JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем протокол для создания органоидов сердца человека (hHO), имеющих отношение к развитию, эффективно используя плюрипотентные стволовые клетки человека путем самоорганизации. Протокол опирается на последовательную активацию сигналов развития и производит очень сложные, функционально значимые ткани сердца человека.

Аннотация

Способность изучать развитие сердца человека в области здоровья и болезней сильно ограничена способностью моделировать сложность человеческого сердца in vitro. Разработка более эффективных органоподобных платформ, которые могут моделировать сложные фенотипы in vivo , такие как органоиды и органы на чипе, повысит способность изучать развитие сердца и болезни человека. В этой статье описывается протокол генерации очень сложных органоидов сердца человека (hHO) путем самоорганизации с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека и ступенчатой активации путей развития с использованием ингибиторов малых молекул. Эмбриоидные тела (ЭБ) генерируются в 96-луночной пластине с круглодонными, сверхнизкими прикрепленными колодцами, что облегчает культуру суспензии индивидуализированных конструкций.

ЭБ подвергаются дифференцировке в hHO с помощью трехступенчатой стратегии модуляции сигналов Wnt, которая включает в себя начальную активацию пути Wnt, чтобы вызвать судьбу сердечной мезодермы, второй шаг ингибирования Wnt для создания окончательных сердечных линий и третий шаг активации Wnt для индуцирования тканей проэпикардиальных органов. Эти этапы, выполненные в формате 96 лунок, являются высокоэффективными, воспроизводимыми и производят большое количество органоидов за прогон. Анализ с помощью иммунофлуоресцентной визуализации с 3 по 11 день дифференцировки выявляет особенности первого и второго полей сердца и очень сложные ткани внутри hHO на 15-й день, включая ткань миокарда с областями предсердных и желудочковых кардиомиоцитов, а также внутренние камеры, выстланные тканью эндокарда. Органоиды также демонстрируют сложную сосудистую сеть по всей структуре и внешнюю оболочку эпикардиальной ткани. С функциональной точки зрения hHO уверенно бьются и представляют нормальную активность кальция, как определено с помощью живой визуализации Fluo-4. В целом, этот протокол представляет собой прочную платформу для исследований in vitro в органоподобных сердечных тканях человека.

Введение

Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным типом врожденных дефектов у людей и затрагивают примерно 1% всех живорождений1,2,3. В большинстве случаев причины ИБС остаются неизвестными. Способность создавать модели человеческого сердца в лаборатории, которые очень похожи на развивающееся человеческое сердце, представляет собой значительный шаг вперед для непосредственного изучения основных причин ИБС у людей, а не у суррогатных животных моделей.

Воплощением лабораторно выращенных моделей тканей являются органоиды, 3D-клеточные конструкции, которые напоминают орган, представляющий интерес по клеточному составу и физиологической функции. Органоиды часто получают из стволовых клеток или клеток-предшественников и успешно используются для моделирования многих органов, таких как мозг4,5, почки6,7, кишечник8,9, легкие10,11, печень12,13 и поджелудочная железа14,15 , и это лишь некоторые из них. Появились недавние исследования, демонстрирующие целесообразность создания самособирающихся сердечных органоидов для изучения развития сердца in vitro. Эти модели включают использование эмбриональных стволовых клеток мышей (mESCs) для моделирования раннего развития сердца16,17 до атриовентрикулярной спецификации18 и плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) для генерации органоидов сердечно-эндодермы с несколькими зародышевыми слоями19 и камерных кардиоидов20 с очень сложным клеточным составом.

