Massenproduktion von entomopathogenen Pilzen, Metarhizium robertsii und Metarhizium pinghaense, zur kommerziellen Anwendung gegen Insektenschädlinge

Zusammenfassung

Entomopathogene Pilze haben als biologische Bekämpfungsmittel für landwirtschaftliche Insektenschädlinge an Bedeutung gewonnen. In dieser Studie wurde die Massenproduktion einer ausreichenden Anzahl widerstandsfähiger infektiöser Vermehrungen südafrikanischer Isolate von Metarhizium robertsii und M. pinghaense für die kommerzielle Anwendung gegen Insektenschädlinge erfolgreich unter Verwendung von landwirtschaftlichen Getreideprodukten durchgeführt.

Zusammenfassung

Entomopathogene Pilze des Artenkomplexes Metarhizium anisopliae haben als biologische Bekämpfungsmittel für landwirtschaftliche Insektenschädlinge an Bedeutung gewonnen. Die Zunahme der Schädlingsresistenz gegen chemische Insektizide, die wachsende Besorgnis über die negativen Auswirkungen von Insektiziden auf die menschliche Gesundheit und die Umweltverschmutzung durch Pestizide haben zu einem globalen Bestreben geführt, neuartige nachhaltige Strategien für den Pflanzenschutz und die Schädlingsbekämpfung zu finden. Zuvor wurden Versuche unternommen, solche entomopathogenen Pilze (EPF) -Arten wie Beauveria bassiana in Massen zu kultivieren. Es wurden jedoch nur begrenzte Versuche unternommen, Metarhizium robertsii und M. pinghaense zur Verwendung gegen Insektenschädlinge zu kultivieren. Diese Studie zielte darauf ab, eine ausreichende Anzahl widerstandsfähiger infektiöser Propagulationen südafrikanischer Isolate von M. robertsii und M. pinghaense für kommerzielle Anwendungen in Massenproduktion herzustellen. Drei landwirtschaftliche Getreideprodukte, Haferflocken, Gerstenflocken und Reis, wurden als feste EPF-Fermentationssubstrate verwendet. Zwei Impfmethoden, konidielle Suspensionen und die flüssige Pilzkultur von Blastosporen, wurden verwendet, um die festen Substrate zu impfen. Es wurde beobachtet, dass die Impfung mit konidiellen Suspensionen relativ weniger wirksam ist, da auf den festen Substraten im Vergleich zur Verwendung der Blastosporen-Impfmethode erhöhte Kontaminationsgrade beobachtet wurden. Haferflocken erwiesen sich sowohl für M. robertsii als auch für M. pinghaense als geeignetes Wachstumssubstrat, da keine trockenen Konidien aus dem Substrat geerntet wurden. Es wurde festgestellt, dass Gerstenflocken die Produktion von M. robertsii-Konidien gegenüber der von M. pinghaense begünstigten, und durchschnittlich 1,83 g ± 1,47 g trockene M. robertsii-Konidien und null Gramm M. pinghaense-Konidien wurden aus dem Substrat geerntet. Es wurde festgestellt, dass Reiskörner die konidielle Massenproduktion von M. pinghaense- und M. robertsii-Isolaten begünstigen, wobei durchschnittlich 8,2 g ± 4,38 g bzw. 6 g ± 2 g aus dem Substrat geerntet wurden.

Einleitung

Entomopathogene Pilze (EPF) haben als Pflanzenschutzmittel bei der biologischen Bekämpfung wichtiger landwirtschaftlicher Insektenschädlinge an Bedeutung gewonnen ^1,2. Die Entomopathogene, die natürlicherweise im Boden vorkommen, verursachen Tierseuchen in den Populationen verschiedener Schädlingsarten³. Die Arten von EPF sind wirtsspezifisch und stellen relativ wenige Risiken in Bezug auf den Angriff auf Nichtzielarten dar, und sie sind ungiftig für die Umwelt⁴. EPF haben einen einzigartigen Mechanismus für das Eindringen in ihren Wirt sowie für die Ausbreitung und Persistenz in ihrer unmittelbaren Umgebung¹. Sie greifen den Wirt hauptsächlich durch asexuelle Sporen an, die sich an die Nagelhaut des Wirts anheften und diese durchdringen, um in den Hämocoel des Wirts einzudringen und sich zu vermehren. Der Wirt stirbt schließlich aufgrund der Erschöpfung der Hämolymph-Nährstoffe oder als Folge der Toxämie, die durch die toxischen Metaboliten verursacht wird, die vom Pilz freigesetzt werden. Nach dem Tod tritt der Pilz unter idealen Umweltbedingungen auf der äußeren Oberfläche (offene Mykose) des Wirtskadavers^{aus 5,6}.

