ייצור המוני של פטריות אנטומופתוגניות, Metarhizium robertsii ו - Metarhizium pinghaense, ליישום מסחרי נגד חרקים מזיקים

Summary

פטריות אנטומופתוגניות צברו חשיבות כחומרי ההדברה הביולוגית של מזיקים חרקים חקלאיים. במחקר זה, הייצור ההמוני של מספר מספיק של התפשטות זיהומית גמישה של מבודדים דרום אפריקאים הן של Metarhizium robertsii והן של M. pinghaense ליישום מסחרי נגד מזיקים חרקים נערך בהצלחה באמצעות מוצרי תבואה חקלאיים.

Abstract

פטריות אנטומופתוגניות של קומפלקס המינים Metarhizium anisopliae צברו חשיבות כסוכני ההדברה הביולוגית של מזיקים חרקים חקלאיים. העלייה בעמידות המזיקים לקוטלי חרקים כימיים, החששות הגוברים לגבי ההשפעות השליליות של קוטלי חרקים על בריאות האדם והזיהום הסביבתי מחומרי הדברה הובילו לדחף עולמי למצוא אסטרטגיות קיימות חדשניות להגנת הצומח ולהדברת מזיקים. בעבר נערכו ניסיונות לתרבות המונית כגון מיני פטריות אנטומופתוגניות (EPF) כמו Beauveria bassiana . עם זאת, רק ניסיונות מוגבלים נעשו לתרבות ההמונים Metarhizium robertsii ו - M. pinghaense לשימוש נגד מזיקים חרקים. מחקר זה נועד לייצר באופן המוני מספר מספיק של התפשטות זיהומית גמישה של מבודדים דרום אפריקאים של M. robertsii ו- M. pinghaense ליישום מסחרי. שלושה מוצרי תבואה חקלאיים, שיבולת שועל מתקלפת, שעורה מתקלפת ואורז, שימשו כמצעי התסיסה המוצקים של EPF. שתי שיטות חיסון, תרחיפים חרוטיים ותרבות הפטריות הנוזלית של בלסטוספורים שימשו לחיסון המצעים המוצקים. חיסון באמצעות תרחיפים חרוטיים נצפה כפחות יעיל יחסית, שכן רמות מוגברות של זיהום נצפו על המצעים המוצקים ביחס לשימוש בשיטת החיסון של בלסטוספורה. שיבולת שועל מתקלפת נמצאה לא כמצע גידול מתאים הן ל-M. robertsii והן ל-M. pinghaense, מכיוון שלא נקטפו קונידיה יבשה מהמצע. נמצא כי שעורה מתקלפת מעדיפה את הייצור של M. robertsii conidia על פני זו של M. pinghaense, וממוצע של 1.83 גרם ± 1.47 גרם של M. robertsii conidia יבש ואפס גרם של M. pinghaense conidia נקטף מהמצע. גרגרי אורז נמצאו כמעדיפים את הייצור ההמוני החרוטי של מבודדי M. pinghaense ו-M. robertsii , עם ממוצע של 8.2 גרם ± 4.38 גרם ו-6 גרם ± 2 גרם שנקטפו מהמצע, בהתאמה.

Introduction

פטריות אנטומופתוגניות (EPF) צברו חשיבות כחומרים להגנת הצומח בהדברה ביולוגית של מזיקים חקלאיים חשובים ^1,2. האנטומופתוגנים, המתרחשים באופן טבעי בקרקע, גורמים לאפיזוטיקה באוכלוסיות של מיני מזיקים שונים³. המינים של EPF הם ספציפיים לפונדקאי ומהווים סיכונים מעטים יחסית במונחים של תקיפת מינים שאינם ממוקדים, והם אינם רעילים לסביבה⁴. ל-EPF יש מנגנון ייחודי לפלישה למארח שלהם, כמו גם להפצה והתמדה בסביבתם הקרובה¹. הם תוקפים את הפונדקאי בעיקר דרך נבגים א-מיניים שמתחברים לציפורן המארח וחודרים אליו כדי לפלוש ולהתרבות בהמוקול המארח. הפונדקאי מת בסופו של דבר עקב דלדול של חומרי המזון של ההמולימף או כתוצאה מהטוקסמיה הנגרמת על ידי המטבוליטים הרעילים המשתחררים על ידי הפטרייה. לאחר המוות, בתנאים סביבתיים אידיאליים, הפטרייה מופיעה על פני השטח החיצוניים (מיקוזיס גלוי) של הפונדקאי ^5,6.

