Charakterisierung von Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) aus porcinem peripherem Blut

Zusammenfassung

Das Endothel ist eine dynamische, integrierte Struktur, die eine wichtige Rolle bei vielen physiologischen Funktionen wie Angiogenese, Hämostase, Entzündung und Homöostase spielt. Das Endothel spielt auch eine wichtige Rolle bei Pathophysiologien wie Arteriosklerose, Bluthochdruck und Diabetes. Endothelzellen bilden die innere Auskleidung von Blut- und Lymphgefäßen und weisen eine Heterogenität in Struktur und Funktion auf. Verschiedene Gruppen haben die Funktionalität von Endothelzellen aus menschlichem peripherem Blut evaluiert, wobei der Schwerpunkt auf endothelialen Vorläuferzellen liegt, die aus hämatopoetischen Stammzellen oder reifen Endothelzellen (oder endothelialen koloniebildenden Zellen) stammen. Diese Zellen stellen eine autologe Ressource für Therapeutika und die Modellierung von Krankheiten dar. Xenogene Zellen können aufgrund ihrer Verfügbarkeit und Homogenität, die durch die Verwendung genetisch ähnlicher Tiere, die unter ähnlichen Bedingungen aufgezogen wurden, erreicht werden, eine alternative Quelle für Therapeutika darstellen. Daher wurde ein robustes Protokoll für die Isolierung und Expansion von hochproliferativen Endothelzellen aus porcinem peripherem Blut vorgestellt. Diese Zellen können für zahlreiche Anwendungen verwendet werden, z. B. für das kardiovaskuläre Gewebezüchten, die Zelltherapie, die Modellierung von Krankheiten, das Screening von Medikamenten, die Untersuchung der Biologie von Endothelzellen und In-vitro-Kokulturen zur Untersuchung von Entzündungs- und Gerinnungsreaktionen bei der Xenotransplantation.

Einleitung

Das Endothel ist ein hochkomplexes, dynamisches Gebilde und ein wichtiger Bestandteil der Gefäßwand. Es kleidet die innere Oberfläche der Blutgefäße aus, um eine physikalische Schnittstelle zwischen zirkulierendem Blut und dem umgebenden Gewebe zu schaffen. Es ist bekannt, dass diese heterogene Struktur verschiedene Funktionen wie Angiogenese, Entzündung, Vasoregulation und Hämostase ausübt 1,2,3,4. Humane Nabelvenen-Endothelzellen sind ein umfassend untersuchter Zelltyp, um die Funktionalität von Endothelzellen zu beurteilen. Die patientenspezifische Chargenvariabilität, der inkonsistente Phänotyp und die minimale Teilungseffizienz deuten jedoch darauf hin, dass eine Zellquelle bestimmt werden muss, die all diese Merkmale verbessern könnte⁵.

Eine homogene Population von primären Endothelzellen zu erhalten, kann eine technische Herausforderung darstellen, und primäre Endothelzellen besitzen keine hohe proliferative Kapazität⁶. Um die vaskuläre Regeneration zu untersuchen und pathophysiologische Prozesse zu bewerten, haben verschiedene Gruppen versucht, verschiedene Arten von Endothelzellen aus peripherem Blut zu erhalten und zu bewerten, z. B. Endothelvorläuferzellen (EPCs) oder Blutauswuchs-Endothelzellen (BOECs)6,7,8,9 . Die spindelförmigen frühen EPCs stammen aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und haben eine begrenzte Wachstumspotenz und eine begrenzte angiogene Fähigkeit, reife Endothelzellen zu produzieren. Darüber hinaus ähneln sie entzündlichen Monozyten sehr. Darüber hinaus ist ihre Fähigkeit, sich weiter in funktionsfähige, proliferierende, reife Endothelzellen zu differenzieren, noch umstritten 6,7,9,10. Die kontinuierliche Kultivierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) kann zu einer sekundären Population von Zellen führen, die als Late-Outgrowth-EPCs, BOECs oder endotheliale koloniebildende Zellen (ECFCs) bekannt sind6,7,9,10. Medina et al. erkannten 2018 die Grenzen von EPCs, die Mehrdeutigkeit ihrer Nomenklatur sowie einen allgemeinen Mangel an Übereinstimmung mit vielen verschiedenen Zelltypen an, die kontinuierlich unter EPCs¹¹ gruppiert werden. Im Gegensatz dazu sind BOECs für ihre Rolle bei der Gefäßreparatur, Gesundheit und Krankheit sowie der Zelltherapie anerkannt. Weitere Studien und therapeutische Anwendungen dieser Zellen werden sich auf Protokolle stützen, um diese Zelltypen konsistent aus zirkulierenden Vorläuferzellen abzuleiten.