В этой статье представлен новый 3-ступенчатый протокол модуляции WNT для создания очень сложных hHO эффективным и экономичным способом. Органоиды генерируются в 96-луночных пластинах, что приводит к масштабируемой, высокопроизводительной системе, которая может быть легко автоматизирована. Этот метод основан на создании агрегатов hPSC и запуске этапов развития кардиогенеза, включая формирование мезодермы и сердечной мезодермы, спецификацию первого и второго поля сердца, формирование проэпикардиальных органов и атриовентрикулярную спецификацию. После 15 дней дифференцировки hHO содержат все основные клеточные линии, обнаруженные в сердце, четко определенные внутренние камеры, предсердные и желудочковые камеры и сосудистую сеть по всему органоиду. Эта очень сложная и воспроизводимая органоидная система сердца поддается исследованию структурных, функциональных, молекулярных и транскриптомных анализов при изучении развития сердца, заболеваний и фармакологического скрининга.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Культура и обслуживание hPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Индуцированные человеком PSC (hiPSCs) или эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) необходимо культивировать в течение по крайней мере 2 последовательных проходов после оттаивания, прежде чем их использовать для генерации ЭБ для дифференцировки или дальнейшей криоконсервации. hPSCs культивируют в среде PSC (см. Таблицу материалов) на 6-луночных культуральных пластинах с покрытием из 6 скважин с базальной мембраной-внеклеточным матриксом (BM-ECM). При выполнении изменений среды на гПСК в 6-луночных пластинах добавляйте среду непосредственно на внутреннюю сторону скважины, а не непосредственно поверх клеток, чтобы предотвратить нежелательное отслоение клеток или стресс. Пользователям следует с осторожностью относиться к предварительному нагреванию сред PSC, которые не должны нагреваться при 37 °C; все PSC-среды, используемые в этом протоколе, были термостабильными.

  1. Чтобы покрыть плиты скважин BM-ECM, разморозьте одну аликвоту BM-ECM (хранится при -20 °C в соответствии с инструкциями производителя) на льду и смешайте 0,5 мг BM-ECM с 12 мл холодной модифицированной среды Dulbecco Eagle's (DMEM)/F12 (хранится при 4 °C). Распределите 2 мл смеси DMEM/F12-BM-ECM на каждую скважину из 6-луночной плиты и инкубируйте при 37 °C в течение не менее 2 ч.
  2. Чтобы оттаять клетки, сначала разморозьте криовиал hPSC на бусине 37 °C или водяной бане в течение 1-2 минут, пока не будет видно только небольшое количество льда. Переместите размороженные клетки в центрифужную трубку и медленно добавляют 8-9 мл среды PSC, дополненной 2 мкМ ингибитора ROCK, тиазовивином (Thiaz), и центрифугой при 300 × г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в среде PSC, дополненной 2 мкМ Тиаза. Распределяют клетки в питательной среде в 1-2 лунки в зависимости от концентрации криовиальных клеток и культуры при 37 °С, 5% CO2 в течение 24 ч перед изменением среды PSC.
  3. Меняйте среду на ячейках с интервалом 48 ч. Выполняйте промывку и замену среды с использованием DMEM/F12 (1 мл/скважина) и среды PSC (2 мл/скважина) соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки помогают удалить клеточные отходы и мусор, в то время как изменения свежих сред обеспечивают клетки обновленным источником питательных веществ.
  4. Пропустить клетки при субконфлюенсе (60-80% слива) путем аспирации среды, затем промыть каждую лунку 1 мл 1x фосфатно-буферного раствора Dulbecco (без кальция, без магния; ДПБС). Аспирировать DPBS и добавить 1 мл диссоциационного реагента для hPSCs (см. Таблицу материалов), после чего через 10 с следует аспирация всех, кроме тонкой пленки реагента.
  5. Инкубировать в течение 2-5 мин тонкой пленкой диссоциационного реагента для гПСК до образования промежутков между клетками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время прекращения диссоциации зависит от клеточной линии.
  6. Добавьте в лунку 1 мл среды PSC, дополненной 2 мкМ Тиаза (среда PSC + Thiaz), и осторожно постучите по пластине, чтобы вызвать отслоение клеток. Пипетку отделил клетки в среде 1-2 раза, чтобы разбить какие-либо крупные колонии, и повторно суспендировать клетки в PSC среде+Thiaz в соотношении 1:6 лунки (клетки из 1 скважины повторно суспендированы в 12 мл питательной среды). Перекладывайте ячейки на скважины с покрытием BM-ECM.

