다능성 줄기 세포에서 파생된 자가 조립 인간 심장 오르가노이드 생성

요약

여기서, 우리는 자기 조직에 의하여 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 발달적으로 관련있는 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 만드는 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 발달 단서의 순차적 활성화에 의존하고 매우 복잡하고 기능적으로 관련된 인간 심장 조직을 생성합니다.

초록

건강과 질병에서 인간의 심장 발달을 연구하는 능력은 체외에서 인간의 심장의 복잡성을 모델링하는 능력에 의해 매우 제한됩니다. 오르가노이드 및 장기 온 칩과 같은 생체 내 표현형에서 복합체를 모델링할 수 있는 보다 효율적인 장기 와 같은 플랫폼을 개발하면 인간의 심장 발달과 질병을 연구하는 능력이 향상됩니다. 이 논문은 인간 만능 줄기 세포를 사용하여 자기 조직에 의해 매우 복잡한 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 생성하고 작은 분자 억제제를 사용하여 단계별 발달 경로 활성화를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 배아 체(EB)는 둥근 바닥, 초저 부착 우물이 있는 96웰 플레이트에서 생성되어 개별화된 구조의 현탁액 배양을 용이하게 합니다.

EB는 심장 중피 운명을 유도하기 위한 초기 Wnt 통로 활성화, 결정적인 심장 혈통을 만들기 위한 Wnt 억제의 두 번째 단계, 그리고 미원성 장기 조직을 유도하는 세 번째 Wnt 활성화 단계를 포함하는 3단계 Wnt 신호 변조 전략에 의해 hHOs로 분화를 거칩니다. 96웰 형식으로 수행되는 이 단계는 매우 효율적이고 재현 가능하며 실행당 다량의 오르가노이드를 생성합니다. 3일부터 11일까지 11일째에 면역형광 영상에 의한 분석은 심방 및 심실 심근세포의 영역을 가진 심근 조직뿐만 아니라 내시경 조직으로 늘어선 내부 챔버를 포함하여 15일째에 hHOs 내부의 첫 번째 및 두 번째 심장 장 사양 및 매우 복잡한 조직을 보여줍니다. 오르가노이드는 또한 구조 전반에 걸쳐 복잡한 혈관 네트워크와 상피 조직의 외부 안대기를 나타낸다. 기능적 관점에서 hHSo는 플루오-4 라이브 이미징에 의해 결정된 정상 칼슘 활성을 견고하게 이길 수 있습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 인간 장기 같이 심장 조직에 있는 체외 연구를 위한 단단한 플랫폼을 구성합니다.

서문

선천성 심장 결함 (CHDs)은 인간에 있는 선천적인 결함의 일반적인 모형이고 모든 살아있는 출생의 대략 1%에 영향을 미칩니다^1,2,3. 대부분의 상황에서 CHD의 이유는 아직 알려지지 않았습니다. 발달하는 인간 심장과 밀접하게 유사한 실험실에서 인간 심장 모델을 만드는 능력은 대리 동물 모델보다는 인간에서 CHDs의 근본 원인을 직접 연구하는 중요한 단계를 구성합니다.

실험실에서 자란 조직 모델의 전형은 세포 조성 및 생리 기능에 대한 관심기관과 유사한 오르가노이드, 3D 세포 구조입니다. 오르가노이드는 종종 줄기 세포 또는 전구 세포에서 파생되며 성공적으로 뇌^4,5, 신장^6,7, 장^8,9, lung10,11, ^....

프로토콜

1. hPSC 문화 및 유지 보수

참고: 인간 유도 된 PSC (hiPSCs) 또는 인간 배아 줄기 세포 (hESC)는 분화 또는 추가 극저온 보존을 위해 EB를 생성하는 데 사용되기 전에 해동 후 적어도 2 개의 연속 된 구절을 배양해야합니다. hPSC는 지하 막 세포 매트릭스 (BM-ECM)-코팅 된 6 웰 배양 판에 PSC 배지 ( 재료의 표 참조)에서 배양된다. 6웰 플레이트에서 hPSC에 대한 중간 변화를 수행할 때, 원치 않는 세포 분리 또는 스트레스를 방지하기 위해 세포 위에 직접 붙이지 않고 우물 의 내부 측면에 직접 배지를 추가합니다. 사용자는 37 °C에서 따뜻하게해서는 안되는 사전 온난화 PSC 미디어를 주의해야합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 PSC 미디어는 열불안정이었습니다.

1. BM-ECM로 잘 플레이트를 코팅하려면 BM-ECM의 알리쿼트 1개(제조업체의 지침에 따라 -20°C에 저장됨)를 얼음에 해동하고 BM-ECM의 0.5 mg을 12mL의 콜드 덜벡코의 수정된 이글 매체(DMEM)/F12 매체(4°C에 저장)로 혼합한다. DMEM/F12-BM-ECM 혼합물을 6웰 플레이트의 각 웰에 분배하고 37°C에서 적어도 2시간 동안 배양한다.
2. 세포를 해동하려....

결과

시험관 내 자가 조직 hHO를 달성하기 위해, 우리는 이전에 Wnt 통로 변조기^{를 사용하여 심}근 세포²¹ 및 상복부 세포의 2D 단층 분화에 대해 설명된 2D 단층 분화 프로토콜을 수정하고 결합하고 성장 인자 BMP4 및 Activin A. 96 웰 플레이트 EB 및 hHOi 프로토콜을 사용하여 여기에 설명된 피규어 1을 사용하여 설명된 피규어 1 ,.......

토론

최근 인간 줄기세포 유래 심근세포 및 심장 기원의 다른 세포에서 의기유는 인간 심장 발달을 모델링하는 데 사용되어 왔으며^{, 26,27,28}및 치료학적 ^29,30및 독성제를 선별하는 도구로 사용^{되었습니다3.......}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21202	1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21206	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21203	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21207	1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat	Invitrogen	A32849	1:200
HAND1	Abcam	ab196622	Rabbit; 1:200
HAND2	Abcam	ab200040	Rabbit; 1:200
NFAT2	Abcam	ab25916	Rabbit; 1:100
PECAM1	DSHB	P2B1	Rabbit; 1:50
TNNT2	Abcam	ab8295	Mouse; 1:200
THY1	Abcam	ab133350	Rabbit; 1:200
TJP1	Invitrogen	PA5-19090	Goat; 1:250
VIM	Abcam	ab11256	Goat; 1:250
WT1	Abcam	ab89901	Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase	Innovative Cell Technologies	NC9464543	cell dissociation reagent
Activin A	R&D Systems	338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin)	Gibco	A1895601	insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement	Gibco	17504-044	cell culture supplement
BMP-4	Gibco	PHC9534
Bovine Serum Albumin	Bioworld	50253966
CHIR-99021	Selleck	442310
D-(-)-Fructose	Millipore Sigma	F0127
DAPI	Thermo Scientific	62248	1:1000
Dimethyl Sulfoxide	Millipore Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	10566016
Essential 8 Flex Medium Kit	Gibco	A2858501	pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM	Invitrogen	F14201
Glycerol	Millipore Sigma	G5516
Glycine	Millipore Sigma	410225
Matrigel GFR	Corning	CB40230	Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum	Millipore Sigma	S30-100mL
Paraformaldehyde	MP Biomedicals	IC15014601	Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Solution	Gibco	10010049
Phosphate Buffer Solution (10x)	Gibco	70011044
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	73155	90 µm
ReLeSR	Stem Cell Technologies	NC0729236	dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640	Gibco	11875093
Thiazovivin	Millipore Sigma	SML1045
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Trypan Blue Solution	Gibco	1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H170010
WNT-C59	Selleck	NC0710557
Other
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02682002
15 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	1495970C
2 mL Cryogenic Vials	Corning	13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs	Fisherbrand	13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass	Cellvis	C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates	Costar	07201680
ImageJ	NIH		Image processing software
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	06-666	laboratory wipes
Micro Cover Glass	VWR	48393-241	24 x 50 mm No. 1.5
Microscope Slides	Fisherbrand	1255015
Moxi Cell Counter	Orflo Technologies	MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M	Orflo Technologies	MXC001
Multichannel Pipettes	Fisherbrand	FBE1200300	30-300 µL
Olympus cellVivo	Olympus		For Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004261
Thermoshaker	ThermoFisher Scientific	13-687-711PM
Top Coat Nail Varish	Seche Vite		Can purchase from any supermarket