Wachsende Besorgnis über die negativen Auswirkungen chemischer Rückstände auf die menschliche Gesundheit, Umweltverschmutzung und die Entwicklung von Schädlingsresistenzen haben zu dem globalen Bestreben geführt, den Einsatz von Insektiziden auf chemischer Basis zu reduzieren und alternative, neuartige und nachhaltige Strategien für Pflanzenschutz und Schädlingsbekämpfung^zu finden 6,7,8 . Dies hat Möglichkeiten geschaffen, mikrobielle Insektizide für den Einsatz in Programmen für den integrierten Pflanzenschutz (IPM) zu entwickeln, die ökologisch günstigere Strategien sind als die herkömmliche chemische Kontrolle ^3,8.

Um ein erfolgreiches mikrobielles Bekämpfungsmittel für einen landwirtschaftlichen Schädling zu entwickeln, muss zunächst ein geeigneter Organismus isoliert, charakterisiert, identifiziert und seine Pathogenität für den Zielschädling bestätigt werden. Es ist jedoch eine einfache und kostengünstige Methode für die großtechnische Produktion des mikrobiellen Agens erforderlich, um ein lebensfähiges Produkt für die Verwendung in biologischen Bekämpfungsprogrammen 9,10,11,12,13 herzustellen. Die Massenproduktion erheblicher Mengen hochwertiger Entomopathogene hängt vom mikrobiellen Stamm, der Umwelt, dem Zielschädling, der Formulierung, dem Markt, der Anwendungsstrategie und dem gewünschten Endprodukt^{ab 14,15,16}. EPF kann unter Verwendung von flüssiger Substratfermentation zur Herstellung von Blastosporen oder des festen Substratfermentationsprozesses zur Herstellung von Luftkonidien 6,17,18 in Massenproduktion hergestellt werden. Der Massenproduktions- und Formulierungsprozess von Entomopathogenen beeinflusst jedoch direkt die Virulenz, die Kosten, die Haltbarkeit und die Feldwirksamkeit des Endprodukts. Für eine erfolgreiche Verwendung in IPM muss der Produktionsprozess der Entomopathogene einfach zu bedienen sein, minimale Arbeit erfordern, eine hohe Ausbeute an virulenten, lebensfähigen und persistenten Vermehrungen erzeugen und kostengünstig^sein 4,13,14,16.

Das Verständnis des Nährstoffbedarfs von Entomopathogenen ist wichtig für die Massenkultivierung mit allen Anbaumethoden ^4,12. Die Nährstoffkomponenten des Produktionsmediums haben einen signifikanten Einfluss auf die Eigenschaften der resultierenden Vermehrungen, einschließlich der Wirksamkeit der Biokontrolle, des Ertrags, der Austrocknungstoleranz und der Persistenz 8,19,20,21. Die Optimierung von Produktionsabläufen ist darauf ausgerichtet, solche Faktoren anzugehen²². Für EPF sind die Hauptanforderungen für ein gutes Wachstum, Sporulation und Massenproduktion von Pilzkonidien ausreichende Feuchtigkeit, optimale Wachstumstemperatur, pH-Wert, Gasaustausch von CO₂ und_O2 und Ernährung, einschließlich guter Phosphor-, Kohlenhydrat-, Kohlenstoff- und Stickstoffquellen¹⁸.

Jaronski und Jackson¹⁸ beschreiben die feste Substratfermentationsmethode als die effizienteste und engste Annäherungsmethode an den natürlichen Prozess zur EPF-Produktion im Vergleich zur Fermentationsmethode für flüssige Substrate, da das Pilzkonidium unter natürlichen Bedingungen auf festen aufrechten Strukturen wie der Oberfläche von Insektenkadavern getragen wird. Landwirtschaftliche Produkte und Nebenprodukte, die Stärke enthalten, werden hauptsächlich für die Massenproduktion von hypokrealischen Pilzen verwendet, da die Pilze Stärke leicht durch Sekretion hochkonzentrierter hydrolytischer Enzyme aus ihren Hyphenspitzen zersetzen, um in die feste Substanz einzudringen und auf die in der Substanz vorhandenen Nährstoffe zuzugreifen^11,17,18,23 . Die Getreideprodukte liefern auch die Voraussetzungen für eine gesunde Biomasseproduktion, denn wenn sie hydratisiert und sterilisiert sind, können die Substrate weitere Nährstoffe aus jedem flüssigen Medium aufnehmen^16,18,24.

Zuvor wurde in mehreren Studien versucht, EPF-Arten wie Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas und einige der Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin-Spezies-Komplex-Isolate auf verschiedenen Substraten 16,23,24. Zu diesen massenproduzierten und kommerziell entwickelten Isolaten gehören Green Muscle^® (Stamm IMI 330189), entwickelt aus M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner), J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 Stamm ICIPE69) und Real Metarhizium 69 (L9281), entwickelt aus M. anisopliae, und Broadband^® (Stamm PPRI 5339) und Eco-Bb^®, entwickelt aus B. bassiana ^25,26 . Es wurden jedoch begrenzte Versuche unternommen, Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber und Metarhizium pinghaense Chen & Guo in Massenkultur zu bringen. Diese beiden Isolate wurden in einer früheren Studie als die wirksamsten für die Bekämpfung der Wollläuse ausgewählt, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)²⁷. Daher zielte die aktuelle Studie darauf ab, eine ausreichende Anzahl widerstandsfähiger infektiöser Vermehrungen der lokalen Isolate von M. robertsii und M. pinghaense für die kommerzielle Anwendung gegen Insektenschädlinge zu formulieren und in Massenproduktion zu produzieren. Die Festsubstratfermentationsmethode wurde verwendet, um die Pilzkonidien für beide EPF-Isolate in Massenproduktion herzustellen. Zwei EPF-Impfmethoden, bei denen konidielle Suspensionen und die flüssige Pilzkultur von Blastosporen verwendet wurden, wurden verwendet, um die festen Substrate zu impfen.

Protokoll

1. Quelle von Pilzstämmen

1. Verwenden Sie südafrikanische isolierte Pilzstämme von M. pinghaense 5 HEID (GenBank Accession number: MT367414/MT895630) und M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), die aus Apfelplantagen in der Provinz Westkap, Südafrika, gesammelt wurden.
2. Züchten Sie Kulturen jedes EPF-Isolats auf 60 g Sabouraud-Dextrose-Agar-Medium, ergänzt mit 1 g Hefeextrakt (SDAY) und 10 μL Streptomycin.
   HINWEIS: Inkubieren Sie EPF-Kulturen bei einer kontrollierten Temperatur von ± 25 °C im Dunkeln.

2. Metarhizium pinghaense  und M. robertsii conidial suspension inokulation

1. Aufbereitung der festen Substrate
   1. Verwenden Sie zwei landwirtschaftliche Produkte, nämlich Haferflocken und Gerstenflocken, als Wachstumsmedien für die beiden EPF-Isolate und Autoklavenbeutel (305 mm × 660 mm) als Gärbeutel.
   2. Verwenden Sie ein kleines Polyvinylchlorid-Abfallrohr (1000 mm × 50 mm), um einen Hals für den Gärbeutel am offenen Ende des Autoklavenbeutels zu erstellen, und verwenden Sie Autoklavband, um das Rohr am Beutel zu befestigen.
   3. Schließen Sie das Rohr mit einem sterilen Wattestopfen, um einen ausreichenden Gasaustausch während der Gärung zu ermöglichen.
   4. Wiegen Sie trockene Körner (200 g) von Haferflocken und Gerstenflocken und legen Sie sie in die Gärbeutel, und fügen Sie zu jedem Beutel 100 ml destilliertes Wasser hinzu und mischen Sie den Inhalt der Beutel gründlich.
   5. Lassen Sie die nassen Körner 15-30 Minuten ruhen, um Feuchtigkeit vor dem Autoklavieren und Sterilisieren aufzunehmen. Bereiten Sie sechs Beutel für jeden Getreidetyp vor, und um eine Kontamination zu vermeiden, legen Sie die Beutel in andere Autoklavbeutel und autoklavieren Sie die Substrate bei 121 ° C für 55 min.
2. Herstellung von konidialem Suspensionsinokulum
   1. Ernten Sie 2-3 Wochen alte Pilzkonidien aus Pilzkulturen von M. pinghaense und M. robertsii durch Kratzen mit einer sterilen chirurgischen Klinge.
   2. Suspendieren Sie die gesammelten Pilzkonidien in 20 ml sterilem destilliertem Wasser, ergänzt mit 0,05% Tween 20, und mischen Sie die konidiellen Suspensionen für 2 min.
   3. Bereiten Sie 20 ml konidielle Suspensionen mit einer Konzentration von 1 × 10⁷ Konidien / ml vor und impfen Sie die Substrate für Haferflocken bzw. gefüllte Gersten.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Hämozytometer, um konidimale Konzentrationen zu bestimmen.
3. Impfung der festen Substrate
   1. Öffnen Sie jeden Beutel, indem Sie die Nackenstöpsel aus Watte entfernen, und fügen Sie die vorbereitete 20 ml konidielle Suspension dem gekühlten autoklavierten Substrat hinzu.
   2. Schließen Sie die Beutel erneut mit den Nackenstöpseln und massieren Sie den Inhalt des Beutels ein, damit sich das Pilzinokulum gleichmäßig mit dem Getreidesubstrat vermischt.
   3. Inkubieren Sie die Gärbeutel bei einer kontrollierten Temperatur von ± 25 °C und sorgen Sie für einen ausreichenden Gasaustausch zwischen Kultur und Umwelt.
      HINWEIS: Dieses Verfahren muss unter einem Laminar-Flow-Schrank durchgeführt werden.
4. Fermentationsphase
   1. Massieren Sie die Getreidesubstrate in den Gärbeuteln 2 Tage nach der Impfung und Inkubation manuell, wenn sichtbares Myzelwachstum auftritt und das Substrat durch den wachsenden Pilz verklumpt ist.
      HINWEIS: Dies geschieht, um das geimpfte Granulat zu mischen, damit in den ersten frühen Stadien des vegetativen Wachstums der Pilze eine myzelliche Verzweigung stattfinden kann.
   2. Verwenden Sie ein Küchen-Nudelholz, um das Substratbett zu manipulieren, um die physikalische Heterogenität der Getreidesubstratbetten und die Bettdicke der Substratmasse zu vermeiden.
      HINWEIS: Der Prozess fördert den Pilzstoffwechsel, der die Produktion von Pilzsporen optimiert und die Oberfläche maximiert, wodurch der konididale Ertrag gefördert^{wird 18}.
   3. Lassen Sie den Fermentationsprozess bis zu 4-5 Wochen andauern und überprüfen Sie die Fermentationsbeutel alle 2 Tage auf das Vorhandensein von weißem vegetativem Überwuchs, der sich während des Fermentationsprozesses entwickeln kann, was den Ertrag der Pilzkonidien stark beeinflussen kann.
      HINWEIS: Beenden Sie sofort die Fermentation in den Gärbeuteln, die weißes vegetatives Überwuchern enthalten, und trocknen Sie die Pilzkulturen¹⁸.

3. Blastosporen-Impfung

1. Blastosporenproduktion und -impfung
   1. Bereiten Sie ein flüssiges Kulturmedium vor, das 1 l destilliertes Wasser, 30 g Glukose, 20 g Hefeextrakt, 4 g Kaliumphosphat-Diabasis (K₂HPO₄), 15 ml Maissteillauge und 10 μg / ml Antibiotikum Streptomycin sowohl für M. pinghaense als auch für M . robertsii enthält.
   2. Erhitzen Sie zuerst das destillierte Wasser, schalten Sie es aus, bevor Sie den Siedepunkt erreichen, und fügen Sie jede der Zutaten, mit Ausnahme von Streptomycin, in das heiße Wasser im Topf hinzu. Bringen Sie das Medium 3-4 min lang sanft zum Kochen und rühren Sie das Medium ständig um, um das richtige Mischen der Zutaten zu ermöglichen und das Absetzen einiger Zutaten am Boden des Topfes zu verhindern.
   3. Gießen Sie insgesamt 100 ml des Mediums in neun verschiedene 250-ml-Kolben, legen Sie einen Wattestopfen auf jeden Kolben und bedecken Sie die Watte mit Aluminiumfolie als Stopfen (Abbildung 1A).
   4. Autoklavieren Sie das Medium in den Kolben für 55 min bei 121 °C. Lassen Sie nach der Autoklavierung das Medium in den Kolben abkühlen und fügen Sie dem Medium in jedem Kolben 10 mg/ml Streptomycin hinzu (Abbildung 1B).
   5. Sammeln Sie zwei bis drei bakterielle Schleifen von Pilzkonidien von 2-3 Wochen alten Pilzkulturplatten für die EPF-Isolate, M. pinghaense und M. robertsii, und übertragen Sie sie unter sterilen Bedingungen auf jedes 100 ml flüssige Medium in den 250-ml-Kolben und verschließen Sie die Kolben.
   6. Inkubieren Sie die flüssigen Kulturkolben bei ± 25 °C, auf einem Orbitalschüttler bei 140 U / min für 3 Tage und stoppen Sie die Inkubation, sobald die Kulturen Anzeichen einer hohen Trübung mit pilzlichem Blastosporenwachstum zeigen (Abbildung 1C).
   7. Um eine mögliche bakterielle Kontamination durch die Kulturen nachzuweisen, entnehmen Sie nach 24 Stunden während der Inkubation eine 100-μL-Probe aus jedem Flüssigkulturkolben und die Platte auf drei SDA-Platten pro Isolat. Inkubieren Sie die Platten für 48 h bei einer kontrollierten Temperatur von ± 25 °C.
2. Vorbereitung des festen Substrats
   1. Verwenden Sie parboiled langkörnigen weißen Reis als festes Substratmedium für die Blastosporen von M. pinghaense und M. robertsii (adaptiert von Jaronski und Jackson¹⁸).
   2. Bereiten Sie die Gärbeutel wie oben beschrieben in den Schritten 2.1.1-2.1.3 vor und fügen Sie für jeden Beutel 1 kg Reis und 300 ml steriles destilliertes Wasser hinzu.
   3. Mischen Sie vorsichtig den Inhalt der Gärbeutel und legen Sie ihn in äußere Autoklavenbeutel in aufrechter Position und Autoklav bei 121 ° C für 55 min. Lassen Sie die Substrate nach dem Autoklavieren unter sterilen Bedingungen für ± 45 Minuten abkühlen.
3. Impfung und Gärung
   1. Entfernen Sie den Verschluss jedes der flüssigen Kulturkolben von M. pinghaense und M. robertsii unter einer laminaren Strömung und brennen Sie den Rand jedes Kolbens für 10 s.
   2. Gießen Sie die 100-ml-Flüssigkulturen in die Fermentationsbeutel, indem Sie die Wattestopfen vom Hals nehmen (Abbildung 2). Setzen Sie die Baumwollstöpsel wieder auf und bedecken Sie die Oberseite des Halses der Tasche mit chirurgischem Papier, das mit einem Gummiband gesichert ist.
      HINWEIS: Bestimmen Sie die Blastosporenkonzentration für jeden Kolben mit einem Hämozytometer und verwenden Sie Blastosporenkonzentrationen von 1 × 10⁷ - 5 × 10⁸ Blastosporen / ml, um die Substrate²⁸ zu innokulieren.
   3. Drehen Sie den oberen Teil des Beutels und mischen Sie den Inhalt des Beutels durch Schütteln und leichte Manipulation des Substrats durch Massage und inkubieren Sie die Beutel bei ± 25 ° C, indem Sie das Substrat in den Beuteln abflachen, um die Bildung dicker Betten^{zu verhindern 18}.
   4. Brechen Sie das Substrat in den Gärbeuteln durch Massieren des Inhalts der Beutel, 2-3 Tage nach der Impfung und der Inkubation, wenn sichtbares Myzelwachstum und die Bindung des Substrats durch den Pilz aufgetreten sind (angepasst an die Technik von Jaronski und Jackson¹⁸).
      HINWEIS: Lassen Sie die Fermentation 4 Wochen lang fortsetzen.

Abbildung 1: Flüssiges Kulturmedium in 250-ml-Kolben. (A) Vor der Autoklavierung. (B) Nach Autoklavierung und Inokulation mit EPF-Sporen. (C) Trübes Medium mit pilzlichen Blastosporen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Zubereitetes Blastosporen-Flüssigkulturmedium. (A) Metarhizium robertsii und (B) Metarhizium pinghaense vor der Beimpfung von Reis als festem Substrat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Trocknung von Pilzkulturen

1. Trocknen Sie die Pilzkulturen für 10-12 Tage nach der Fermentation, bevor sie in Versuchen verwendet werden, indem Sie die sporulierten Kulturen in 26-30 kg (30 x 43 x^{15250 cm 3}) braune Papiertüten umfüllen.
2. Um die Zugfestigkeit der Papiertüten zu verbessern, schneiden Sie ein Drittel des oberen Teils jedes Beutels horizontal ab und kleiden Sie den Boden des Beutels aus (Abbildung 3A, B).

Abbildung 3: Vorbereitung von Papiertüten, Trocknungsverfahren von Kulturen und Verpackung. (A,B) Die Herstellung von braunen Papiertüten. Das Trocknungsverfahren von Metarhizium-Artenkulturen, die auf (C,E) Parboiled-Reis und (D,F)-Gerstenflocken angebaut werden. (G) Papiertüten, die mit Heftklammern verschlossen sind, um eine dreieckige Zeltstruktur zu schaffen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Zerbröckeln Sie vorsichtig das Substrat in jedem Gärbeutel, schneiden Sie die Ecke jedes Beutels ab und übertragen Sie die gesamte Kultur durch den durch die abgeschnittene Ecke verbleibenden Raum auf die Papiertüten (Abbildung 3C-F). Um das übermäßige Austreten von Pilzsporen in die Luft zu vermeiden, führen Sie diesen Prozess langsam durch.
   HINWEIS: Führen Sie diesen Prozess unter sterilen Bedingungen unter laminaren Strömungen durch, um eine Kontamination zu vermeiden.
4. Beschriften Sie jede Papiertüte und falten Sie sie zweimal über das obere Ende jeder Tasche und schließen Sie sie mit Klammern, um eine dreieckige Zeltstruktur zu schaffen, und legen Sie die Taschen auf Drahttrocknungsgestelle, um eine ordnungsgemäße, gleichmäßige Trocknung bei einer kontrollierten Temperatur von ± 25 ° C und einer niedrigen Luftfeuchtigkeit von 30-40% zu ermöglichen.
5. Drehen Sie die Beutel täglich, um eine gleichmäßige Trocknung der Kulturen zu ermöglichen und ein vegetatives Nachwachsen zu vermeiden, das den Ertrag an erntefähigen Pilzsporen verringern würde.
6. Wiegen Sie jeden Trocknungsbeutel alle 2 Tage während des Trocknungsprozesses und setzen Sie den Trocknungsprozess für jeden Beutel fort, bis wenig bis keine Veränderung in der Masse der Beutel zwischen den aufeinanderfolgenden Tagen beobachtet wird.

5. Ernte von Pilzkonidien

1. Pilzkonidien mechanisch aus den Kulturen mit drei verschachtelten Sieben ernten, einem Testsieb (ETS) Mesh Nr. 35 (mit 500-μm-Öffnung), verschachtelt auf einem Testsieb (mit 212-μm-Öffnung), verschachtelt auf ETS-Mesh Nr. 100 (mit 150-μm-Öffnung), montiert auf einer Auffangwanne.
2. Legen Sie die Trockenkulturprobe langsam auf das ETS-Netz Nr. 35 und legen Sie einen Deckel auf das Sieb, um die Freisetzung von Pilzkonidien in die Luft zu verhindern.
3. Fügen Sie 10-12 Glasmurmeln zu den Sieben hinzu, um den Durchgang der Pilzkonidien durch die Netzsiebe zu unterstützen und die Retention der Konidien im Sieb zu vermeiden, was zu einer verminderten Sporenausbeute führen kann.
4. Kleben und versiegeln Sie die Siebverbindungen mit Elektroband, um das Entweichen von Staub zu verhindern.
5. Legen Sie die Siebe auf einen Vibrationsschüttler, der mit einem klebrigen Pad ausgestattet ist, um die Auffangwanne und die Siebe für 20-25 min bei einer Bewegung von 560-640 Vibrationen pro Minute zu sichern (Abbildung 4).
   HINWEIS: Technik angepasst von Jaronski und Jackson¹⁸.

Abbildung 4: Ernte von Pilzsporen aus getrockneten Metarhizium robertsii-Kulturen auf Reis und Gerstenflocken. (A) 10-12 Glasmurmeln, die den Sieben hinzugefügt wurden, um den Durchgang der Pilzkonidien durch die Netzsiebe zu erleichtern. M. robertsii conidia aus Kulturen auf (B) Reis geerntet und (C) kaum geflockt. (D) Siebt auf einem Vibrationsschüttler. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

6. Entfernen Sie die Analysensiebe aus der Auffangwanne, sammeln Sie Konidien und lagern Sie die gesammelten Konidien in luftdichten und wasserundurchlässigen Reißverschlussbeuteln zur Langzeitlagerung (3-6 Monate).

6. Quantifizierung der produzierten Pilzkonidien

1. Messen und erfassen Sie die Masse jedes Getreidesubstrats vor der Ernte der Pilzkonidien von jedem Substrat.
2. Messen Sie das Gesamtgewicht der gesammelten Konidien, indem Sie die Masse der gesammelten Sporen von der Masse des festen Substrats abziehen.
   HINWEIS: Der gesamte Konidienertrag umfasst nicht nur die geernteten Konidien, sondern auch die Pilzkonidien, die auf dem festen Substrat verbleiben.
3. Wiegen Sie das Substrat und entfernen Sie 10 g aus dem gewogenen Substrat. Die 10 g des Substrats in 0,05% Tween 20 suspendieren und in 10 ml sterilem destilliertem Wasser verdünnen.
4. Mischen Sie die Suspension für 2 min und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Sporenzählung durchzuführen, um die Anzahl der vom Substrat gewaschenen Konidien zu bestimmen.
5. Führen Sie weitere Verdünnungen durch, indem Sie 1000 μL der 10 ml gewaschenen konidiellen Suspension auf 9 ml steriles destilliertes Wasser übertragen, um 10 ml Verdünnungssuspensionen zu bilden.
6. Wirbelmischen Sie die konidiellen Suspensionen für 2 min und bestimmen Sie die konidiellen Konzentrationen.
   HINWEIS: Befolgen Sie das von Inglis, Enkerli und Göttel³⁰ beschriebene Verfahren und die Formel, um die konidielle Konzentration der Suspensionen zu bestimmen.
7. Sammeln und suspendieren Sie insgesamt 0,1 g des gesammelten konidiellen Pulvers aus jeder Kultur in 10 ml sterilem destilliertem Wasser, ergänzt mit 0,05% Tween 20, und mischen Sie die konidielle Suspension für 2 min und bestimmen Sie die konidielle Konzentration mit einem Hämozytometer.
8. Führen Sie weitere Verdünnungen durch, indem Sie 1000 μL der 10 ml konidiellen Suspension auf 9 ml steriles destilliertes Wasser übertragen, um die 10 ml Suspensionsverdünnungen zu bilden.
9. Mischen Sie die konidialen Suspensionen für 2 min, berechnen Sie die konidiellen Konzentrationen und bestimmen Sie die Anzahl der Konidien pro Gramm.
10. Multiplizieren Sie die Anzahl der Konidien pro Gramm geerntetem Pulver mit der Anfangsmasse des geernteten Konidienpulvers. Multiplizieren Sie die Anzahl der aus dem Substrat gewaschenen Konidien mit dem Gesamtgewicht des verbrauchten Substrats, das das Substrat ist, von dem die Konidien geerntet wurden.
11. Addieren Sie die beiden angegebenen Werte zusammen und dividieren Sie sie durch das anfängliche Trockengewicht des Substrats, um die Anzahl der Konidien pro kg oder g des Substrats¹⁸ zu berechnen.
    HINWEIS: Die Berechnungen wurden hauptsächlich für das Reissubstrat durchgeführt. Der Keimungs- oder Konidiallebensfähigkeitstest wurde sowohl für die M. pinghaense - als auch für die M. robertsii-Isolate durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der produzierten Konidien zu bestimmen.

7. Datenanalyse

1. Verwenden Sie eine geeignete Computersoftware, um die statistische Analyse der erhaltenen Ergebnisse durchzuführen.
   HINWEIS: Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit STATISTICA Version 13.5.0.17.

Ergebnisse

Ein Rückgang der Inhaltsmasse der Kulturen auf Reis sowohl für die M. pinghaense als auch für die M. robertsii wurde im Laufe der Zeit während der Trocknungsphase der Pilzkulturen beobachtet, wobei keine oder nur eine geringe Veränderung in der Masse beobachtet wurde, sobald die Kulturen trocken waren (Abbildung 5). Das geerntete trockene Pilzkonidienpulver sowohl der M. pinghaense als auch der M. robertsii ist in Abbildung 6

Diskussion

Die erfolgreiche Integration mikrobieller Wirkstoffe zur biologischen Bekämpfung wichtiger landwirtschaftlicher Insektenschädlinge in ein Agrarökosystem hängt sowohl vom Erfolg als auch von der Leichtigkeit der Massenproduktion der Entomopathogene als erster Schritt unter Laborbedingungen ab. Die Massenproduktion von EPF ist wichtig für die großtechnische Anwendung und Verfügbarkeit von EPF-Produkten für IPM-Programme unter biologischer Kontrolle 9,10,11,12,13.^...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Tween 20	Lasec		Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles	Lasec		Used to make conidial suspensions
Aluminium foil			Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave			Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags	Lasec		Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape	Lasec		To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags			Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor	SIGMA	66071-94-1	Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool	Lasec		Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles	Neolab		Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape			Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask	Lasec		Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%)	Lasec		Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley	Health Connection Wholefoods		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats	Tiger brands		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose	Merck		Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators			For growing fungal conidia culture
Haemocytometer			Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops	Lasec		For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin			Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet	ESCO Laminar Flow Cabinet		Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia	Stellenbosch University	5HEID	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia	Stellenbosch University	6EIKEN	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope	ZEIZZ (Scope. A1)		Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker	IncoShake- LABOTEC		Used for the blastospore production process
Parboiled rice	Spekko		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin	SIGMA		Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes	Lasec		Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips	Labnet (BioPette PLUS)		Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe			Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	SIGMA-ALDRICH		Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band			Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA)	NEOGEN Culture Media		Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water			To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad			Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade	Lasec		Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper	Lasec		Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker			Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract	Biolab		Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags	GLAD		Used to to store harvested fungal conidia