Primärzellen wie BOECs können als Surrogat verwendet werden, um hochproliferative reife Endothelzellen zu erhalten⁶. BOECs unterscheiden sich phänotypisch von frühen EPCs und weisen typische endotheliale Merkmale wie die Morphologie des Kopfsteinpflasters und die Expression von Adhärenzkontakten und Caveolae^{auf 12}. Das Gen-Profiling von Hebbel et al.13,14,15 ergab^, dass BOECs oder ECFCs die wahren Endothelzellen sind, da sie die Bildung von mikrovaskulären und großen Gefäßen fördern. Somit können BOECs als Werkzeug zur Bewertung pathophysiologischer Prozesse und genetischer Variation verwendet werden¹⁶. Sie gelten auch als hervorragende Zellquelle für die Zelltherapie zur Gefäßregeneration¹⁷. Daher ist ein standardisiertes Protokoll zur konsistenten Gewinnung dieser hochproliferativen Zellen unerlässlich.

Während BOECs ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der pathophysiologischen und genetischen Variation des Menschen darstellen, kann eine homogenere Quelle von BOECs robustere und zuverlässigere experimentelle und therapeutische Ergebnisse liefern. Eine überlegene Homogenität kann durch die Verwendung von xenogenen Zellquellen erreicht werden, die von genetisch ähnlichen Tieren stammen, die unter ähnlichen Bedingungen aufgezogen wurden¹⁸. Während xenogene Zellquellen dazu neigen, eine Immunantwort des Wirts hervorzurufen, werden Immunmodulationsstrategien mit dem Ziel entwickelt, immunkompatible Tiere und tierische Produkte, einschließlich Zellen, zu erzeugen. Insbesondere Schweine sind eine ergiebige Quelle für peripheres Blut und werden aufgrund anatomischer und physiologischer Ähnlichkeiten mit dem Menschen häufig zur Untersuchung von Medizinprodukten und anderen Therapien verwendet. Daher verfeinert diese Studie das Protokoll für die Isolierung und Expansion hochproliferativer BOECs aus porcinem peripherem Blut. Das unten beschriebene Protokoll ist eine einfache und zuverlässige Methode, um eine große Anzahl von BOECs aus einer relativ kleinen Blutmenge zu gewinnen. Die Kulturen können über mehrere Passagen erweitert werden, um aus einer einzigen Blutprobe Millionen von Zellen zu erzeugen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von den jeweiligen Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) am Medical College of Wisconsin und der Mayo Clinic genehmigt.

HINWEIS: In dieser Studie wurden Yorkshire/Landrace/Duroc-Kreuzungsschweine (Sus domesticus), männlich und weiblich, 40-80 kg, 3-6 Monate alt, verwendet.

