JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, insan pluripotent kök hücrelerini kendi kendine örgütlenerek verimli bir şekilde kullanarak gelişimsel olarak ilgili insan kalbi organoidleri (hSO'lar) oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, gelişimsel ipuçlarının sıralı aktivasyonuna dayanır ve son derece karmaşık, işlevsel olarak ilgili insan kalp dokuları üretir.

Özet

Sağlık ve hastalıkta insan kardiyak gelişimini inceleme yeteneği, insan kalbinin in vitro karmaşıklığını modelleme kapasitesi ile oldukça sınırlıdır. Organoidler ve çip üzerindeki organlar gibi karmaşık in vivo fenotipleri modelleyebilen daha verimli organ benzeri platformlar geliştirmek, insan kalbi gelişimini ve hastalığını inceleme yeteneğini artıracaktır. Bu makalede, insan pluripotent kök hücreleri ve küçük molekül inhibitörleri kullanılarak adım adım gelişimsel yol aktivasyonu kullanılarak kendi kendine örgütlenerek son derece karmaşık insan kalbi organoidleri (hMO'lar) oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Embriyoid cisimler (EBs), 96 kuyulu bir plakada yuvarlak tabanlı, ultra düşük bağlantı kuyuları ile üretilir ve bireyselleştirilmiş yapıların süspansiyon kültürünü kolaylaştırır.

EB'ler, kardiyak mezoderm kaderini teşvik etmek için ilk Wnt yolu aktivasyonunu, kesin kardiyak soylar oluşturmak için Wnt inhibisyonunun ikinci bir adımını ve proepikardiyal organ dokularını indükleyen üçüncü bir Wnt aktivasyon adımını içeren üç adımlı bir Wnt sinyal modülasyon stratejisi ile hMO'lara farklılaşmaya tabir edilir. 96 kuyu formatında gerçekleştirilen bu adımlar son derece verimli, tekrarlanabilir ve çalışma başına büyük miktarlarda organoid üretir. Farklılaşmanın 3. gününden 11. gününe kadar immünofluoresans görüntüleme ile yapılan analizler, atriyal ve ventrikül kardiyomiyosit bölgelerine sahip miyokard dokusunun yanı sıra endokardiyal doku ile kaplı iç odalar da dahil olmak üzere, 15. günde hMO'ların içindeki birinci ve ikinci kalp alanı spesifikasyonlarını ve son derece karmaşık dokuları ortaya koymaktadır. Organoidler ayrıca yapı boyunca karmaşık bir damar ağı ve epikardial dokunun dış astarını sergiler. Fonksiyonel açıdan, hMO'lar sağlam bir şekilde döver ve Fluo-4 canlı görüntüleme ile belirlenen normal kalsiyum aktivitesini sunar. Genel olarak, bu protokol insan organı benzeri kalp dokularında in vitro çalışmalar için sağlam bir platform oluşturmaktadır.

Giriş

Konjenital kalp defektleri (CHD) insanlarda en sık görülen konjenital defekt türüdür ve tüm canlı doğumların yaklaşık % 1'ini etkiler1,2,3. Çoğu durumda, CHD'lerin nedenleri bilinmemektedir. Laboratuvarda gelişmekte olan insan kalbine çok benzeyen insan kalbi modelleri oluşturma yeteneği, vekil hayvan modellerinden ziyade insanlarda CHD'lerin altında kalan nedenleri doğrudan incelemek için önemli bir adım oluşturmaktadır.

Laboratuvarda yetiştirilen doku modellerinin özeti organoidlerdir, hücre kompozisyonuna ve fizyolojik işleve ilgi gösteren bir organa benzeyen 3D hücre yapılarıdır. Organoidler genellikle kök hücrelerden veya progenitör hücrelerden türetilir ve beyin4,5, böbrek6,7, bağırsak8,9, akciğer10,11, karaciğer12,13 ve pankreas14,15 gibi birçok organı modellemek için başarıyla kullanılmıştır. , sadece birkaç isim vermek için. Son çalışmalar, kalp gelişimini in vitro olarak incelemek için kendi kendine bir araya getiren kalp organoidleri oluşturmanın fizibilitesini göstermiştir. Bu modeller, erken kalp gelişimini modellemek için fare embriyonik kök hücrelerini (mESC' ler) kullanmayı içerir16,17 atriyoventriküler spesifikasyon18'e kadar ve insan pluripotent kök hücreleri (hPSC' ler) çok mikrop tabakası kardiyak-endoderm organoidleri19 ve son derece karmaşık hücresel bileşime sahip odalı kardiyooidler20 üretmek için.