2. Генерация 3D самособирающихся органоидов человеческого сердца

  1. Формирование эмбриоидного тела (EB):
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо ограничить наблюдаемые дифференцированные клетки до формирования эмбрионального тела. Две-три скважины из 6-луночной пластины при слиянии 60-80% дадут достаточно клеток для одной 96-луночной пластины органоидов. Все среды должны быть аликвотированы и нагреты на шарике или водяной бане при температуре 37 °C до изменения любой среды, чтобы свести к минимуму температурный шок для ЭБ или органоидов (это не включает реагенты диссоциации клеток). См. рисунок 1A,B.
    1. День -2
      1. Чтобы создать ЭБ, в день -2 промывайте субслияющиеся hPSCs (60-80% сливающиеся) с DPBS в течение не менее 10 с, чтобы промыть любой клеточный мусор и аспирировать DPBS.
      2. Чтобы отсоединить клетки и высвободить их в одноклеточное состояние, добавляют в каждую лунку по 1 мл реагента диссоциации клеток комнатной температуры (см. Таблицу материалов) в течение 3-6 мин. Осторожно постукивайте по пластине ~ 5 раз в минуту, чтобы вызвать отслоение во время проверки под микроскопом. Добавьте 1 мл PSC medium +Thiaz, чтобы остановить реакцию.
      3. Чтобы собрать клетки и разбить оставшиеся агрегаты, пипеткой среду вверх и вниз в скважине 2-3 раза, чтобы получить одноклеточную суспензию. Переложите одноэлементную суспензию в центрифужную трубку и вращайте в течение 5 мин при 300 × г.
      4. Чтобы получить желаемую концентрацию клеток, отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 1 мл среды PSC + Thiaz. Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток или гемоцитометра и разбавьте клетки в среде PSC + Thiaz до концентрации 100 000 клеток / мл.
      5. Чтобы распределить ячейки для формирования ЭБ, используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 100 мкл (10 000 клеток) к каждой скважине круглодонной сверхнизкой пластины с прикреплением 96 скважин. Центрифугируют пластину при 100 × г в течение 3 мин и инкубируют в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2.
    2. День -1
      1. Осторожно удалите 50 мкл среды из каждой скважины и добавьте 200 мкл свежей среды PSC, нагретой до 37 °C, чтобы достичь конечного объема 250 мкл на скважину. Инкубируют клетки в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно удалите и добавьте среду на боковой стороне скважины, чтобы не нарушить ЭБ на дне скважины. Из-за деликатного характера ЭБ и культуры суспензии необходимо оставлять небольшой объем жидкости в каждой скважине при смене среды, чтобы не беспокоить ЭБ.
  2. Дифференциация органоидов сердца человека (hHO):
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все среды должны быть нагреты на шарике или водяной бане при температуре 37 °C до любой замены среды. Осторожно удалите и добавьте среду на стороне лунки, чтобы не нарушить развитие органоидов на дне лунки. Промывки не нужны между изменениями среды, чтобы свести к минимуму возбуждение и обеспечить постепенное удаление ингибиторов и факторов роста. RPMI с добавкой 2% B-27 (Таблица материалов) использовался на протяжении всего протокола дифференциации. Добавка B-27 содержит инсулин, если не указано иное (без инсулина в дни 0-5). См. рисунок 1С.
    1. День 0
      1. Чтобы начать дифференцировку в направлении линии мезодермы, удалите 166 мкл среды из каждой лунки (~2/3 общего объема скважины) и добавьте 166 мкл RPMI 1640, содержащего инсулиновую добавку B-27, 6 мкМ CHIR99021, 1,875 нг/мл костного морфогенетического белка 4 (BMP4) и 1,5 нг/мл активина А для конечной концентрации в скважине 4 мкМ CHIR99021, 1,25 нг/мл BMP4 и 1 нг/мл Активина А. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2.
    2. День 1
      1. Удалите 166 мкл среды из каждой лунки и добавьте 166 мкл свежего RPMI 1640 с инсулиновой добавкой B-27. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2.
    3. День 2
      1. Чтобы индуцировать сердечную мезодерму, удаляют 166 мкл среды из каждой лунки и добавляют 166 мкл RPMI 1640, содержащего инсулиновую добавку B-27 и 3 мкМ Wnt-C59 для конечной концентрации в скважине 2 мкМ Wnt-C59. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C, 5% CO2.
    4. День 4
      1. Удалите 166 мкл среды из каждой лунки и добавьте 166 мкл свежего RPMI 1640 с инсулиновой добавкой B-27. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C, 5% CO2.
    5. День 6
      1. Удалите 166 мкл среды из каждой скважины и добавьте 166 мкл RPMI 1640 с добавкой B-27. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2.
    6. День 7
      1. Чтобы индуцировать дифференцировку проэпикарда, удалите 166 мкл среды из каждой лунки и добавьте 166 мкл свежего RPMI 1640, содержащего добавку B-27, и 3 мкМ CHIR99021 для конечной концентрации в скважине 2 мкМ CHIR99021. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C, 5% CO2.
      2. Удалите 166 мкл среды из каждой лунки и добавьте 166 мкл свежей добавки RPMI 1640, содержащей B-27. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C, 5% CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная осторожность рекомендуется при этом втором изменении среды на 7-й день, так как органоиды более склонны к движению из-за изменений среды.
      3. Начиная с 7-го дня и далее до сбора или переноса для анализа или экспериментирования, выполняйте изменения среды каждые 48 ч, удаляя 166 мкл среды из каждой лунки и добавляйте 166 мкл свежей добавки RPMI 1640, содержащей B-27.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды готовы к анализу и экспериментированию на 15-й день, если более ранние стадии развития не представляют интереса. Их можно культивировать в течение 15-го дня для долгосрочных экспериментов по культуре или созреванию.

3. Органоидный анализ

  1. Перенос целых органоидов (живых или фиксированных)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для переноса живых органоидов убедитесь, что используемые наконечники пипеток стерильны.
    1. Отрежьте наконечник пипетки P200 на 5-10 мм от отверстия наконечника, в результате чего получится широкое отверстие диаметром ~2-3 мм.
    2. Вставьте наконечник прямо в круглый нижний колодец, содержащий органоид, чтобы пипетка была полностью вертикальной (перпендикулярной пластине). Убедитесь, что плунжер пипетки уже нажат до конца, прежде чем вставлять наконечник в среду.
    3. Медленно отпустите плунжер пипетки, занимая достаточное количество среды (100-200 мкл) для сбора органоида.
    4. Перенесите органоид в среде к целевому месту назначения (например, для фиксации, визуализации в реальном времени, электрофизиологической записи, новой культуры пластин).
  2. Фиксация органоидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация и окрашивание органоидов может быть выполнено либо в 96-луночной культуральной пластине, либо в микроцентрифужных трубках. Параформальдегид (PFA) следует обрабатывать только в вытяжном шкафу.
    1. Для фиксации в микроцентрифужных трубках переведите живые органоиды в отдельные трубки с 1-8 органоидами на трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 8 органоидов на трубку.
    2. Осторожно удалите и выбросьте из трубки как можно больше среды, не прикасаясь к органоидам.
    3. Добавьте 4% PFA в каждую трубу или лунку (300-400 мкл на микроцентрифужную трубку и 100-200 мкл на скважину 96-луночной пластины). Инкубировать при комнатной температуре в течение 30-45 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации более 1 ч может потребовать этапов извлечения антигена и не рекомендуется.
    4. Безопасно выбрасывайте PFA, не нарушая органоиды. Выполните 3 промывки с DPBS, дополненным 1,5 г / л глицина (DPBS / Gly), используя тот же объем, который используется для 4% PFA, ожидая 5 минут между стирками. Удалите DPBS / Gly и приступайте к иммуноокрашивающим или другим анализам или добавьте DPBS и храните при 4 °C для будущего использования в течение 2 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение фиксированных органоидов в течение более 2 недель может привести к деградации тканей и загрязнению и не рекомендуется.
  3. Полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание
    1. Добавьте 100 мкл блокирующего/пермеабилизирующего раствора (10% обычной ослиной сыворотки + 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) + 0,5% тритона X-100 в 1x DPBS) в каждую лунку или трубку, содержащую фиксированные органоиды. Инкубировать при комнатной температуре на ночь на шейкере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 8 органоидов на трубку.
    2. Осторожно удалите и выбросьте как можно больше блокирующего раствора, не прикасаясь к органоидам. Выполните 3 стирки с DPBS, ожидая 5 минут между стирками.
    3. Готовят раствор первичного антитела (1% нормальная ослиная сыворотка + 0,5% BSA + 0,5% Тритон X-100 в 1x DPBS) с желаемыми первичными антителами в рекомендуемых концентрациях. Инкубировать при 4 °C в течение 24 ч на шейкере.
    4. Осторожно удалите и выбросьте как можно больше раствора антител, не прикасаясь к органоидам. Выполните 3 стирки с DPBS, ожидая 5 минут между стирками.
    5. Готовят раствор вторичных антител (1% нормальная ослиная сыворотка + 0,5% BSA + 0,5% Тритон X-100 в 1x DPBS) с желаемыми вторичными антителами в рекомендуемых концентрациях. Если антитела флуоресцентно маркированы, инкубируйте при 4 °C в темноте (например, покрыты алюминиевой фольгой) в течение 24 ч на шейкере.
    6. Осторожно удалите и выбросьте как можно больше раствора антител, не прикасаясь к органоидам. Выполните 3 стирки с DPBS, ожидая 5 минут между стирками.
    7. Подготовьте слайды с бусинами (диаметром 90-300 мкм), установленными в монтажной среде (см. Таблицу материалов) по краям слайда, где будет размещена крышка с органоидами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется дать монтажной среде вокруг бусин высохнуть, прежде чем продолжить; это предотвратит перемещение бусин. См. рисунок 2.
    8. Перенесите окрашенные органоиды с помощью вырезанного наконечника пипетки на слайд, между бусинами, обеспечивая расстояние, чтобы избежать контакта между органоидами на слайде. Используйте угол свернутой лабораторной салфетки, чтобы аккуратно удалить лишнюю жидкость вокруг органоида.
    9. Покрыть органоиды монтажно-очистительной средой (раствор для очистки фруктозы-глицерина составляет 60% (об/об)глицерина и 2,5 М фруктозы)37 , используя 120-150 мкл монтажно-очистительной среды на слайд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с монтажно-очистительной средой рекомендуется использовать вырезанный наконечник пипетки, так как он очень вязкий.
