira o organoide para uma placa de Petri de fundo de vidro (por exemplo, vidro de cobertura de 8 poços com vidro de cobertura de alto desempenho) com 100-200 μL de meio.
      NOTA: Consulte a seção 3.1 sobre a transferência de organoides inteiros.
   6. Imagem os organoides vivem sob um microscópio com uma câmara controlada por temperatura e _CO2 a 37 °C, 5% de _CO2.
   7. Grave vários vídeos de 10 a 20 em vários locais em todo o organoide, mostrando o aumento e a diminuição dos níveis de intensidade de fluorescência à medida que o cálcio entra e sai das células.
      NOTA: Para gravações de alta resolução, recomenda-se gravar a uma velocidade de 10 fps ou mais rápida; Recomenda-se 50 fps.
   8. Analise os vídeos usando software de análise de imagem (por exemplo, ImageJ) selecionando regiões de interesse e medindo níveis de intensidade ao longo do tempo.
   9. Normalize as gravações de intensidade usando ΔF/_F0 vs. tempo em milissegundos e enredo.

Resultados

Para alcançar a auto-organização hHO in vitro, modificamos e combinamos protocolos de diferenciação previamente descritos para diferenciação de monocamadas 2D de células cardiomiocós-ástica21 e epicárida22 usando moduladores de via Wnt e para organoides pré-cardiaco ^3D16 usando os fatores de crescimento BMP4 e Activin A. Utilizando a placa de 96 poços EB e protocolo de diferenciação hHO descritos aqui e mostrados na

Discussão

Avanços recentes em cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas e outras células de origem cardíaca têm sido usados para modelar o desenvolvimento do coração humano22,24,25 e ^{doenças26,27,28} e como ferramentas para triagem de ^{terapêutica29,30} e agentes

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21202	1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21206	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21203	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21207	1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat	Invitrogen	A32849	1:200
HAND1	Abcam	ab196622	Rabbit; 1:200
HAND2	Abcam	ab200040	Rabbit; 1:200
NFAT2	Abcam	ab25916	Rabbit; 1:100
PECAM1	DSHB	P2B1	Rabbit; 1:50
TNNT2	Abcam	ab8295	Mouse; 1:200
THY1	Abcam	ab133350	Rabbit; 1:200
TJP1	Invitrogen	PA5-19090	Goat; 1:250
VIM	Abcam	ab11256	Goat; 1:250
WT1	Abcam	ab89901	Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase	Innovative Cell Technologies	NC9464543	cell dissociation reagent
Activin A	R&D Systems	338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin)	Gibco	A1895601	insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement	Gibco	17504-044	cell culture supplement
BMP-4	Gibco	PHC9534
Bovine Serum Albumin	Bioworld	50253966
CHIR-99021	Selleck	442310
D-(-)-Fructose	Millipore Sigma	F0127
DAPI	Thermo Scientific	62248	1:1000
Dimethyl Sulfoxide	Millipore Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	10566016
Essential 8 Flex Medium Kit	Gibco	A2858501	pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM	Invitrogen	F14201
Glycerol	Millipore Sigma	G5516
Glycine	Millipore Sigma	410225
Matrigel GFR	Corning	CB40230	Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum	Millipore Sigma	S30-100mL
Paraformaldehyde	MP Biomedicals	IC15014601	Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Solution	Gibco	10010049
Phosphate Buffer Solution (10x)	Gibco	70011044
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	73155	90 µm
ReLeSR	Stem Cell Technologies	NC0729236	dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640	Gibco	11875093
Thiazovivin	Millipore Sigma	SML1045
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Trypan Blue Solution	Gibco	1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H170010
WNT-C59	Selleck	NC0710557
Other
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02682002
15 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	1495970C
2 mL Cryogenic Vials	Corning	13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs	Fisherbrand	13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass	Cellvis	C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates	Costar	07201680
ImageJ	NIH		Image processing software
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	06-666	laboratory wipes
Micro Cover Glass	VWR	48393-241	24 x 50 mm No. 1.5
Microscope Slides	Fisherbrand	1255015
Moxi Cell Counter	Orflo Technologies	MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M	Orflo Technologies	MXC001
Multichannel Pipettes	Fisherbrand	FBE1200300	30-300 µL
Olympus cellVivo	Olympus		For Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004261
Thermal Mixer	ThermoFisher Scientific	13-687-717
Top Coat Nail Varish	Seche Vite		Can purchase from any supermarket