Bu makale, son derece karmaşık hMO'ları verimli ve uygun maliyetli bir şekilde oluşturmak için yeni bir 3 adımlı WNT modülasyon protokolü sunun. Organoidler 96 kuyulu plakalarda üretilir, bu da kolayca otomatikleştirilebilir ölçeklenebilir, yüksek verimli bir sistemle sonuçlanır. Bu yöntem, hPSC agregalarının oluşturulmasına ve mezoderm ve kardiyak mezoderm oluşumu, birinci ve ikinci kalp alanı spesifikasyonu, proepikardiyal organ oluşumu ve atriyoventriküler spesifikasyon dahil olmak üzere kardiyogenez gelişim adımlarını tetiklemeye dayanır. 15 günlük farklılaşmadan sonra, hNO'lar kalpte bulunan tüm ana hücre soylarını, iyi tanımlanmış iç odaları, atriyal ve ventrikül odalarını ve organoid boyunca bir damar ağını içerir. Bu son derece sofistike ve tekrarlanabilir kalp organoid sistemi, kalp gelişimi, hastalıkları ve farmakolojik tarama çalışmalarında yapısal, fonksiyonel, moleküler ve transkriptomik analizleri araştırmaya açıktır.

Protokol

1. hPSC kültürü ve bakımı

NOT: İnsan indüklenen PSC'ler (hiPSC'ler) veya insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler), farklılaşma veya daha fazla kriyoprezervasyon için EB üretmek için kullanılmadan önce çözdükten sonra en az 2 ardışık pasaj için kültüre edilmelidir. hPSC'ler, bodrum-membran-hücre dışı matris (BM-ECM) kaplı 6 kuyulu kültür plakalarında PSC ortamında kültürlenir ( Bkz. Malzeme Tablosu). 6 kuyulu plakalarda hPSC'lerde orta değişiklikler yaparken, istenmeyen hücre kopmasını veya stresini önlemek için ortamı doğrudan hücrelerin üzerine değil, doğrudan kuyunun iç tarafına ekleyin. Kullanıcılar, 37 °C'de ısıtılmaması gereken ısınma öncesi PSC medyasına karşı dikkatli olmalıdır; bu protokolde kullanılan tüm PSC ortamları termostable'dı.

  1. Kuyu plakalarını BM-ECM ile kaplamak için, BM-ECM'nin bir aliquot'unu (üreticinin talimatlarına göre -20 °C'de saklanır) buz üzerinde çözün ve BM-ECM'nin 0,5 mg'ını 12 mL soğuk Dulbecco'nun modifiye Eagle ortası (DMEM)/F12 ortamıyla karıştırın (4 °C'de saklanır). DMEM/F12-BM-ECM karışımının 2 mL'lik kısmını 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna dağıtın ve en az 2 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  2. Hücreleri eritmek için, önce, hPSC cryovial'ı 37 °C boncuk veya su banyosunda 1-2 dakika boyunca sadece az miktarda buz görünene kadar çözün. Çözülen hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve yavaşça 2 μM ROCK inhibitörü, tiazovivin (Thiaz) ile desteklenmiş PSC ortamının 8-9 mL'sini ekleyin ve 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj ekleyin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 2 μM Thiaz ile desteklenmiş PSC ortamına yeniden ısıtın. Kültür ortamındaki hücreleri, PSC ortamını değiştirmeden önce 37 °C'deki cryovial hücre konsantrasyonuna ve kültürüne bağlı olarak 1-2 kuyuya, 24 saat boyunca% 5 CO2'ye dağıtın.
  3. Hücrelerdeki ortamı 48 saat aralıklarla değiştirin. Sırasıyla DMEM/F12 (1 mL/kuyu) ve PSC ortamını (2 mL/kuyu) kullanarak yıkama ve orta değişiklikler gerçekleştirin.
    NOT: Yıkamalar hücre atıklarının ve döküntülerinin giderilmesine yardımcı olurken, taze medya değişiklikleri hücrelere yenilenmiş bir besin kaynağı sağlar.
  4. Ortamı aspire ederek alt iletkenlik üzerine hücreleri (%60-80 bir arada) geçirme, ardından her bir kuyuyu 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu çözeltisinin 1 mL'si ile yıkama (kalsiyum yok, magnezyum yok; DPBS). DPBS'yi aspire edin ve hPSC'ler için ayrışma reaktifinin 1 mL'lik kısmını ekleyin ( Bkz. Malzeme Tablosu), ardından 10 sn'den sonra reaktifin ince bir filmi hariç hepsinin aspirasyonu.
  5. Hücreler arasında boşluklar oluşana kadar hPSC'ler için dissositasyon reaktifinin ince filmiyle 2-5 dakika kuluçkaya yatırın.
    NOT: Ayrışmayı durdurma süresi hücre satırına bağlıdır.
  6. Kuyuya 2 μM Thiaz (PSC medium+Thiaz) ile desteklenmiş PSC ortamının 1 mL'lik kısmını ekleyin ve hücre müfrezesini indük etmek için plakaya hafifçe dokunun. Herhangi bir büyük koloniyi parçalamak için ortamdaki müstakil hücreleri 1-2 kez pipetleyin ve PSC medium +Thiaz'daki hücreleri 1:6 kuyu oranında yeniden biriktirin (1'den hücreler 12 mL kültür ortamında yeniden canlandırılmış). Hücreleri BM-ECM kaplı kuyulara yeniden plakala.