חששות גוברים לגבי ההשפעות השליליות של שאריות כימיות על בריאות האדם, זיהום סביבתי והתפתחות עמידות בפני מזיקים הובילו לדחף העולמי להפחית את התשומות של קוטלי חרקים מבוססי כימיקלים ולמצוא אסטרטגיות חלופיות, חדשניות וברות קיימא להגנת הצומח ולהדברת^{מזיקים 6,7,8} . זה סיפק הזדמנויות לפתח קוטלי חרקים מבוססי מיקרוביאלית לשימוש בתוכניות משולבות לניהול מזיקים (IPM), שהן אסטרטגיות חיוביות יותר מבחינה אקולוגית מאשר הדברה כימית קונבנציונלית ^3,8.

כדי לפתח חומר הדברה מיקרוביאלי מוצלח למזיק חקלאי, יש לבודד תחילה אורגניזם מתאים, לאפיין אותו, לזהותו ולאשר את הפתוגניות שלו למזיק המטרה. עם זאת, נדרשת שיטה קלה וחסכונית לייצור בקנה מידה גדול של החומר המיקרוביאלי כדי לייצר מוצר בר קיימא לשימוש בתוכניות הדברה ביולוגית ^{9,10,11,12,13}. ייצור המוני של כמויות משמעותיות של אנטומופתוגנים באיכות טובה תלוי בזן המיקרוביאלי, בסביבה, במזיק היעד, בפורמולציה, בשוק, באסטרטגיית היישום ובתוצר הסופי הרצוי 14,15,16. EPF יכול להיות מיוצר באופן המוני באמצעות תסיסת מצע נוזלי כדי לייצר בלסטוספורים או את תהליך התסיסה של המצע המוצק כדי לייצר קונידיה אווירית ^6,17,18. עם זאת, תהליך הייצור ההמוני והניסוח של אנטומופתוגנים משפיע ישירות על האלימות, על העלות, על חיי המדף ועל יעילות השדה של המוצר הסופי. לשימוש מוצלח ב- IPM, תהליך הייצור של האנטומופתוגנים חייב להיות קל להפעלה, לדרוש עבודה מינימלית, לייצר ריכוז בעל תפוקה גבוהה של התפשטות ארסית, בת קיימא ומתמשכת, ולהיות נמוך בעלות 4,13,14,16.

הבנת הדרישות התזונתיות של אנטומופתוגנים חשובה לגידול המוני בכל שיטות התרבות ^4,12. למרכיבים התזונתיים של מדיום הייצור יש השפעה משמעותית על התכונות של הממרחים המתקבלים, כולל יעילות ביו-קונטרול, תפוקה, סבילות לייבוש והתמדה 8,19,20,21. האופטימיזציה של הליכי הייצור נועדה לטפל בגורמים כאלה²². עבור EPF, הדרישות העיקריות לצמיחה טובה, ספורולציה וייצור המוני של קונידיה פטרייתית הן לחות מספקת, טמפרטורת גדילה אופטימלית, pH, חילופי גזים של CO₂ ו- O_2, ותזונה, כולל זרחן טוב, פחמימות, פחמן וחנקן מקורות¹⁸.

