猪外周血血液生长内皮细胞（BOEC）的表征

摘要

内皮是一种动态的综合结构，在血管生成、止血、炎症和体内平衡等许多生理功能中起重要作用。内皮在动脉粥样硬化、高血压和糖尿病等病理生理学中也起着重要作用。内皮细胞形成血液和淋巴管的内层，在结构和功能上表现出异质性。各种小组已经评估了来源于人外周血的内皮细胞的功能，重点是来源于造血干细胞或成熟血液生长内皮细胞（或内皮集落形成细胞）的内皮祖细胞。这些细胞为治疗和疾病建模提供了自体资源。异种细胞可以提供另一种治疗来源，因为它们的可用性和同质性通过使用在类似条件下饲养的遗传相似的动物来实现。因此，已经提出了一种从猪外周血中分离和扩增高度增殖的血液生长内皮细胞的稳健方案。这些细胞可用于多种应用，如心血管组织工程、细胞治疗、疾病建模、药物筛选、研究内皮细胞生物学以及 体外 共培养，以研究异种移植中的炎症和凝血反应。

引言

内皮是一种高度复杂的动态结构，是血管壁的重要组成部分。它排列在血管的内表面，在循环血液和周围组织之间提供物理界面。已知这种异质结构执行各种功能，例如血管生成，炎症，血管调节和止血¹，²，^3，4。人脐静脉内皮细胞是一种被广泛研究的细胞类型，用于评估内皮细胞的功能。然而，患者特异性批次变异性、表型不一致和最小分裂效率表明需要确定可以改善所有这些特征的细胞来源⁵。

获得原代内皮细胞的均质群体在技术上可能具有挑战性，并且原代内皮细胞不具有高增^殖能力6。因此，为了研究血管再生和评估病理生理过程，各个小组试图获得和评估来自外周血的不同类型的内皮细胞，例如内皮祖细胞（EPC）或血液生长内皮细胞（BOEC）⁶，⁷，^8，9.纺锤形的早期EPC起源于造血干细胞（HSC），具有有限的生长效力和有限....

研究方案

所有动物研究均由威斯康星医学院和妙佑医疗国际各自的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准。

注意：在这项研究中，使用了约克郡/兰德雷斯/杜洛克杂交家猪（Sus homeus），雄性和雌性，40-80公斤，3-6个月大。

1.猪外周血采集

1. 准备材料。
   1. 在无菌盐水中将肝素溶液稀释至100U / mL。
   2. 向两个 50 mL 锥形管和两个 60 mL 注射器中各加入 3-4 mL 肝素溶液。
   3. 将未稀释的肝素溶液 （1，000 U/mL） 吸入延长管中。
   4. 将 19 G 针头连接到充满肝素的延长管的一端，将含肝素的 60 mL 注射器连接到另一端。
2. 根据机构政策麻醉猪
   1. 肌内注射阿托品（0.05 mg/kg）、替他明/唑拉西泮（2-5 mg/kg）和甲苯噻嗪（2 mg/kg）以诱导麻醉。
      注意：一旦动物失去知觉并且下颌肌肉不僵硬，就可以实现充分的麻醉。
   2. 将动物仰卧，并在两侧放置卷起的毛巾以提供稳定性。
   3. 在眼睛上涂抹眼药膏以防止麻醉时干燥。
   4. 麻醉期间提供热支持，包括毯子、加热垫和/或加热手术台。
3. 用甜菜碱磨砂....

结果

从培养开始到观察到BOEC菌落，观察培养细胞的形态（图1）。较小的贴壁细胞群开始附着在培养皿上并生长，而非贴壁细胞随着培养基的变化而被移除（图1B）。菌落在第6天首次出现，作为从中心点向外放射状增殖的内皮样细胞的集合（图1D）。随着培养的进行，细胞集落变得更加致密，并显示出类似于成熟内皮细胞的鹅卵石形态.......

讨论

BOEC是一种强大的工具，可用于各种科学和治疗方法⁷，^8，16。BOEC已被用于分析EC基因表达，以阐明导致血管疾病和癌症发展的关键因素⁵，¹⁹，^20，21。BOEC还被用于治疗应用，如血管再生和基因传递²²，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
19 G needle	Covidien	1188818112
50 mL conical tubes	Corning	352098
6 well plate	BD Falcon	353046
60 mL syringes	Covidien	8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%)	Stemcell Technologies	07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x)	Gibco	15240-062
Centrifuge	Thermo Scientific	75-253-839
EGM-2 culture medium	Lonza Walkersville	CC-3162
Extension tube	Hanna Pharmaceutical Supply Co.	03382C6227
Fetal bovine serum (FBS)	Atlas Biologicals	F-0500-A
Ficoll-Paque 1077	Cytiva	17144003	Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL)	Pfizer	00069-0058-01
Human plasma fibronectin	Gibco	33016-015
Ice	N/A	N/A
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Pipette set	Eppendorf	2231300004
Sterile water	Gibco	15230-162
Thin pipette	Celltreat Scientific	229280