2. 3D kendi kendine monte insan kalp organoidleri üretimi

  1. Embriyoid vücut (EB) oluşumu:
    NOT: Embriyoid vücut oluşumu öncesinde gözlemlenebilir farklılaşmış hücrelerin sınırlandırılması zorunludur. %60-80'lik bir konfülemede 6-well plakasının iki ila üç kuyusu, tek bir 96 kuyu plakası organoid için yeterli hücre sağlayacaktır. Tüm ortamlar, EBs veya organoidlere sıcaklık şokunu en aza indirmek için herhangi bir orta değişiklik yapmadan önce 37 °C'lik bir boncuk veya su banyosunda aliquoted ve ısıtılmalıdır (bu hücre dissositasyon reaktiflerini içermez). Bkz. Şekil 1A,B.
    1. Gün -2
      1. EBs oluşturmak için, -2 gününde, herhangi bir hücre kalıntılarını yıkamak ve DPBS'yi aspire etmek için en az 10 sn boyunca DPBS ile alt konfluent hPSC'leri (%60-80 confluent) yıkayın.
      2. Hücreleri ayırmak ve tek hücreli bir duruma bırakmak için, her kuyuya 3-6 dakika boyunca 1 mL oda sıcaklığı hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Mikroskop altında kontrol ederken ayırmaya neden olmak için plakaya dakikada ~ 5 kez hafifçe dokunun. Reaksiyonu durdurmak için 1 mL PSC medium+Thiaz ekleyin.
      3. Hücreleri toplamak ve kalan agregaları parçalamak için, tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için ortamı kuyuda 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetlayın. Tek hücreli süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarın ve 300 × g'da 5 dakika döndürün.
      4. İstenilen hücre konsantrasyonu elde etmek için, süpernatant atın ve psc orta + Thiaz 1 mL hücreleri yeniden atın. Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve PSC medium+Thiaz'daki hücreleri 100.000 hücre/mL konsantrasyonuna seyreltin.
      5. EB oluşumu için hücreleri dağıtmak için, yuvarlak tabanlı ultra düşük ataşman 96 kuyu plakasının her kuyusuna 100 μL (10.000 hücre) eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Plakayı 100 × g'da 3 dakika santrifüj edin ve 37 °C,% 5 CO2'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
    2. Gün -1
      1. Her kuyudan 50 μL orta dikkatlice çıkarın ve kuyu başına 250 μL'lik son bir hacim elde etmek için 37 °C'ye ısıtılmış 200 μL taze PSC ortamı ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatır, %5 CO2.
        NOT: Kuyunun altındaki ED'leri rahatsız etmemek için kuyunun kenarına dikkatlice orta ekleyin ve ekleyin. EBs'nin hassas doğası ve süspansiyon kültürü nedeniyle, EB'leri rahatsız etmemek için ortamı değiştirirken her kuyuda küçük bir hacim sıvı bırakmak gerekir.
  2. İnsan Kalbi Organoidi (hHO) Farklılaşması:
    NOT: Tüm ortamlar, herhangi bir medya değişikliğine gerek duymadan önce 37 °C'lik bir boncuk veya su banyosunda ısıtılmalıdır. Kuyunun dibinde gelişen organoidleri rahatsız etmemek için kuyunun kenarına dikkatlice orta ekleyin ve ekleyin. Ajitasyonu en aza indirmek ve inhibitörlerin ve büyüme faktörlerinin kademeli olarak giderilmesine izin vermek için medya değişiklikleri arasında yıkamalara gerek yoktur. Farklılaşma protokolü boyunca %2 B-27 ekli (Malzeme Masası) RPMI kullanılmıştır. B-27 takviyesi belirtilmedikçe insülin içerir (0-5 gün içinde insülin içermez). Bkz. Şekil 1C.
    1. 0. Gün
      1. Bir mezoderm soyuna doğru farklılaşma başlatmak için, her kuyudan 166 μL orta (toplam kuyu hacminin ~ 2 / 3' ü ) çıkarın ve insülin içermeyen B-27 takviyesi içeren 166 μL RPMI 1640 ekleyin, 6 μM CHIR99021, 1.875 ng/mL kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) ve 1.5 ng/mL Activin A 4 μM CHIR99021 son kuyu konsantrasyonu için, 1.25 ng/mL BMP4 ve 1 ng/mL Activin A. 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatır, %5 CO2.
    2. 1. Gün
      1. Her kuyudan 166 μL orta çıkarın ve insülin içermeyen B-27 takviyesi ile 166 μL taze RPMI 1640 ekleyin. 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yaslanın, %5 CO2.
    3. 2. Gün
      1. Kardiyak mezoderm spesifikasyonunu teşvik etmek için, her kuyudan 166 μL orta çıkarın ve 37 °C'de 48 saat boyunca 2 μM Wnt-C59. Incubate için insülinsiz B-27 takviyesi ve 3 μM Wnt-C59 içeren 166 μL RPMI 1640 ekleyin.
    4. 4. Gün
      1. Her kuyudan 166 μL orta çıkarın ve insülin içermeyen B-27 takviyesi ile 166 μL taze RPMI 1640 ekleyin. 37 °C'de 48 saat kuluçkaya yaslanın, %5 CO2.
    5. 6. Gün
      1. Her kuyudan 166 μL orta çıkarın ve B-27 takviyesi ile 166 μL RPMI 1640 ekleyin. 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yaslanın, %5 CO2.
    6. 7. Gün
      1. Proepikardiyal farklılaşmayı teşvik etmek için, her kuyudan 166 μL orta çıkarın ve 2 μM CHIR99021 son kuyu konsantrasyonu için B-27 takviyesi ve 3 μM CHIR99021 içeren 166 μL taze RPMI 1640 ekleyin. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın, %5 CO2.
      2. Her kuyudan 166 μL orta çıkarın ve B-27 takviyesi içeren 166 μL taze RPMI 1640 ekleyin. 37 °C'de 48 saat kuluçkaya yaslanın, %5 CO2.
        NOT: Organoidler medya değişiklikleri nedeniyle harekete daha yatkın olduğu için 7.
      3. Analizler veya deneyler için toplama veya aktarma işlemine kadar, her kuyudan 166 μL orta çıkararak her 48 saat orta değişiklikler yapın ve B-27 takviyesi içeren 166 μL taze RPMI 1640 ekleyin.
        NOT: Organoidler, daha erken gelişim aşamaları ilgi çekici olmadıkça 15. Uzun süreli kültür veya olgunlaşma deneyleri için 15.

3. Organoid analizi

  1. Tüm organoidlerin aktarılması (canlı veya sabit)
    NOT: Canlı organoid transferi için kullanılan pipet uçlarının steril olduğundan emin olun.
    1. P200 pipet ucunun uc ucunu uç açıklığından 5-10 mm kesin, böylece ~2-3 mm çapında geniş bir açıklık elde edin.
    2. Ucu doğrudan organoid içeren yuvarlak tabanlı kuyuya yerleştirin, böylece pipet tamamen dikeydir (plakaya dik). Ucu ortama yerleştirmeden önce pipet pistonuna zaten basıldığından emin olun.
    3. Pipet pistonu yavaşça serbest bırakın, organoidi toplamak için yeterli ortamı (100-200 μL) alın.
    4. Organoidi orta olarak hedef hedefe aktarın (örneğin, sabitleme, canlı görüntüleme, elektrofizyoloji kaydı, yeni plaka kültürü).
  2. Organoidlerin sabitlenerek sabitlendirme
    NOT: Organoidlerin sabitlenilmesi ve boyanması 96 kuyu kültür plakasında veya mikrosantrifüj tüplerinde yapılabilir. Paraformaldehit (PFA) sadece duman kaputunda ele alınmalıdır.
    1. Mikrosantrifüj tüplerde sabitleme için, canlı organoidleri tüp başına 1-8 organoid ile ayrı tüplere aktarın.
      NOT: Tüp başına 8 organoidi aşmayın.
    2. Organoidlere dokunmadan tüpten mümkün olduğunca fazla ortamı dikkatlice çıkarın ve atın.
    3. Her tüpe veya kuyuya %4 PFA ekleyin (mikrosantrifüj tüpü başına 300-400 μL ve 96 kuyu plakası kuyusu başına 100-200 μL). Oda sıcaklığında 30-45 dakika kuluçkaya yatır.
      NOT: 1 saatin üzerindeki kuluçka süreleri antijen alma adımları gerektirebilir ve önerilmez.
    4. Organoidleri bozmadan PFA'yı güvenli bir şekilde atın. %4 PFA için kullanılan aynı hacmi kullanarak, yıkamalar arasında 5 dakika bekleyerek, 1,5 g/L glisin (DPBS/Gly) ile desteklenmiş DPBS ile 3 yıkama gerçekleştirin. DPBS/Gly'yi çıkarın ve immünostaining veya diğer analizlere geçin veya DPBS ekleyin ve 2 haftaya kadar ileride kullanılmak üzere 4 °C'de saklayın.
      NOT: Sabit organoidlerin 2 haftadan uzun süre saklanması doku bozulmasına ve kirlenmesine neden olabilir ve önerilmez.
  3. Tüm montajlı immünofluoresan boyama
    1. Sabit organoidleri içeren her kuyuya veya tüpe 100 μL blokaj/permeabilizasyon çözeltisi (%10 normal eşek serumu + %0,5 sığır serum albümini (BSA) + 1x DPBS'de %0,5 Triton X-100) ekleyin. Bir çalkalayıcıda gece boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
      NOT: Tüp başına 8 organoidi aşmayın.
    2. Organoidlere dokunmadan engelleme çözeltisinin mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın ve atın. DPBS ile 3 yıkama gerçekleştirin, yıkamalar arasında 5 dakika bekletin.
    3. Önerilen konsantrasyonlarda istenen primer antikor çözeltisi (%1 normal eşek serumu + %0,5 BSA + %0,5 Triton X-100 in 1x DPBS) hazırlayın. Bir çalkalayıcıda 24 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yaslanın.
    4. Organoidlere dokunmadan antikor çözeltisinin mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın ve atın. DPBS ile 3 yıkama gerçekleştirin, yıkamalar arasında 5 dakika bekletin.
    5. Önerilen konsantrasyonlarda istenen ikincil antikorlarla sekonder antikor çözeltisi (%1 normal eşek serumu + %0,5 BSA + %0,5 Triton X-100 in 1x DPBS) hazırlayın. Antikorlar floresan olarak etiketlenmişse, bir çalkalayıcı üzerinde 24 saat boyunca karanlıkta 4 °C'de (örneğin alüminyum folyo ile kaplı) kuluçkaya yatırın.
    6. Organoidlere dokunmadan antikor çözeltisinin mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın ve atın. DPBS ile 3 yıkama gerçekleştirin, yıkamalar arasında 5 dakika bekletin.
    7. Organoidlerle kapak ucunun yerleştirileceği slaydın kenarlarına yakın bir montaj ortamına monte edilmiş boncuklu (90-300 μm çapında) slaytlar hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Devam etmeden önce boncukların etrafındaki montaj ortamının kurumasına izin vermeniz önerilir; bu, boncukların hareket etmesini önleyecektir. Bkz. Şekil 2.
    8. Lekeli organoidleri kesilmiş bir pipet ucu kullanarak slayta, boncuklar arasında aktarın, slaytta bir kez organoidler arasında teması önlemek için aralık sağlayın. Organoidin etrafındaki fazla sıvıyı dikkatlice çıkarmak için yuvarlanmış bir laboratuvar mendilinin köşesini kullanın.
    9. Organoidleri montaj temizleme ortamı ile örtün (fruktoz-gliserol temizleme çözeltisi slayt başına montaj temizleme ortamının 120-150 μL'sini kullanarak% 60 (vol/vol) gliserol ve 2,5 M fruktozdur)37 .
      NOT: Çok viskoz olduğu için montaj temizleme ortamıyla çalışırken kesilmiş pipet ucu kullanılması önerilir.
    10. Kapak kapağını montaj temizleme çözeltisi ile kaplı organoidlerle kaydırağın üzerine gelin ve organoidlerin monte edilen boncuklar arasında olduğundan emin olarak kapak kapağını slaytın üzerine yavaşça bastırın.
    11. Üst kat tırnak verniği kullanarak slayttaki kapak cilasının çevresini kapatın. Kaydırağın oda sıcaklığında 1 saat boyunca karanlıkta kurumasını bekleyin. Uzun süreli depolama için karanlıkta 4 °C'de saklayın.
  4. Canlı kalp organoidlerinde kalsiyum geçici görüntüleme
    NOT: Üreticinin talimatlarına göre, Fluo4-AM 0,5 mM'lik nihai stok çözelti konsantrasyonuna dimetil sülfit (DMSO) olarak yeniden inşa edilmiştir. Fluo4-AM, 96 kuyu plakasındaki organoid kuyusuna doğrudan eklendi.
    1. RPMI 1640 ortamını kullanarak organoidler üzerinde 2 yıkama gerçekleştirin.
      1. Harcanan ortamın 166 μL'lik kısmını kuyudan çıkarın.
      2. 166 μL ısıtılmış RPMI 1640 ortamı ekleyin, 166 μL ortayı çıkarın ve 166 μL taze RPMI 1640 orta ekleyin.
        NOT: Yıkamalar atık malzeme ve hücre kalıntılarını gidermek için yapılır. Fonksiyonel tahlilden önce kuyunun dibindeki organoidleri rahatsız etmemek için yıkamalar sırasında ortamın üçte ikisi kuyulardan çıkarılır.
    2. Organoidlere Fluo4-AM ortamı ekleyin.
      1. 1,5 μM'lik bir çözelti hazırlamak için B-27 takviyesi içeren RPMI 1640'a DMSO'da yeniden inşa edilen Fluo4-AM'yi ekleyin.
      2. Kuyudan 166 μL orta çıkarın.
      3. RPMI 1640'ta 166 μL 1.5 μM Fluo4-AM ekleyin ve 1 μM'lik son kuyu konsantrasyonu için B-27 takviyesi ekleyin.
    3. Adım 3.4.1'deki gibi 2 yıkama gerçekleştirin.
    4. Kuyuya B-27 takviyesi içeren 166 μL RPMI 1640 ekleyin.
    5. Bir P200 pipet ucunun kesilmiş bir ucunu kullanarak, organoidi 100-200 μL orta boy bir cam tabanlı Petri kabına (örneğin, 1,5 yüksek performanslı kapaklı 8 kuyulu kapak camı) aktarın.
      NOT: Tüm organoidlerin aktarılmasıyla ilgili bölüm 3.1'e bakın.
    6. Görüntü organoidler, 37 °C, %5 CO2 sıcaklık ve CO2 kontrollü bir oda ile mikroskop altında yaşar.
    7. Organoidin çeşitli yerlerinde, kalsiyum hücrelere girip çıkarken floresan yoğunluğu seviyelerindeki artışı ve azalmayı gösteren birkaç 10-20 s video kaydedin.
      NOT: Yüksek çözünürlüklü kayıtlar için 10 fps veya daha hızlı bir hızda kayıt yapılması önerilir; 50 fps önerilir.
    8. İlgi çekici bölgeleri seçerek ve zaman içinde yoğunluk seviyelerini ölçerek görüntü analizi yazılımı (örneğin, ImageJ) kullanarak videoları analiz edin.
    9. ΔF/F0 ve zaman karşılaştırmasını milisaniyeler ve çizimler halinde kullanarak yoğunluk kayıtlarını normalleştirin.

Sonuçlar

Kendi kendini organize eden hHO in vitro elde etmek, Daha önce Wnt yol modülatörleri kullanılarak kardiyomiyositlerin ve epikardiyal hücrelerin 2D monolayer farklılaşması için ve 3D prekardiyak organoidler16 için BMP4 ve Activin A. Burada açıklanan ve Şekil 1'de gösterilen 96 kuyu plakası EB ve hHO farklılaşma protokolünü kullanarak modifiye ettik ve birleştirdik. , Wnt yolu aktivatör CHIR99...

Tartışmalar

İnsan kök hücre türevli kardiyomiyositler ve kardiyak kökenli diğer hücrelerdeki son gelişmeler, insan kalbi gelişimini modellemek için 22,24,25 ve hastalık26,27,28 ve terapötikleri taramak için araçlar olarak kullanılmıştır29,30 ve toksik aj...

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından K01HL135464 ve R01HL151505 ödül numaraları altında ve Amerikan Kalp Derneği tarafından 19IPLOI34660342 ödül numarası altında desteklendi. MSU Farmakoloji ve Toksikoloji Bölümü'nden MSU Advanced Microscopy Core ve Dr. William Jackson'a konfokal mikroskoplara erişim için, IQ Mikroskopi Çekirdeğine ve MSU Genomik Çekirdeği'ne sıralama hizmetleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Aguirre Lab'in tüm üyelerine değerli yorumları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouseInvitrogenA-212021:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbitInvitrogenA-212061:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouseInvitrogenA-212031:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbitInvitrogenA-212071:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goatInvitrogenA328491:200
HAND1Abcamab196622Rabbit; 1:200
HAND2Abcamab200040Rabbit; 1:200
NFAT2Abcamab25916Rabbit; 1:100
PECAM1DSHBP2B1Rabbit; 1:50
TNNT2Abcamab8295Mouse; 1:200
THY1Abcamab133350Rabbit; 1:200
TJP1InvitrogenPA5-19090Goat; 1:250
VIMAbcamab11256Goat; 1:250
WT1Abcamab89901Rabbit; 1:200
Media and Reagents
AccutaseInnovative Cell TechnologiesNC9464543cell dissociation reagent
Activin AR&D Systems338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin)GibcoA1895601insulin-free cell culture supplement
B-27 SupplementGibco17504-044cell culture supplement
BMP-4GibcoPHC9534
Bovine Serum AlbuminBioworld50253966
CHIR-99021Selleck442310
D-(-)-FructoseMillipore SigmaF0127
DAPIThermo Scientific622481:1000
Dimethyl SulfoxideMillipore SigmaD2650
DMEM/F12Gibco10566016
Essential 8 Flex Medium KitGibcoA2858501pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AMInvitrogenF14201
GlycerolMillipore SigmaG5516
GlycineMillipore Sigma410225
Matrigel GFRCorningCB40230Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey SerumMillipore SigmaS30-100mL
ParaformaldehydeMP BiomedicalsIC15014601Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Phosphate Buffer SolutionGibco10010049
Phosphate Buffer Solution (10x)Gibco70011044
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7315590 µm
ReLeSRStem Cell TechnologiesNC0729236dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640Gibco11875093
ThiazovivinMillipore SigmaSML1045
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Trypan Blue SolutionGibco1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH170010
WNT-C59SelleckNC0710557
Other
1.5 mL Microcentrifuge TubesFisher Scientific02682002
15 mL Falcon TubesFisher Scientific1495970C
2 mL Cryogenic VialsCorning13-700-500
50 mL Reagent ReservoirsFisherbrand13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture PlatesCorning0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glassCellvisC8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment MicroplatesCostar07201680
ImageJNIHImage processing software
KimwipesKimberly-Clark Professional06-666laboratory wipes
Micro Cover GlassVWR48393-24124 x 50 mm No. 1.5
Microscope SlidesFisherbrand1255015
Moxi Cell CounterOrflo Technologies MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type MOrflo TechnologiesMXC001
Multichannel PipettesFisherbrandFBE120030030-300 µL
Olympus cellVivoOlympusFor Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 CentrifugeThermoFisher Scientific75004261
Thermal MixerThermoFisher Scientific13-687-717
Top Coat Nail VarishSeche ViteCan purchase from any supermarket

Referanslar

  1. Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
  2. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), 20593 (2020).
  3. Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  6. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  7. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
  8. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
  9. Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215 (2020).
  10. Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723 (2019).
  11. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098 (2015).
  12. Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
  13. Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
  14. Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94 (2020).
  15. Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).
  16. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140 (2018).
  17. Rossi, G., et al. Capturing cardiogenesis in gastruloids. Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).
  18. Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).
  19. Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
  20. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
  21. Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
  22. Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).
  23. Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142 (2021).
  24. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  25. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  26. Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
  27. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  28. Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
  29. Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
  30. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
  31. Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
  32. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  33. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).
  34. Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).
  35. Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).
  36. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  37. Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır