昆虫病原性真菌、メタリシウム・ロベルツィイおよびメタリシウム・ピンヘーンセの大量生産、害虫に対する商業利用

要約

昆虫病原性真菌は、農業害虫の生物防除剤として重要性を増している。この研究では、害虫に対する商業利用のために、 Metarhizium robertsii および M. pinghaense の両方の南アフリカの分離株の十分な数の弾力性感染性プロパグルの大量生産が、農業穀物製品を使用して首尾よく行われた。

要約

メタリジウム・アニソプリアエ種複合体の昆虫病原性真菌は、農業害虫の生物防除剤として重要性を増している。化学殺虫剤に対する害虫抵抗性の増加、殺虫剤の人間の健康への悪影響に関する懸念の高まり、および農薬による環境汚染は、作物保護と害虫駆除のための新しい持続可能な戦略を見出す世界的な推進力をもたらしました。これまで、ボーベリア・バッシアナのような昆虫病原性真菌(EPF)種を大量培養する試みが行われている。しかしながら、昆虫害虫に対する使用のためにメタリジウム・ロベルツィイおよびM. pinghaenseを大量培養する試みは限定的にしか行われていない。この研究は、M. robertsiiおよびM. pinghaenseの南アフリカの分離株の十分な数の弾力性感染性伝播剤を商業用途のために大量生産することを目的としていた。3つの農業穀物製品、フレークドオート麦、フレーク大麦、および米をEPF固体発酵基質として使用した。2つの接種方法、分生子懸濁液および胚芽胞子の液体真菌培養物を固体基質に接種するために使用した。分生子懸濁液を用いた接種は、ブラストスポア接種法を使用した場合と比較して固体基質上に増加したレベルの汚染が観察されたため、比較的効果が低いことが観察された。フレーク状のオート麦は、M. robertsiiとM. pinghaenseの両方にとって適切な成長基質ではないことが判明し、基質から乾燥分生子が採取されなかった。フレーク状の大麦は、M. pinghaenseのそれよりもM. robertsii conidiaの生産に有利であることが見出され、平均1.83g±1.47gの乾燥M. robertsii分生子および0グラムのM. pinghaense分生子が基質から収穫された。 米粒は、M. pinghaense分離株とM. robertsii分離株の両方の分生子大量生産に有利に働くことが見出され、基質から収穫された±平均8.2g±4.38gおよび6gである。

概要

昆虫病原性真菌(EPF)は、重要な農業害虫の生物学的防除における作物保護剤として重要性を増している^1、2。土壌中に自然に発生する昆虫病原体は、様々な害虫種の集団に流行を引き起こす³。EPFの種は宿主特異的であり、非標的種を攻撃するという点で比較的リスクが少なく、環境に対して毒性がない⁴。EPF には、ホストに侵入するための独自のメカニズムと、その直接の環境での伝播と永続化のための独自のメカニズム^{があります 1}。彼らは主に宿主のキューティクルに付着して浸透する無性胞子を介して宿主を攻撃し、宿主のヘモコエルに侵入して増殖する。宿主は、最終的に血リンパ栄養素の枯渇のために、または真菌によって放出される毒性代謝産物によって引き起こされる毒素血症の結果として死亡する。死後、理想的な環境条件下で、真菌は宿主死体^5,6の外表面(明白な真菌症)に出現する。

残留化学物質が人間の健康、環境汚染、および害虫抵抗性の開発に及ぼす悪影響に関する懸念の高まりは、化学ベースの殺虫剤の投入を減らし、作物保護と害虫駆除のための代替的で斬新で持続可能な戦略を見つける世界的な推進力^{をもたらしました}6,7,8 .これは、従来の化学防除よりも生態学的に有利な戦略である統合害虫管理(IPM)プログラムで使用するための微生物ベースの殺虫剤を開発する機会を提供しました^3,8。