    10. Наведите крышку на слайд с органоидами, покрытыми монтажно-очистительным раствором, и медленно нажмите на крышку над слайдом, убедившись, что органоиды находятся между установленными бусинами.
    11. Запечатайте периметр обшивки на слайде с помощью лака для ногтей верхнего слоя. Дайте горке высохнуть в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч. Хранить при температуре 4 °C в темноте для длительного хранения.
  4. Кальциевая транзиторная визуализация в живых органоидах сердца
    ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с инструкциями завода-изготовителя Fluo4-AM был восстановлен в диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации исходного раствора 0,5 мМ. Fluo4-AM добавляли непосредственно в органоидную скважину в 96-луночной пластине.
    1. Выполните 2 промывки органоидов с использованием среды RPMI 1640.
      1. Извлеките из скважины 166 мкл отработанной среды.
      2. Добавьте 166 мкл нагретой среды RPMI 1640, удалите 166 мкл среды и добавьте 166 мкл свежей среды RPMI 1640.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки выполняются для удаления отходов и мусора в ячейках. Две трети среды удаляются из лунок во время промывки, чтобы не нарушить органоиды на дне скважины перед функциональным анализом.
    2. Добавьте среду Fluo4-AM к органоидам.
      1. Добавьте Fluo4-AM, восстановленный в DMSO, к RPMI 1640, содержащему добавку B-27, для приготовления раствора 1,5 мкМ.
      2. Извлеките из лунки 166 мкл среды.
      3. Добавьте 166 мкл 1,5 мкМ Fluo4-AM в RPMI 1640, содержащий добавку B-27 для конечной концентрации в скважине 1 мкМ. Инкубировать при 37 °C, 5% CO2 в течение 30 мин.
    3. Выполните 2 промывки, как в шаге 3.4.1.
    4. Добавьте в скважину 166 мкл RPMI 1640, содержащего добавку B-27.
    5. Используя разрезанный наконечник наконечника пипетки P200, перенесите органоид в чашку Петри со стеклянным дном (например, 8-камерное покровное стекло с высокоэффективным покровным стеклом No 1,5) со 100-200 мкл среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. раздел 3.1 о переносе целых органоидов.
    6. Представьте себе органоиды, живущие под микроскопом с камерой с контролируемой температурой и CO2 при 37 °C, 5% CO2.
    7. Запишите несколько видео по 10-20 с в разных местах по всему органоиду, показывая увеличение и уменьшение уровней интенсивности флуоресценции по мере того, как кальций входит и выходит из клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для записей с высоким разрешением рекомендуется записывать на скорости 10 кадров в секунду или выше; Рекомендуется 50 кадров в секунду.
    8. Анализируйте видео с помощью программного обеспечения для анализа изображений (например, ImageJ), выбирая интересующие регионы и измеряя уровни интенсивности с течением времени.
    9. Нормализуйте записи интенсивности с помощью ΔF/F0 по отношению ко времени в миллисекундах и графику.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для достижения самоорганизующегося hHO in vitro мы модифицировали и комбинировали протоколы дифференцировки, ранее описанные для 2D-монослойной дифференцировки кардиомиоцитов21 и эпикардиальных клеток22 с использованием модуляторов пути Wnt и для 3D-прекардиал?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Последние достижения в области кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток человека, и других клеток сердечного происхождения были использованы для моделирования развития сердца человека22,24,25 и болезней26,27,28 и в качестве инструме?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения под номерами K01HL135464 и R01HL151505 и Американской кардиологической ассоциацией под номером 19IPLOI34660342. Мы хотим поблагодарить MSU Advanced Microscopy Core и доктора Уильяма Джексона на кафедре фармакологии и токсикологии МГУ за доступ к конфокальным микроскопам, IQ Microscopy Core и MSU Genomics Core за услуги секвенирования. Мы также хотели бы поблагодарить всех членов Лаборатории Агирре за их ценные замечания и советы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouseInvitrogenA-212021:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbitInvitrogenA-212061:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouseInvitrogenA-212031:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbitInvitrogenA-212071:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goatInvitrogenA328491:200
HAND1Abcamab196622Rabbit; 1:200
HAND2Abcamab200040Rabbit; 1:200
NFAT2Abcamab25916Rabbit; 1:100
PECAM1DSHBP2B1Rabbit; 1:50
TNNT2Abcamab8295Mouse; 1:200
THY1Abcamab133350Rabbit; 1:200
TJP1InvitrogenPA5-19090Goat; 1:250
VIMAbcamab11256Goat; 1:250
WT1Abcamab89901Rabbit; 1:200
Media and Reagents
AccutaseInnovative Cell TechnologiesNC9464543cell dissociation reagent
Activin AR&D Systems338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin)GibcoA1895601insulin-free cell culture supplement
B-27 SupplementGibco17504-044cell culture supplement
BMP-4GibcoPHC9534
Bovine Serum AlbuminBioworld50253966
CHIR-99021Selleck442310
D-(-)-FructoseMillipore SigmaF0127
DAPIThermo Scientific622481:1000
Dimethyl SulfoxideMillipore SigmaD2650
DMEM/F12Gibco10566016
Essential 8 Flex Medium KitGibcoA2858501pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AMInvitrogenF14201
GlycerolMillipore SigmaG5516
GlycineMillipore Sigma410225
Matrigel GFRCorningCB40230Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey SerumMillipore SigmaS30-100mL
ParaformaldehydeMP BiomedicalsIC15014601Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Phosphate Buffer SolutionGibco10010049
Phosphate Buffer Solution (10x)Gibco70011044
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7315590 µm
ReLeSRStem Cell TechnologiesNC0729236dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640Gibco11875093
ThiazovivinMillipore SigmaSML1045
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Trypan Blue SolutionGibco1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH170010
WNT-C59SelleckNC0710557
Other
1.5 mL Microcentrifuge TubesFisher Scientific02682002
15 mL Falcon TubesFisher Scientific1495970C
2 mL Cryogenic VialsCorning13-700-500
50 mL Reagent ReservoirsFisherbrand13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture PlatesCorning0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glassCellvisC8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment MicroplatesCostar07201680
ImageJNIHImage processing software
KimwipesKimberly-Clark Professional06-666laboratory wipes
Micro Cover GlassVWR48393-24124 x 50 mm No. 1.5
Microscope SlidesFisherbrand1255015
Moxi Cell CounterOrflo Technologies MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type MOrflo TechnologiesMXC001
Multichannel PipettesFisherbrandFBE120030030-300 µL
Olympus cellVivoOlympusFor Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 CentrifugeThermoFisher Scientific75004261
Thermal MixerThermoFisher Scientific13-687-717
Top Coat Nail VarishSeche ViteCan purchase from any supermarket

Ссылки

  1. Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
  2. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), 20593(2020).
  3. Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  6. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  7. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514(2020).
  8. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
  9. Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215(2020).
  10. Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723(2019).
  11. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098(2015).
  12. Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
  13. Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
  14. Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94(2020).
  15. Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4(2020).
  16. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140(2018).
  17. Rossi, G., et al. Capturing cardiogenesis in gastruloids. Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).
  18. Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283(2020).
  19. Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
  20. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
  21. Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
  22. Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003(2016).
  23. Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142(2021).
  24. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  25. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  26. Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
  27. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  28. Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
  29. Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
  30. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
  31. Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
  32. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  33. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).
  34. Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538(2019).
  35. Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , Sinauer Associates. Sunderland (MA). 591-610 (2000).
  36. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  37. Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены