大规模生产昆虫致病真菌、 罗伯氏菌 和 异根真菌，用于昆虫害虫的商业应用

摘要

昆虫致病真菌作为农业害虫的生物防治剂越来越重要。本研究利用农粮产品成功大规模生产了足够数量的南非 梅塔根菌 和 山 茱萸分离株的弹性感染性繁殖体，用于商业应用。

摘要

茴香属复合物的昆虫致病真菌作为农业害虫的生物防治剂而变得越来越重要。害虫对化学杀虫剂的抗药性增加，对杀虫剂对人类健康的负面影响的日益关注，以及农药对环境的污染，导致全球努力寻找新的可持续作物保护和害虫控制战略。以前，已经尝试过大规模培养诸如Beauveria bassiana之类的昆虫致病真菌（EPF）物种。然而，只有有限的尝试进行了大规模的培养Metarhizium robertsii和M. pinghaense用于对抗害虫。本研究旨在大规模生产足够数量的南非罗拔沙分枝杆菌和平海氏菌的弹性感染性繁殖体，用于商业应用。三种农产品，片状燕麦，片状大麦和大米，被用作EPF固体发酵基质。采用两种接种方法，分生孢子悬浮液和胚芽孢子的液体真菌培养来接种固体底物。观察到使用分生孢子悬浮液的接种相对不那么有效，因为相对于使用囊孢子接种方法，在固体底物上观察到污染水平增加。发现片状燕麦不是M. robertsii和M. pinghaense的合适生长基质，因为没有从基质中收获干燥的分生孢子。发现片状大麦有利于分生孢子菌的产生，而不是平海分生孢子菌的生产，平均1.83克±1.47克干分生孢子菌，从基质中收获零克分生孢子分生孢子。 发现水稻籽粒有利于分生孢子大规模生产M. pinghaense和M. robertsii分离株，平均从基质中收获平均8.2g±4.38 g和6 g±2 g。

引言

昆虫致病真菌（EPF）作为作物保护剂，在重要农业害虫的生物防治中具有重要意义^1，2。在土壤中自然发生的昆虫病原体在各种害虫物种的种群中引起动物流行病³。EPF的物种是宿主特异性的，在攻击非靶向物种方面构成的风险相对较小，并且对环境无毒⁴。EPF具有入侵宿主的独特机制，以及在其直接环境中繁殖和持续^存在1。它们主要通过无性孢子攻击宿主，这些孢子附着并穿透宿主角质层，以侵入宿主血细胞并增殖。宿主最终由于血淋巴营养物质的消耗或真菌释放的有毒代谢物引起的毒血症而死亡。死亡后，在理想的环境条件下，真菌出现在宿主尸体^5，6的外表面（明显的真菌病）。

人们越来越关注化学残留物对人类健康、环境污染和虫害抗药性的发展的负面影响，导致全球努力减少化学杀虫剂的投入，并寻找替代、新颖和可持续的作物保护和虫害防治战略^6，7，8.这为开发用于病虫害综合治理（IPM）计划的微生物杀虫剂提供了机会，这些计划比传统的^{化学控制更具}生态优势3^，8。

为了开发成功的农业害虫微生物控制剂，必须首先分离，表征，鉴定合适的生物体并确认其对目标害虫的致病性。然而，需要一种简单、具有成本效益的大规模生产微生物剂的方法，以生产用于生物控制方案的可行产品^{9、10、11、12、13}。大量高质量昆虫病原体的大规模生产取决于微生物菌株，环境，目标害虫，配方，市场，应用策略和所需的最终产品^14，15，16。EPF可以大规模生产，使用液体底物发酵产生囊孢子或固体底物发酵过程产生地上分生孢子^6，17，18。然而，昆虫病原体的大规模生产和配制过程直接影响最终产品的毒力，成本，保质期和现场功效。为了在IPM中成功使用，昆虫病原体的生产过程必须易于运行，需要最少的劳动力，产生高产浓度的毒力，活体和持久性繁殖体，并且成本低^{4，13，14，16}。

了解昆虫病原体的营养需求对于所有培养方法的大规模培养非常重要^4，12.生产培养基的营养成分对所得繁殖体的属性有显著影响，包括生物防治功效、产量、干燥耐受性和持久性^{8、19、20、21}。生产程序的优化旨在解决这些因素²².对于EPF，真菌分生孢子的良好生长，孢子形成和大规模生产的主要要求是充足的水分，最佳生长温度，pH值，CO 2和O₂ 的气体交换_以及 营养，包括良好的磷，碳水化合物，碳和氮源¹⁸。

Jaronski和Jackson¹⁸ 将固体底物发酵方法描述为相对于液体底物发酵方法而言，与EPF生产自然过程最有效和最接近的方法，因为在自然条件下，真菌分生孢子存在于固体直立结构上，就像昆虫尸体的表面一样。含有淀粉的农产品和副产品主要用于下胰腺真菌的大规模生产，因为真菌很容易通过从其菌丝尖端分泌高度浓缩的水解酶来分解淀粉，以渗透固体物质，并获得物质^{11，17，18，23}中存在的营养物质.谷物产品也为健康的生物质生产提供了要求，因为当它们被水合和灭菌时，基质可以从任何液体培养基^16，18，24中吸收更多的营养物质。

此前，有几项研究试图大规模培养EPF物种，如 Beauveria bassiana （Bals）。Vuil.， 冬虫夏草 （Wize） Kelper B. Shrestha & Spatafora， Verticillium lecanii （Zimm.）维加斯和一些 Metarhizium anisopliae （Metschn.）Sorokin物种复合物在各种基质上分离^16，23，24。这种大规模生产和商业化开发的分离物包括Green Muscle^® （菌株IMI 330189），由 M. anisopliae var Metarhizium acridum （Driver&Milner）J.F. Bisch，Rehner&Humber，Metarhizium 69（Meta 69菌株ICIPE69）和Real Metarhizium 69（L9281），由 M. anisopliae开发，宽带^® （菌株PPRI 5339）和Eco-Bb^®，由 B. bassiana^25，26开发。.然而，对大众文化 Metarhizium robertsii J.F. Bisch.，S.A. Rehner&Humber和 Metarhizium pinghaense Chen&Guo的尝试有限。这两种分离株在之前的一项研究中被选为对控制粉虱最有效的， Pseudococcus viburni Signoret（半翅目:Pseudococcidae）²⁷。因此，目前的研究旨在配制和大规模生产足够数量的当地 田上梅和平 海氏菌的弹性感染性繁殖体 ， 用于商业应用以对抗害虫。采用固体底物发酵法对两种EPF分离株进行菌源分生孢子的大规模生产。使用两种EPF接种方法，使用分生孢子悬浮液和芽孢子的液体真菌培养来接种固体底物。

研究方案

1. 真菌菌株的来源

1. 使用南非分离的来自南非西开普省苹果园的 M. pinghaense 5 HEID（GenBank加入编号:MT367414 / MT895630）和 M. robertsii 6EIKEN（MT378171 / MT380849）的 南非分离真菌菌株。
2. 在60g Sabouraud葡萄糖琼脂培养基上生长每种EPF分离物的培养物，并补充1g酵母提取物（SDAY）和10μL链霉素。
   注意:在黑暗中将EPF培养物在±25°C的受控温度下孵育。

2. 平海  梅塔根和 罗伯氏分 生孢子悬吊接种

1. 固体基材的制备
   1. 使用两种农产品，即片状燕麦和片状大麦，作为两种EPF分离物的生长培养基，高压灭菌袋（305毫米×660毫米）作为发酵袋。
   2. 使用小的聚氯乙烯废液管（1000毫米×50毫米）在高压灭菌器袋的开口端为发酵袋创建一个颈部，并使用高压灭菌胶带将管道固定到袋子上。
   3. 用无菌棉絮塞关闭管道，以便在发酵过程中进行足够的气体交换。
   4. 称取片燕麦和片状大麦的干谷物（200克），并将其放入发酵袋中，并在每个袋子中加入100毫升蒸馏水并彻底混合袋子的内容物。
   5. 将湿谷物静置15-30分钟以吸收水分，然后再进行高压灭菌和灭菌。每种谷物类型准备六个袋子，并防止污染，将袋子放在其他高压灭菌袋中，并在121°C下高压灭菌基材55分钟。
2. 分生孢子悬浮液接种物的制备
   1. 使用无菌手术刀片，通过刮擦从 M. pinghaense 和 M. robertsii 的真菌培养物中收获2-3周龄的真菌分生孢子。
   2. 将收集的真菌分生孢子悬浮在20mL无菌蒸馏水中，补充0.05%吐温20，并涡旋混合分生孢子悬浮液2分钟。
   3. 制备20 mL分生孢子悬浮液，浓度为1×10⁷ 分生孢子/ mL，并分别接种片状燕麦和片状大麦固体底物。
      注意:使用血细胞计数器测定分生孢子浓度。
3. 固体基材的接种
   1. 通过取下棉絮颈塞打开每个袋子，并将制备的20mL分生孢子悬浮液加入冷却的高压灭菌基材中。
   2. 再次关闭袋子，使用颈部塞子，按摩袋子的内容物，使真菌接种物与谷物基质均匀混合。
   3. 将发酵袋在±25°C的受控温度下孵育，并确保培养物与环境之间有足够的气体交换。
      注意:该过程必须在层流柜下进行。
4. 发酵阶段
   1. 接种和孵育2天后，当可见的菌丝生长发生并且基质开始被生长的真菌聚集时，在发酵袋中手动按摩谷物基质。
      注意:这样做是为了混合接种的颗粒，以允许在真菌营养生长的第一个早期阶段进行菌丝分枝。
   2. 使用厨房擀面杖来操纵基板床，以避免晶粒基板床的物理不均质性和基板质量的床厚。
      注意:该过程促进真菌代谢，从而优化真菌孢子的产生，并最大化表面积，促进分生孢子产量¹⁸。
   3. 让发酵过程持续长达4-5周，并每2天检查发酵袋中是否存在发酵过程中可能产生的白色营养过度生长，这会极大地影响真菌分生孢子的产量。
      注意:立即终止在含有任何白色营养过度生长的发酵袋中的发酵，并将真菌培养物干燥¹⁸.

3. 囊孢子接种

1. 胚芽孢子的产生和接种
   1. 制备液体培养基，含有1升蒸馏水，30克葡萄糖，20克酵母提取物，4克磷酸钾重基（K₂HPO₄），15毫升玉米浸泡液和10μg/ mL抗生素链霉素，用于 平海分枝 杆菌和 罗伯西分枝杆菌。
   2. 首先，加热蒸馏水，在达到沸点之前关闭，然后将除链霉素以外的每种成分加入锅中的热水中。将培养基轻轻煮沸3-4分钟，并不断搅拌培养基，以允许适当混合成分并防止一些成分在锅底沉淀。
   3. 将总共100 mL培养基倒入九个不同的250 mL烧瓶中，并在每个烧瓶上放置棉絮塞，并用铝箔作为塞子覆盖棉絮（图1A）。
   4. 在烧瓶中在121°C下高压灭菌55分钟。 高压灭菌后，让烧瓶中的培养基冷却，并向每个烧瓶中的培养基中加入10mg / mL链霉素（图1B）。
   5. 从2-3周龄的真菌培养板中收集2-3个真菌分生孢子细菌环，用于EPF分离物 M. pinghaense 和 M. robertsii，并在无菌条件下转移到250 mL烧瓶中的每个100 mL液体培养基中，并密封烧瓶。
   6. 将液体培养瓶在±25°C下孵育，在轨道振荡器上以140rpm振荡3天，一旦培养物显示出高浊度和真菌囊孢子生长的迹象，就停止孵育（图1C）。
   7. 为了检测培养物中任何可能的细菌污染，在孵育期间24小时后从每个液体培养瓶中抽取100μL样品，并在每个分离物的三个SDA板上板。将板在±25°C的受控温度下孵育48小时。
2. 固体基材的制备
   1. 使用蒸煮的长粒白米作为 M. pinghaense和M. robertsii （改编自Jaronski和Jackson¹⁸）的囊孢子的固体基质介质。
   2. 如上所述，在步骤2.1.1-2.1.3中制备发酵袋，并为每个袋子加入1公斤大米和300毫升无菌蒸馏水。
   3. 轻轻混合发酵袋的内容物，并以直立位置置于外部高压釜袋中，并在121°C下高压灭菌55分钟。高压灭菌后，让底物在无菌条件下冷却±45分钟。
3. 接种和发酵
   1. 在层流下取出 M. pinghaense 和 M. robertsii 的每个液体培养瓶的关闭，并在每个烧瓶的边缘燃烧10秒。
   2. 通过将颈部的棉絮塞取出100mL液体培养物倒入发酵袋中（图2）。将棉塞放回原处，并用橡皮筋固定的手术纸盖住袋子的颈部顶部。
      注意:使用血细胞计数器测定每个烧瓶的囊孢子浓度，并使用1×10⁷ - 5×10⁸ 囊孢子/ mL的囊孢子浓度来纯天然接种底物²⁸。
   3. 通过摇晃和轻轻操作按摩基质来扭转袋子的顶部并混合袋子的内容物，并将袋子在±25°C下孵育，通过在袋子中压平基材以防止形成厚床¹⁸。
   4. 在接种和孵育后2-3天，通过按摩袋子的内容物来打破发酵袋中的底物，此时发生了可见的菌丝体生长和真菌对底物的结合（改编自Jaronski和Jackson¹⁸的技术）。
      注意:让发酵持续4周。

图 1:高压灭菌前在 250 mL 烧瓶中的液体培养基。（A）（B）高压灭菌和接种EPF孢子后。（C）具有真菌胚芽孢子的浑浊培养基。请点击此处查看此图的大图。

图2:制备的囊孢子液体培养基。 （A） Metarhizium robertsii 和（B） Metarhizium pinghaense 在接种水稻之前作为固体基质。 请点击此处查看此图的大图。

4. 真菌培养物的干燥

1. 在试验中使用之前，通过将孢子培养物转移到26-30千克（30 x 43 x 15250^{cm 3}）的棕色纸袋中，将真菌培养物在发酵后干燥10-12天。
2. 为了提高纸袋的拉伸强度，水平切掉每个袋子顶部三分之一，并在袋子的底部划线（图3A，B）。

图3:纸袋的制备，培养物的干燥过程和包装。（A，B）棕色纸袋的制备。生长在（C，E）蒸谷大米和（D，F）片状大麦上的Metarhizium种培养物的干燥程序。（G）用订书钉封闭的纸袋，形成三角形帐篷结构。请点击此处查看此图的大图。

3. 轻轻粉碎每个发酵袋中的基质，切掉每个袋子的一角，并通过切割角留下的空间将整个培养物转移到纸袋中（图3C-F）。为了避免真菌孢子过度逸出到空气中，请缓慢执行此过程。
   注意:在无菌条件下，使用层流进行此过程，以避免污染。
4. 标记每个纸袋并在每个袋子的顶端折叠两次，并用订书钉关闭以形成三角形帐篷结构，并将袋子放在钢丝晾衣架上，以便在±25°C的受控温度和30-40%的低湿度下适当，均匀地干燥。
5. 每天翻转袋子，使培养物均匀干燥，并避免可能发生的任何营养再生，这将降低可收获真菌孢子的产量。
6. 在干燥过程中每2天称重每个干燥袋，并继续每个袋子的干燥过程，直到连续几天之间观察到袋子的质量几乎没有变化。

5. 真菌分生孢子的收获

1. 使用三个嵌套筛从培养物中机械地收获真菌分生孢子，测试筛（ETS）网35号（孔径为500μm），嵌套在测试筛（具有212μm孔径），嵌套在ETS网100号（具有150μm孔径）上，安装在收集盘上。
2. 将干燥的培养样品缓慢装载到ETS网状35筛上，并在筛子上盖上盖子，以防止真菌分生孢子释放到空气中。
3. 在筛子中加入10-12个玻璃弹珠，以协助真菌分生孢子通过网筛，避免分生孢子保留在筛子中，从而减少孢子回收。
4. 用电工胶带用胶带密封筛口，防止分生孢子粉尘逸出。
5. 将筛子放在装有粘性垫的振动振荡器上，以每分钟560-640次的振动固定收集盘和筛子20-25分钟（图4）。
   注:技术改编自Jaronski和Jackson¹⁸。

图4:从大米和片状大麦上干燥的 Metarhizium robertsii 培养物中收获真菌孢子。 （A）将10-12个玻璃弹珠添加到筛子中，以协助真菌分生孢子通过网状筛网。 从 （B）水稻和（C）水稻的培养物中收获的分生孢子分生孢子菌几乎剥落。（D）振动筛上的筛子。 请点击此处查看此图的大图。

6. 从收集盘中取出测试筛，收集分生孢子并将收集的分生孢子存放在密闭和不透水的拉链锁袋中，以便长期储存（3-6个月）。

6. 真菌分生孢子的定量

1. 在从每个基质收获真菌分生孢子之前，测量并记录每个谷物基质的质量。
2. 通过从固体基质的质量中减去收集的孢子的质量来测量收集的分生孢子的总重量。
   注意:总分生孢子产量不仅涉及收获的分生孢子，还涉及留在固体基质上的真菌分生孢子。
3. 称量基材，并从称重的基材中取出10克。将10g底物悬浮在0.05%吐温20中，并在10mL无菌蒸馏水中稀释。
4. 涡旋混合悬浮液2分钟，并使用血细胞计数器进行孢子计数以确定从底物中洗涤的分生孢子的数量。
5. 通过将 1000 μL 洗涤的分生孢子悬浮液转移到 9 mL 无菌蒸馏水中以构成 10 mL 稀释悬浮液来进行进一步的稀释。
6. 涡旋混合分生孢子悬浮液2分钟，并确定分生孢子浓度。
   注意:按照Inglis，Enkerli和Goettel³⁰ 描述的程序和公式来确定悬浮液的分生孢子浓度。
7. 收集并从每个培养物中收集的总共0.1g收集的分生孢子粉在10mL无菌蒸馏水中补充0.05%吐温20，涡旋混合分生孢子悬浮液2分钟，并使用血细胞计数器测定分生孢子浓度。
8. 通过将1000μL分生孢子悬浮液转移到9 mL无菌蒸馏水中以构成10 mL悬浮液稀释液来进行进一步的稀释。
9. 涡旋混合分生孢子悬浮液2分钟，计算分生孢子浓度并确定每克分生孢子的数量。
10. 将每克收获的粉末的分生孢子数乘以收获的分生孢子粉末的初始质量。将从基质中洗涤的分生孢子数量乘以用过的基质的总重量，即从中获取分生孢子的基质。
11. 将两个给定值相加并除以基材的初始干重，以计算每公斤或每克底物的分生孢子数¹⁸。
    注:计算主要针对水稻基质。对 平海分 枝杆菌和 罗伯氏 分枝杆菌分离株进行发芽或分生孢子活力试验，以确定产生的分生孢子的生存能力。

7. 数据分析

1. 使用适当的计算机软件程序对获得的结果进行统计分析。
   注:数据的统计分析是使用统计A版本13.5.0.17完成的。

结果

在真菌培养物的干燥阶段，随着时间的推移，观察到 M. pinghaense 和 M. robertsii 的水稻培养物含量质量下降，一旦培养物干燥，在质量上没有或几乎没有变化（图5）。收获的 M. pinghaense 和 M. robertsii 的干燥真菌分生孢子粉如图 6所示。

讨论

在农业生态系统中成功整合微生物制剂以生物控制重要的农业害虫取决于昆虫病原的成功和容易程度，这是实验室条件下的第一步。EPF的大规模生产对于使用生物防治的IPM计划的EPF产品的大规模应用和可用性非常重要^{9，10，11，12，13}。不同EPF分离物的大规模生产的成功受生?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Tween 20	Lasec		Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles	Lasec		Used to make conidial suspensions
Aluminium foil			Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave			Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags	Lasec		Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape	Lasec		To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags			Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor	SIGMA	66071-94-1	Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool	Lasec		Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles	Neolab		Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape			Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask	Lasec		Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%)	Lasec		Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley	Health Connection Wholefoods		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats	Tiger brands		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose	Merck		Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators			For growing fungal conidia culture
Haemocytometer			Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops	Lasec		For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin			Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet	ESCO Laminar Flow Cabinet		Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia	Stellenbosch University	5HEID	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia	Stellenbosch University	6EIKEN	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope	ZEIZZ (Scope. A1)		Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker	IncoShake- LABOTEC		Used for the blastospore production process
Parboiled rice	Spekko		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin	SIGMA		Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes	Lasec		Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips	Labnet (BioPette PLUS)		Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe			Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	SIGMA-ALDRICH		Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band			Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA)	NEOGEN Culture Media		Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water			To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad			Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade	Lasec		Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper	Lasec		Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker			Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract	Biolab		Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags	GLAD		Used to to store harvested fungal conidia