ג'רונסקי וג'קסון¹⁸ מתארים את שיטת התסיסה של המצע המוצק כשיטת הקירוב היעילה ביותר והקרובה ביותר לתהליך הטבעי לייצור EPF ביחס לשיטת התסיסה של המצע הנוזלי מכיוון שבתנאים טבעיים, הקונידיום הפטרייתי נישא על מבנים זקופים מוצקים, כמו פני השטח של חרקים. מוצרים חקלאיים ותוצרי לוואי המכילים עמילן משמשים בעיקר לייצור המוני של פטריות היפוקריאליות, שכן הפטריות מתפרקות בקלות עמילן באמצעות הפרשה של אנזימים הידרוליטיים מרוכזים מאוד מקצות ההיפל שלהם, כדי לחדור לחומר המוצק, ולגשת לחומרים המזינים הקיימים בחומר 11,17,18,23 . מוצרי הדגנים מספקים גם את הדרישות לייצור ביומסה בריאה מכיוון שכאשר הם מיובשים ומעוקרים, המצעים יכולים לספוג חומרים מזינים נוספים מכל מדיום נוזלי ^16,18,24.

בעבר, מספר מחקרים ניסו להרים את תרבות ההמונים של מיני EPF כמו Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha &Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) ויגאס וחלק מה-Metarhizium anisopliae (Metschn.) קומפלקס מיני סורוקין מבודד על מצעים שונים 16,23,24. מבודדים כאלה שיוצרו בייצור המוני ופותחו באופן מסחרי כוללים את שריר^® ירוק (זן IMI 330189), שפותח מ- M. anisopliae var Metarhizium acridum (דרייבר ומילנר) J.F. Bisch, Rehner &Humber, Metarhizium 69 (זן Meta 69 ICIPE69), ו- Real Metarhizium 69 (L9281), שפותח מ- M. anisopliae, ופס^® רחב (זן PPRI 5339) ו- Eco-Bb^®, שפותח מ- B. bassiana^25,26 . עם זאת, נעשו ניסיונות מוגבלים לתרבות המונים Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner &Humber ו- Metarhizium pinghaense Chen &Guo. שני מבודדים אלה נבחרו במחקר קודם כיעילים ביותר לשליטה ב-mealybug, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)²⁷. לכן, המחקר הנוכחי נועד לנסח ולייצר באופן המוני מספר מספיק של התפשטות זיהומית גמישה של המבודדים המקומיים של M. robertsii ו- M. pinghaense ליישום מסחרי נגד מזיקים חרקים. שיטת התסיסה של המצע המוצק שימשה לייצור המוני של הקונידיה הפטרייתית עבור שני מבודדי EPF. שתי שיטות חיסון EPF, תוך שימוש במתלים חרוטיים ובתרבית הפטרייתית הנוזלית של בלסטוספורים, שימשו לחיסון המצעים המוצקים.

Protocol

1. מקור הזנים הפטרייתיים

1. השתמש בזנים פטרייתיים מבודדים בדרום אפריקה של M. pinghaense 5 HEID (מספר הצטרפות GenBank: MT367414/MT895630) ו - M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), שנאספו ממטעי תפוחים במחוז הכף המערבי, דרום אפריקה.
2. גידול תרביות של כל EPF מבודדות על 60 גרם של מדיום אגר דקסטרוז של Sabouraud dextrose, בתוספת 1 גרם תמצית שמרים (SDAY) ו-10 μL של סטרפטומיצין.
   הערה: דגירה של תרביות EPF בטמפרטורה מבוקרת של ± 25 מעלות צלזיוס בחושך.

2. Metarhizium pinghaense  ו - M. robertsii חיסון השעיה קונידיאלית

1. הכנת המצעים המוצקים
   1. השתמש בשני מוצרים חקלאיים, כלומר שיבולת שועל מתקלפת ושעורה מתקלפת, כמתווך צמיחה עבור שני מבודדי EPF ושקיות אוטוקלאב (305 מ"מ × 660 מ"מ) כשקיות תסיסה.
   2. השתמשו בצינור פסולת פוליווינילכלוריד קטן (1000 מ"מ × 50 מ"מ) כדי ליצור צוואר לשקית התסיסה בקצה הפתוח של שקית האוטוקלב ולהשתמש בסרט אוטוקלאב כדי להצמיד את הצינור לשקית.
   3. סגור את הצינור עם תקע צמר גפן סטרילי כדי לאפשר החלפת גז מספקת במהלך התסיסה.
   4. שוקלים דגנים יבשים (200 גרם) הן של שיבולת השועל המתקלפת והן של השעורה המתקלפת ומניחים אותם בשקיות התסיסה, ולכל שקית, מוסיפים 100 מ"ל של מים מזוקקים ומערבבים היטב את תכולת השקיות.
   5. השאירו את הגרגרים הרטובים לנוח במשך 15-30 דקות כדי לספוג לחות לפני אוטוקלאבים ועיקור. הכינו שש שקיות לכל סוג תבואה, וכדי למנוע זיהום, הניחו את השקיות בשקיות אוטוקלאב אחרות, והרכיבו את המצעים בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 55 דקות.
2. הכנת אינוקולום השעיה חרוטית
   1. קציר קונידיה פטרייתית בת שבועיים-שלושה מתרבויות פטרייתיות של M. pinghaense ו- M. robertsii על ידי גירוד, באמצעות להב כירורגי סטרילי.
   2. יש להשעות את הקונידיה הפטרייתית שנאספה ב-20 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים, בתוספת 0.05% Tween 20, ולערבב את ההשעיות החרוטיות למשך 2 דקות.
   3. מכינים 20 מ"ל של מתלים חרוטיים, עם ריכוז של 1 × 10⁷ קונידיה/מ"ל, וחוסנים את שיבולת השועל המתקלפת ואת מצעי מוצק השעורה המתקלפים, בהתאמה.
      הערה: השתמש בהמוציטומטר כדי לקבוע ריכוזים חרוטיים.
3. חיסון המצעים המוצקים
   1. פתח כל שקית על ידי הסרת תקעי הצוואר מצמר גפן, והוסף את המתלים החרוטיים המוכנים של 20 מ"ל למצע האוטוקלב המקורר.
   2. סגרו שוב את השקיות, באמצעות תקעי הצוואר, ועסו את תכולת השקית כדי לאפשר לאינוקולום הפטרייתי להתערבב באופן שווה עם מצע התבואה.
   3. דגירה של שקיות התסיסה בטמפרטורה מבוקרת של ± 25 מעלות צלזיוס, והבטיחו חילופי גזים מספיקים בין התרבית לסביבה.
      הערה: הליך זה חייב להתבצע תחת ארון זרימה למינרי.
4. שלב התסיסה
   1. לעסות באופן ידני את מצעי התבואה בשקיות התסיסה יומיים לאחר החיסון והדגירה, כאשר מתרחשת צמיחת תפטיר נראית לעין והמצע החל להיות דחוס על ידי הפטרייה ההולכת וגדלה.
      הערה: זה נעשה כדי לערבב את הגרגירים המחוסנים כדי לאפשר הסתעפות תפטיר להתרחש בשלבים המוקדמים הראשונים של הצמיחה הווגטטיבית של הפטריות.
   2. השתמשו בסיכת גלגול מטבח כדי לתפעל את מצע המצע כדי למנוע את ההטרוגניות הפיזית של מצע התבואה ואת עובי המיטה של מסת המצע.
      הערה: התהליך מקדם חילוף חומרים פטרייתי, אשר מייעל את ייצור הנבגים הפטרייתיים, וממקסם את שטח הפנים, ומקדם את התשואה החרוטית¹⁸.
   3. השאירו את תהליך התסיסה להימשך עד 4-5 שבועות, ובדקו את שקיות התסיסה כל יומיים לנוכחות של צמיחת יתר צמחית לבנה שיכולה להתפתח במהלך תהליך התסיסה, מה שיכול להשפיע מאוד על תפוקת הקונידיה הפטרייתית.
      הערה: יש להפסיק מיד את התסיסה בשקיות התסיסה המכילות צמיחת יתר של צמחייה לבנה, ולייבש את תרביות הפטריות¹⁸.

3. חיסון בלסטוספורה

1. ייצור בלסטוספורה וחיסון
   1. הכן מדיום תרבית נוזלית, המכיל 1 ליטר מים מזוקקים, 30 גרם גלוקוז, 20 גרם תמצית שמרים, 4 גרם של אשלגן פוספט דיאבסי (K₂HPO₄), 15 מ"ל של משקה תירס תלול, ו 10 מיקרוגרם / מ"ל של האנטיביוטיקה סטרפטומיצין, הן עבור M. pinghaense והן עבור M. robertsii.
   2. ראשית, מחממים את המים המזוקקים, מכבים לפני שמגיעים לנקודת רתיחה, ומוסיפים כל אחד מהמרכיבים, למעט סטרפטומיצין, למים החמים בסיר. מביאים את המדיום לרתיחה עדינה במשך 3-4 דקות, ומערבבים כל הזמן את המדיום כדי לאפשר ערבוב נכון של המרכיבים ולמנוע התיישבות של חלק מהמרכיבים בתחתית הסיר.
   3. יוצקים סך של 100 מ"ל מהמדיום לתשעה צלוחיות שונות של 250 מ"ל ומניחים תקע צמר גפן על כל בקבוקון, ומכסים את צמר הכותנה בנייר אלומיניום כפקק (איור 1A).
   4. Autoclave את המדיום בצלוחיות במשך 55 דקות ב 121 °C (66 °F). לאחר האוטוקלבינג, אפשרו למדיום בצלוחיות להתקרר והוסיפו 10 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין למדיום בכל בקבוקון (איור 1B).
   5. אספו שתיים עד שלוש לולאות חיידקיות של קונידיה פטרייתית מלוחות תרבית פטרייתיים בני שבועיים-שלושה עבור שני מבודדי ה-EPF, M. pinghaense ו-M. robertsii, והעבירו לכל מדיה נוזלית של 100 מ"ל בצלוחיות 250 מ"ל, בתנאים סטריליים, ואטמו את הצלוחיות.
   6. דגירו את צלוחיות התרבית הנוזלית בטמפרטורה של ±25 מעלות צלזיוס, על שייקר מסלולי ב-140 סל"ד למשך 3 ימים, והפסיקו את הדגירה ברגע שהתרבויות מראות סימנים של עכירות גבוהה עם צמיחת בלסטוספור פטרייתי (איור 1C).
   7. כדי לזהות כל זיהום חיידקי אפשרי מהתרביות, ציירו דגימה של 100 μL מכל בקבוקון תרבית נוזלי לאחר 24 שעות במהלך הדגירה וצלחת על שלוש צלחות SDA לכל מבודד. דגירה של הצלחות במשך 48 שעות, בטמפרטורה מבוקרת של ± 25 מעלות צלזיוס.
2. הכנת המצע המוצק
   1. השתמש באורז לבן ארוך גרגרים כמדיום מצע מוצק עבור הבלסטוספורים של M. pinghaense ו- M. robertsii (מותאם מג'רונסקי וג'קסון¹⁸).
   2. מכינים את שקיות התסיסה כמפורט לעיל, בשלבים 2.1.1-2.1.3, ולכל שקית, מוסיפים 1 ק"ג אורז ו-300 מ"ל מים מזוקקים סטריליים.
   3. ערבבו בעדינות את תכולת שקיות התסיסה והניחו בשקיות האוטוקלב החיצוניות במצב זקוף, ובצעו אוטוקלאב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 55 דקות. לאחר האוטוקלבינג, אפשרו למצעים להתקרר למשך ±-45 דקות בתנאים סטריליים.
3. חיסון ותסיסה
   1. הסר את הסגירה של כל אחד מצלוחיות התרבית הנוזליות של M. pinghaense ושל M. robertsii תחת זרימה למינרית והבהיר את השפה של כל בקבוקון במשך 10 שניות.
   2. יוצקים את תרביות הנוזלים של 100 מ"ל לשקיות התסיסה על ידי הסרת תקעי צמר הכותנה מצווארם (איור 2). מניחים את תקעי הכותנה בחזרה ומכסים את החלק העליון של צוואר השקית בנייר כירורגי מאובטח באמצעות גומייה.
      הערה: קבע את ריכוז הבלסטוספורה עבור כל בקבוקון באמצעות המוציטומטר, והשתמש בריכוזי בלסטוספור של 1 × 10⁷ - 5 × 10⁸ בלסטוספורים / מ"ל כדי לחתוך את המצעים²⁸.
   3. סובבו את החלק העליון של התיק וערבבו את תכולת התיק על ידי ניעור ומניפולציה קלה של המצע על ידי עיסוי, ודגירו את השקיות בטמפרטורה של ± 25 מעלות צלזיוס, על ידי שיטוח המצע בשקיות כדי למנוע היווצרות של מיטות^{עבות 18}.
   4. לשבור את המצע בשקיות התסיסה על ידי עיסוי תכולת השקיות, 2-3 ימים לאחר החיסון והדגירה, כאשר התרחשה צמיחת התפטיר הנראה וקשירת המצע על ידי הפטרייה (מותאמת מהטכניקה של ג'רונסקי וג'קסון¹⁸).
      הערה: אפשרו לתסיסה להימשך 4 שבועות.

איור 1: מדיום תרבית נוזלית בצלוחיות של 250 מ"ל. (A) לפני האוטוקלבינג. (B) לאחר אוטוקלביה וחיסון עם נבגי EPF. (C) מדיום עכור עם בלסטוספור פטרייתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: מדיום תרבית נוזלית בלסטוספור מוכן. (A) Metarhizium robertsii ו-(B) Metarhizium pinghaense לפני חיסון האורז כמצע מוצק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. ייבוש תרבויות פטרייתיות

1. מייבשים את תרביות הפטריות במשך 10-12 יום לאחר התסיסה, לפני השימוש בהן בניסויים, על ידי העברת התרביות הספורולטיביות לשקיות נייר חומות במשקל 26-30 ק"ג (30 x 43 x 15250 ס"מ³).
2. כדי לשפר את חוזק המתיחה של שקיות הנייר, חתכו אופקית שליש מהחלק העליון של כל שקית, ומרפדים את החלק התחתון של השקית (איור 3A, B).

איור 3: הכנת שקיות נייר, הליך ייבוש של תרביות ואריזות. הליך הייבוש של תרביות מיני Metarhizium שגדלו על (C,E) אורז פרבויל ו-(D,F) שעורה מתקלפת. (G) שקיות נייר סגורות עם סיכות ליצירת מבנה אוהל משולש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. מפוררים בעדינות את המצע בכל שקית תסיסה, חותכים את הפינה של כל שקית ומעבירים את כל התרבית לשקיות הנייר דרך החלל שהותירה הפינה החתוכה (איור 3C-F). כדי למנוע בריחה מוגזמת של נבגים פטרייתיים לאוויר, בצע תהליך זה לאט.
   הערה: בצע תהליך זה בתנאים סטריליים, באמצעות זרימה למינרית, כדי למנוע זיהום.
4. תייג כל שקית נייר ונקפל מעל הקצה העליון של כל שקית פעמיים וסגור עם סיכות כדי ליצור מבנה אוהל משולש, והנח את השקיות על מדפי ייבוש חוטים כדי לאפשר ייבוש נכון, אפילו, בטמפרטורה מבוקרת של ± 25 מעלות צלזיוס ולחות נמוכה של 30-40%.
5. סובבו את השקיות מדי יום כדי לאפשר ייבוש שווה של התרביות וכדי למנוע צמיחה מחודשת וגטטיבית שעלולה להתרחש, מה שיוריד את היבול של נבגים פטרייתיים הניתנים לקטיף.
6. שוקלים כל שקית ייבוש לאחר כל יומיים בתהליך הייבוש, וממשיכים בתהליך הייבוש של כל שקית עד שלא נצפה כמעט כל שינוי במסת השקיות בין הימים העוקבים.

5. קציר של קונידיה פטרייתית

1. קוצרים קונידיה פטרייתית באופן מכני מהתרביות באמצעות שלוש מסננות מקוננות, מסננת בדיקה (ETS) רשת מס' 35 (עם צמצם של 500 מיקרומטר), המקוננת על מסננת בדיקה (עם צמצם של 212 מיקרומטר), מקוננת על רשת ETS מס' 100 (עם צמצם של 150 מיקרומטר), המותקנת על מחבת איסוף.
2. טענו את דגימת התרבית היבשה על מסננת ETS מס' 35 באיטיות והניחו מכסה על המסננת כדי למנוע שחרור של קונידיה פטרייתית לאוויר.
3. הוסיפו 10-12 גולות זכוכית למסננות כדי לסייע במעבר הקונידיה הפטרייתית דרך מסכי הרשת ולהימנע משמירה של הקונידיה במסננת, מה שעלול לגרום להתאוששות נבגים מופחתת.
4. דביקו ואטמו את מפרקי המסננת באמצעות סרט חשמלי כדי למנוע בריחה של אבק חרוטי.
5. הניחו את המסננות על שייקר רוטט, המצויד בכרית דביקה, כדי לאבטח את מחבת האיסוף והמסננות, למשך 20-25 דקות, בתנועה של 560-640 רטטים לדקה (איור 4).
   הערה: טכניקה מותאמת מג'רונסקי וג'קסון¹⁸.

איור 4: קצירת נבגים פטרייתיים מתרביות Metarhizium robertsii מיובשות על אורז ושעורה מתקלפת. (A) 10-12 גולות זכוכית שנוספו למסננות כדי לסייע במעבר הקונידיה הפטרייתית דרך מסכי הרשת. M. robertsii conidia נקטף מתרבויות על (B) אורז, ו-(C) התקלף בקושי. (ד) מסננות על שייקר רוטט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

6. מוציאים את מסננות הבדיקה ממחבת האיסוף, אוספים קונידיה ומאחסנים את הקונידיה שנאספה בשקיות אטומות למים אטומות למים לאחסון לטווח ארוך (3-6 חודשים).

6. כימות של קונידיה פטרייתית המיוצרת

1. למדוד ולרשום את המסה של כל מצע תבואה לפני קצירת הקונידיה הפטרייתית מכל מצע.
2. מדוד את המשקל הכולל של הקונידיה שנאספה על ידי הפחתת המסה של הנבגים שנאספו ממסת המצע המוצק.
   הערה: התשואה הכוללת של קונידיה כוללת לא רק את הקונידיה שנקטפה אלא גם את הקונידיה הפטרייתית שנותרה על המצע המוצק.
3. שקלו את המצע והסירו 10 גרם מהמצע השקול. יש להשעות את 10 גרם המצע ב-0.05% טווין 20 ולדלל ב-10 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים.
4. ערבבו את ההשעיה במשך 2 דקות, והשתמשו בהמוציטומטר כדי לבצע את ספירת הנבגים כדי לקבוע את מספר הקונידיה שנשטפה מהמצע.
5. בצע דילולים נוספים על ידי העברת 1000 μL של 10 מ"ל תרחיף חרוטי שטוף ל 9 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים כדי להרכיב 10 מ"ל של מתלי דילול.
6. מערבולת-מערבבים את ההשעיות החרוטיות למשך 2 דקות, וקובעים את הריכוזים החרוטיים.
   הערה: עקוב אחר הנוהל והנוסחה שתוארו על ידי אינגליס, אנקרלי וגוטל³⁰ כדי לקבוע את הריכוז החרוטי של המתלים.
7. לאסוף ולהשעות סך של 0.1 גרם של אבקת conidial שנאסף מכל תרבית ב 10 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים בתוספת 0.05% Tween 20, ולערבב מערבולת את התרחיף conidial במשך 2 דקות, ולקבוע את הריכוז conidial באמצעות hemocytometer.
8. בצע דילולים נוספים על ידי העברת 1000 μL של 10 מ"ל של תרחיף conidial ל 9 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים כדי להשלים את דילול ההשעיה 10 מ"ל.
9. מערבולת לערבב את ההשעיות conidial במשך 2 דקות, לחשב את הריכוזים conidial ולקבוע את מספר conidia לכל גרם.
10. הכפל את מספר הקונידיה לגרם של אבקה שנקטפה במסה הראשונית של אבקת הקונידיאל שנקטפה. הכפל את מספר הקונידיה שנשטפה מהמצע במשקל הכולל של המצע שהוצא, בהיותו המצע שממנו נקטפו הקונידיה.
11. חברו את שני הערכים הנתונים יחד וחלקו במשקל היבש ההתחלתי של המצע כדי לחשב את מספר הקונידיה לק"ג או גרם של המצע¹⁸.
    הערה: החישובים נעשו בעיקר עבור מצע האורז. בדיקת הנביטה או הכדאיות הקונידיאלית נערכה הן עבור ה- M. pinghaense והן עבור מבודדי M. robertsii כדי לקבוע את הכדאיות של הקונידיה המיוצרת.

7. ניתוח נתונים

1. השתמש בתוכנת מחשב מתאימה כדי לבצע את הניתוח הסטטיסטי של התוצאות המתקבלות.
   הערה: ניתוח סטטיסטי של הנתונים נעשה באמצעות STATISTICA גרסה 13.5.0.17.

תוצאות

ירידה במסת התוכן של התרבויות על אורז הן עבור M. pinghaense והן עבור M. robertsii נצפתה עם הזמן במהלך שלב הייבוש של תרבויות הפטריות, כאשר לא נצפה שינוי, או מעט, במסה לאחר שהתרביות התייבשו (איור 5). אבקת הקונידיה הפטרייתית היבשה שנקטפה הן של M. pinghaense והן של M. robertsii מוצגת

Discussion

האינטגרציה המוצלחת של חומרים מיקרוביאליים להדברה ביולוגית של מזיקים חקלאיים חשובים באגרואקוסיסם תלויה הן בהצלחה והן בקלות הייצור ההמוני של האנטומופתוגנים כצעד ראשון בתנאי מעבדה. הייצור ההמוני של EPF חשוב ליישום בקנה מידה גדול ולזמינות של מוצרי EPF עבור תוכניות IPM באמצעות הדברה ביולוגית

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Tween 20	Lasec		Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles	Lasec		Used to make conidial suspensions
Aluminium foil			Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave			Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags	Lasec		Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape	Lasec		To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags			Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor	SIGMA	66071-94-1	Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool	Lasec		Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles	Neolab		Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape			Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask	Lasec		Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%)	Lasec		Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley	Health Connection Wholefoods		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats	Tiger brands		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose	Merck		Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators			For growing fungal conidia culture
Haemocytometer			Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops	Lasec		For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin			Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet	ESCO Laminar Flow Cabinet		Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia	Stellenbosch University	5HEID	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia	Stellenbosch University	6EIKEN	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope	ZEIZZ (Scope. A1)		Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker	IncoShake- LABOTEC		Used for the blastospore production process
Parboiled rice	Spekko		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin	SIGMA		Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes	Lasec		Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips	Labnet (BioPette PLUS)		Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe			Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	SIGMA-ALDRICH		Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band			Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA)	NEOGEN Culture Media		Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water			To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad			Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade	Lasec		Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper	Lasec		Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker			Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract	Biolab		Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags	GLAD		Used to to store harvested fungal conidia