農業害虫のための微生物防除剤の開発を成功させるためには、まず適切な生物を単離し、特徴付け、同定し、標的害虫に対するその病原性を確認しなければならない。しかしながら、微生物剤の大規模生産のための容易で費用対効果の高い方法は、生物学的制御プログラム⁹、^10、11、^12、13において使用するための生存可能な生成物を製造するために必要とされる。相当量の良質の昆虫病原体の大量生産は、微生物株、環境、標的害虫、製剤、市場、施用戦略、および所望の最終製品^{に依存する14、15、16}。EPFは、胚芽胞子を生成するための液体基質発酵または空中分生子^6、17、18を生成する固体基質発酵プロセスを使用して大量生産することができる。しかし、昆虫病原体の大量生産および製剤化プロセスは、最終製品の病原性、コスト、貯蔵寿命、および現場有効性に直接影響する。IPMでの使用を成功させるためには、昆虫病原体の生産プロセスは、実行が容易で、最小限の労力を必要とし、毒性、生存可能、および持続性の高収量濃度のプロパグルを生産し、低コストでなければならない4,13,14,16。

昆虫病原体の栄養要件を理解することは、すべての培養方法による大量培養にとって重要である^4,12。生産培地の栄養成分は、生物防除有効性、収量、乾燥耐性、および持続性を含む、結果として生じるプロパグルの属性に重大な影響を及ぼす⁸、¹⁹、^20、21。生産手順の最適化は、このような要因^{に対処するように設計されています 22}.EPFにとって、真菌分生子の良好な成長、胞子形成、および大量生産のための主な要件は、適切な水分、最適な成長温度、pH、_{CO2およびO2}のガス交換、ならびに良好なリン、炭水化物、炭素_、および窒素源を含む栄養である¹⁸。

JaronskiとJackson¹⁸は、自然条件下では、真菌の分生子が昆虫の死体の表面のような固体直立構造に担がれるため、固体基質発酵法を液体基質発酵法と比較してEPF生産のための自然プロセスに最も効率的かつ最も近い近似法として記述している。デンプンを含む農産物および副産物は、真菌が菌糸先端からの高濃度加水分解酵素の分泌を介してデンプンを容易に分解し、固体物質に浸透し、物質中に存在する栄養素にアクセスするため、主に低クレアリア菌の大量生産に使用されている¹¹、^17、18、23.穀物製品はまた、それらが水和および滅菌されると、基質が任意の液体媒体¹⁶、^18、24からさらなる栄養素を吸収することができるので、健康なバイオマス生産のための要件を提供する。

以前は、いくつかの研究がボーベリア・バッシアナ(Bals)のようなEPF種を大量培養しようと試みた。Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.)ViegasとMetarhizium anisopliae(Metschn)の一部。ソロキン種複合体は、種々の基質^16、23、24上に単離する。このような大量生産され商業的に開発された分離株には、M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humberから開発されたGreen Muscle^®(株IMI 330189)、Metarhizium 69(Meta 69株ICIPE69)、およびM. anisopliaeから開発されたReal Metarhizium 69(L9281)、およびB. bassiana^25,26から開発されたBroadband^® (株PPRI 5339)およびEco-Bb^®が含まれる。.しかし、Metarhizium robertsii J.F. Bisch、S.A. Rehner & Humber、Metarhizium pinghaense Chen & Guoを大量培養する試みは限定的である。これら2つの分離株は、以前の研究で、ミツバチ、Pseudococcus viburni Signoret(半翅目:Pseudococcidae)の防除に最も効果的であるものとして選択されました²⁷。したがって、現在の研究は、害虫に対する商業的適用のために、M. robertsiiおよびM. pinghaenseの局所分離株の十分な数の弾力性のある感染性プロパグルを処方し、大量生産することを目的としていた。固体基質発酵法を用いて、両方のEPF分離株について真菌分生子を大量生産した。2つのEPF接種法は、分生子懸濁液および胚芽胞子の液体真菌培養物を使用して、固体基質を接種するために使用した。

プロトコル

1.真菌株の供給源

1. 南アフリカの西ケープ州のリンゴ果樹園から採取したM. pinghaense 5 HEID(GenBankアクセッション番号:MT367414/MT895630)とM. robertsii 6EIKEN(MT378171/MT380849)の両方の南アフリカの単離真菌株を使用してください。
2. 各EPF分離株の培養物を、1gの酵母エキス(SDAY)および10μLのストレプトマイシンを添加した60gのサブローデキストロース寒天培地上で増殖させる。
   注:EPF培養物を暗所で±25°Cの制御された温度でインキュベートする。

2. メタリシウム・ピンヘーンセ  および M.ロベルツィイ 分生子懸濁液接種

1. 固体基質の調製
   1. 発酵バッグとして、2つのEPF分離株およびオートクレーブバッグ(305mm×660mm)の成長培地として、2つの農産物、すなわちフレークドオート麦およびフレークドオオムギを使用する。
   2. 小さなポリ塩化ビニル廃液パイプ(1000mm×50mm)を使用して、オートクレーブバッグの開放端に発酵バッグ用のネックを作成し、オートクレーブテープを使用してパイプをバッグに固定します。
   3. 発酵中に十分なガス交換を可能にするために、滅菌コットンウールプラグでパイプを閉じます。
   4. フレークドオート麦とフレーク大麦の両方の乾燥穀物(200g)を計量して発酵バッグに入れ、各バッグに100mLの蒸留水を加え、バッグの内容物を十分に混合する。
   5. 濡れた穀物を15〜30分間休ませて、オートクレーブと滅菌の前に水分を吸収します。粒種ごとに6袋を用意し、汚染を防ぐため、他のオートクレーブ袋に袋を入れ、基材を121°Cで55分間オートクレーブした。
2. 分生子懸濁液接種の調製
   1. M. pinghaenseおよびM. robertsiiの両方の真菌培養物から2〜3週齢の真菌分生子を掻き取り、滅菌手術ブレードを使用して収穫する。
   2. 回収した真菌分生子を20mLの滅菌蒸留水に懸濁し、0.05%Tween 20を補充し、分生子懸濁液を2分間ボルテックスミックスする。
   3. 1 ~¹⁰⁷ 分生子/mLの濃度で20 mLの分生子懸濁液を調製し、それぞれフレークドオート麦×フレーク大麦固体基質を接種する。
      注:分生子濃度を決定するために血球計数器を使用してください。
3. 固体基質の接種
   1. コットンウールネックプラグを取り外して各袋を開き、調製した20mL分生子懸濁液を冷却したオートクレーブ処理基材に加える。
   2. 首栓を使用して袋をもう一度閉じ、袋の内容物をマッサージして、真菌の接種物が穀物基質と均一に混合されるようにします。
   3. 発酵バッグを±25°Cの制御された温度でインキュベートし、培養物と環境との間の十分なガス交換を確実にする。
      メモ: この手順は、層流キャビネットの下で行う必要があります。
4. 発酵段階
   1. 接種およびインキュベーションの2日後に発酵バッグ内の穀物基質を手動でマッサージし、目に見える菌糸成長が起こり、基質が増殖する真菌によって凝集し始めたとき。
      注:これは、菌類の栄養成長の最初の初期段階で菌糸枝分かれが起こることを可能にするために、接種された顆粒を混合するために行われる。
   2. キッチンの麺棒を使用して基板ベッドを操作し、粒子基板ベッドの物理的な不均一性および基板質量のベッド厚さを回避します。
      注:このプロセスは、真菌の胞子産生を最適化し、表面積を最大化し、分生子収量を促進する真菌代謝を促進する¹⁸。
   3. 発酵プロセスを最大4〜5週間継続させ、発酵プロセス中に発生する可能性のある白い栄養過成長の存在について発酵バッグをチェックし、真菌の分生子収量に大きく影響する可能性があります。
      注:任意の白色栄養過剰増殖を含む発酵バッグ内の発酵を直ちに終了し、真菌培養物¹⁸を乾燥させる。

3. 芽球胞子接種

1. 芽胞子の産生と接種
   1. M. pinghaenseとM. robertsiiの両方について、1Lの蒸留水、30gのグルコース、20gの酵母エキス、4gのリン酸亜塩基性カリウム(_K2HPO4)、15mLのコーンスティープリカー、および10μg/mLの抗生物質ストレプトマイシンを含む液体培地を調製する。
   2. まず、蒸留水を加熱し、沸点に達する前にスイッチを切って、ストレプトマイシンを除く各成分を鍋の中のお湯に加えます。培地を3〜4分間穏やかに沸騰させ、成分の適切な混合を可能にし、ポットの底にいくつかの成分が沈降するのを防ぐために培地を絶えず攪拌する。
   3. 合計100mLの培地を9つの異なる250mLフラスコに注ぎ、各フラスコにコットンウールプラグを置き、ストッパーとしてコットンウールをアルミホイルで覆った(図1A)。
   4. フラスコ内の培地を121°Cで55分間オートクレーブする。 オートクレーブ処理に続いて、フラスコ内の培地を冷却し、各フラスコ内の培地に10mg/mLのストレプトマイシンを加えます(図1B)。
   5. EPF分離株M. pinghaenseおよびM. robertsiiの両方について、2〜3週齢の真菌培養プレートから真菌分生子の2〜3細菌ループを収集し、滅菌条件下で、250mLフラスコ内の各100mL液体培地に移し、フラスコを密封する。
   6. 液体培養フラスコを±25°Cでインキュベートし、140rpmでオービタルシェーカー上で3日間、培養物が真菌芽胞子増殖を伴う高い濁度の徴候を示したらインキュベーションを停止した(図1C)。
   7. 培養物からの細菌汚染の可能性を検出するには、インキュベーション中に24時間後に各液体培養フラスコから100μLのサンプルを引き出し、単離物ごとに3つのSDAプレート上にプレートします。プレートを±25°Cの制御温度で48時間インキュベートする。
2. 固体基板の作製
   1. M. pinghaenseとM. robertsiiの両方の芽胞子の固体基質培地として、パーボイルした長粒白米を使用する(JaronskiとJackson¹⁸から適応)。
   2. 上記のように発酵バッグをステップ2.1.1〜2.1.3で準備し、各バッグに1kgの米と300mLの滅菌蒸留水を加える。
   3. 発酵バッグの内容物を穏やかに混合し、外側のオートクレーブバッグに直立姿勢で入れ、オートクレーブを121°Cで55分間行った。オートクレーブ処理に続いて、滅菌条件下で基板を± 45分間冷却します。
3. 接種と発酵
   1. 層流下で M. pinghaense および M. robertsii の両方の液体培養フラスコの各々の閉鎖を解除し、各フラスコの縁を10秒間炎上させる。
   2. 100mLの液体培養物を発酵バッグに注ぎ、コットンウールプラグを首から取り外します(図2)。綿のプラグを元に戻し、バッグの首の上部を輪ゴムで固定された手術用紙で覆います。
      注:血球計数器を使用して各フラスコの胚盤胞子濃度を決定し、1 ×¹⁰⁷ - 5 × 108 胚芽胞子/mLの胚芽胞子濃度を使用して基質²⁸を無菌化する。
   3. 袋の上部をひねり、マッサージによる基板の振とうと軽い操作により袋の内容物を混ぜ合わせ、±25°Cで袋をインキュベートし、袋内の基板を平らにすることにより、厚いベッド¹⁸の形成を防止する。
   4. 袋の内容物をマッサージすることによって発酵バッグ内の基質を破り、接種およびインキュベーションの2〜3日後に、真菌による基質の目に見える菌糸成長および結合が生じていた(JaronskiおよびJackson¹⁸の技術から適合)。
      注:発酵を4週間継続させる。

図1:250mLフラスコ内の液体培養液。(b)オートクレーブ処理後、EPF胞子を接種する。(c)真菌芽球胞子を有する濁質培地。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:胚盤胞子液体培地を調製した。 (A)メタリシウム・ロベルツィイ及び(B)メタリシウム・ピンヘンセは、固体基質としてのイネの接種前。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 真菌培養物の乾燥

1. 真菌培養物を発酵後10〜12日間乾燥させ、試験に使用する前に、胞子状培養物を26〜30kg(30 x 43 x 15250 cm³)の茶色の紙袋に移す。
2. 紙袋の引張強度を向上させるために、各袋の上部の3分の1を水平に切り落とし、袋の底部を線で引いた(図3A、B)。

図3:紙袋の調製、培養物の乾燥手順、および包装。(C,E)パーボイルド米および(D,F)フレーク大麦上で栽培したメタリジウム種培養物の乾燥手順。(G)紙袋をステープルで閉じて三角形のテント構造を作る。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 各発酵袋内の基質を穏やかに崩壊させ、各袋の角を切り取り、切り取られた角が残した空間を通して培養物全体を紙袋に移す(図3C-F)。真菌胞子の空気中への過度の逃避を避けるために、このプロセスをゆっくりと実行してください。
   注:汚染を避けるために、層流を使用して滅菌条件下でこのプロセスを実施してください。
4. 各紙袋にラベルを付け、各袋の上端を2回折り、ステープルで閉じて三角形のテント構造を作成し、ワイヤー乾燥ラックに袋を置き、±25°Cの制御された温度と30〜40%の低湿度で適切で乾燥させる。
5. 培養物の乾燥を均一にし、収穫可能な真菌胞子の収量を低下させる可能性のある栄養再成長を避けるために、毎日袋を回してください。
6. 乾燥工程中に2日毎に各乾燥袋を秤量し、連続する日の間に袋の質量にほとんどまたは全く変化が認められなくなるまで各袋について乾燥処理を継続する。

5.真菌分生子の収穫

1. 3つの入れ子付きふるいを用いて培養物から機械的に真菌分生子を採取し、試験篩(ETS)メッシュ番号35(500μm開口付き)、試験篩(212μm開口付き)、ETSメッシュ100号(150μm開口付き)に入れ子にし、収集パンに取り付けた。
2. 乾式培養サンプルをETSメッシュ35号篩にゆっくりと装填し、真菌分生子が空気中に放出されないようにふたをふるいにかける。
3. 10〜12個のガラス大理石をふるいに追加して、メッシュスクリーンを通る真菌分生子の通過を支援し、篩内の分生子の保持を回避し、胞子の回復を減少させる可能性がある。
4. 電気テープを使用してふるいの目地をテープで留めて密封し、分生子のほこりが逃げないようにします。
5. 粘着性パッドを取り付けた振動シェーカーの上にふるいを置き、収集パンとふるいを毎分560〜640振動の動きで20〜25分間固定します(図4)。
   注:ヤロンスキーとジャクソン¹⁸から適応したテクニック。

図4:イネおよびフレーク化オオムギ上の乾燥 メタリジウム・ロベルツィイ 培養物からの真菌胞子の収穫。 (A)メッシュスクリーンを通る真菌分生子の通過を助けるためにふるいに10〜12個のガラス大理石を加える。 M. robertsii conidiaは、(B)米の培養物から収穫され、(C)かろうじてフレークされた。(D)振動シェーカーでふるいにかける。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. 試験ふるいを収集パンから取り出し、分生子を収集し、収集した分生子を気密で水不透過性のジッパーロックバッグに保管し、長期保存(3〜6ヶ月)します。

6. 生産される真菌分生子の定量化

1. 各基質から真菌分生子を採取する前に、各粒子基質の質量を測定し、記録する。
2. 固体基質の質量から収集された胞子の質量を差し引くことによって、収集された分生子の全体重量を測定する。
   注:総分生子収量は、収穫された分生子だけでなく、固体基質上に残された真菌分生子も含む。
3. 基板を秤量し、秤量した基板から10gを取り出す。10 gの基質を0.05%Tween 20に懸濁し、10 mLの滅菌蒸留水で希釈する。
4. 懸濁液を2分間ボルテックスミックスし、血球計数器を使用して胞子数を行い、基質から洗浄した分生子の数を求めた。
5. 10 mL洗浄した分生子懸濁液1000 μLを9 mLの滅菌蒸留水に移してさらに希釈を行い、10 mLの希釈懸濁液を作ります。
6. 分生子懸濁液を2分間渦混合し、分生子濃度を決定する。
   注:Inglis、Enkerli、およびGoettel³⁰ によって説明されている手順および式に従って、懸濁液の分生子濃度を決定する。
7. 各培養物から回収した分生子粉末の合計0.1gを0.05%Tween 20を添加した滅菌蒸留水10mLに回収・懸濁し、分生子懸濁液を2分間ボルテックスミックスし、血球計数器を用いて分生子濃度を求めた。
8. 10 mLの分生子懸濁液1000 μLを9 mLの滅菌蒸留水に移してさらに希釈を行い、10 mLの懸濁液希釈液を作ります。
9. 渦 - 分生子懸濁液を2分間混合し、分生子濃度を計算し、グラムあたりの分生子の数を決定する。
10. 採取した粉末のグラム当たりの分生子の数に、採取した分生子粉末の初期質量を掛ける。基質から洗浄された分生子の数に、分生子が採取された基質である使用済み基質の総重量を掛ける。
11. 2つの所与の値を一緒に加算し、基質の初期乾燥重量で除して、基質¹⁸のkgまたはg当たりの分生子の数を計算する。
    注:計算は主に米基質について行われた。発芽または分生子生存率試験を 、M. pinghaense 分離株および M. robertsii 分離株の両方について実施し、産生された分生子の生存率を決定した。

7. データ解析

1. 適切なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して、得られた結果の統計分析を行います。
   注: データの統計分析は、STATISTICA バージョン 13.5.0.17 を使用して行われました。

結果

M. pinghaenseとM. robertsiiの両方について、イネ上の培養物の含量質量の減少は、真菌培養物の乾燥段階で経時的に観察され、培養物が乾燥した後、質量に変化は見られなかったか、またはほとんど観察されなかった(図5)。M. pinghaenseとM. robertsiiの両方の回収された乾燥真菌分生子粉末を図6に示す。

ディスカッション

農業生態系における重要な農業害虫の生物学的防除のための微生物剤の統合の成功は、実験室条件下での第一歩としての昆虫病原体の成功と大量生産の容易さの両方に依存する。EPFの大量生産は、生物学的制御⁹、^10、11、^12、13を用いたIPMプログラムのためのEPF製品の大?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Tween 20	Lasec		Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles	Lasec		Used to make conidial suspensions
Aluminium foil			Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave			Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags	Lasec		Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape	Lasec		To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags			Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor	SIGMA	66071-94-1	Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool	Lasec		Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles	Neolab		Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape			Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask	Lasec		Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%)	Lasec		Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley	Health Connection Wholefoods		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats	Tiger brands		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose	Merck		Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators			For growing fungal conidia culture
Haemocytometer			Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops	Lasec		For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin			Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet	ESCO Laminar Flow Cabinet		Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia	Stellenbosch University	5HEID	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia	Stellenbosch University	6EIKEN	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope	ZEIZZ (Scope. A1)		Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker	IncoShake- LABOTEC		Used for the blastospore production process
Parboiled rice	Spekko		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin	SIGMA		Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes	Lasec		Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips	Labnet (BioPette PLUS)		Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe			Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	SIGMA-ALDRICH		Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band			Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA)	NEOGEN Culture Media		Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water			To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad			Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade	Lasec		Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper	Lasec		Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker			Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract	Biolab		Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags	GLAD		Used to to store harvested fungal conidia