1. Entnahme von peripherem Schweineblut

1. Bereiten Sie Materialien vor.
   1. Heparinlösung in steriler Kochsalzlösung auf 100 U/ml verdünnen.
   2. Geben Sie jeweils 3-4 ml Heparinlösung in zwei konische 50-ml-Röhrchen und zwei 60-ml-Spritzen.
   3. Ziehen Sie unverdünnte Heparinlösung (1.000 U/ml) in ein Verlängerungsröhrchen.
   4. Verbinden Sie eine 19-G-Nadel mit einem Ende des mit Heparin gefüllten Verlängerungsröhrchens und eine Heparin-haltige 60-ml-Spritze mit dem anderen Ende.
2. Betäubung eines Schweins gemäß den institutionellen Richtlinien
   1. Verabreichen Sie eine i.m. Injektion von Atropin (0,05 mg/kg), Tiletamin/Zolazepam (2-5 mg/kg) und Xylazin (2 mg/kg), um eine Anästhesie einzuleiten.
      HINWEIS: Eine angemessene Anästhesie wird erreicht, sobald das Tier bewusstlos ist und die Unterkiefermuskulatur nicht starr ist.
   2. Legen Sie das Tier in Rückenlage und legen Sie zusammengerollte Handtücher auf beide Seiten, um für Stabilität zu sorgen.
   3. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
   4. Bieten Sie während der Anästhesie thermische Unterstützung, einschließlich Decken, Heizkissen und/oder beheiztem Behandlungstisch.
3. Reinigen Sie die Oberschenkelleiste mit Betadine-Peelinglösung.
4. Punktieren Sie die Femurvene oder -arterie mit der 19-G-Nadel und ziehen Sie langsam (~1-2 ml/s) 50 ml Blut in die Spritze.
   HINWEIS: Ein zu schnelles Zeichnen kann die Zellen beschädigen.
5. Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle, knicken Sie sofort den Verlängerungsschlauch und trennen Sie die 60-ml-Spritze
6. Das Blut wird langsam in ein heparinhaltiges konisches 50-ml-Röhrchen überführt.
7. Verschließen Sie das konische 50-ml-Röhrchen fest, drehen Sie es zum Mischen einige Male vorsichtig um und legen Sie es auf Eis.
8. Schließen Sie die verbleibende 60-ml-Spritze mit Heparin an das Verlängerungsröhrchen an, knicken Sie das Verlängerungsröhrchen auf und ziehen Sie langsam weitere 50 ml Blut in die Spritze.
9. Entfernen Sie sofort die Nadel aus der Arterie oder Vene und saugen Sie langsam das restliche Blut aus dem Verlängerungsschlauch in die Spritze.
10. Trennen Sie die 60-ml-Spritze vom Verlängerungsschlauch und übertragen Sie das Blut langsam in den verbleibenden heparinhaltigen konischen 50-ml-Röhrchen.
11. Verschließen Sie das konische 50-ml-Röhrchen fest, drehen Sie es zum Mischen einige Male vorsichtig um und legen Sie es auf Eis.
12. Üben Sie eine Druckhämostase auf die Oberschenkelleistengegend des Schweins aus.
13. Erholen Sie das Schwein gemäß den institutionellen Richtlinien. Überwachen Sie das Tier kontinuierlich, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein beizubehalten und in den regulären Stall-/Zwingerbereich zurückzukehren.

2. Isolierung mononukleärer Zellen

1. Verdünnen Sie das Blut 1:1 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in vier konischen 50-ml-Röhrchen.
   HINWEIS: Diese Arbeiten müssen in einer Zellkulturhaube mit einer aseptischen Technik durchgeführt werden, um eine Kontamination der Zellkultur zu vermeiden.
2. Geben Sie 25 ml gebrauchsfertige Dichtegradientenlösung bei Raumtemperatur in acht konische 50-ml-Röhrchen.
3. Pipettieren Sie sehr langsam 25 ml Blut-/Kochsalzlösung entlang der Innenseite jeder Dichtegradientenlösung, die ein konisches 50-ml-Röhrchen enthält, indem Sie das Röhrchen in einem spitzen Winkel zur Pipettenspitze halten.
   Anmerkungen: Die Blutlösung sollte sich sanft über die Dichtegradientenlösung legen und eine gut definierte Grenzfläche beibehalten.
4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 560 x g und Raumtemperatur (RT).
   Anmerkungen: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, deaktivieren Sie nach Möglichkeit die Zentrifugenbremse.
5. Verwenden Sie eine dünne Pipette, um den Buffy-Coat (trübe Schicht mononukleärer Zellen über der Dichtegradientenlösung und unter dem klaren Plasma) vorsichtig aus jedem Röhrchen zu entnehmen und gleichmäßig in zwei neue konische 50-ml-Röhrchen zu verteilen. Verwerfen Sie die Dichtegradientenlösung, die Rohre enthält.
   HINWEIS: Sammeln Sie so viel wie möglich vom Buffy-Mantel und sammeln Sie so wenig wie möglich von der Dichtegradientenlösung und dem Plasma.

3. Waschen und Beschichten der Zellen

1. Eine 6-Well-Platte mit Fibronektin bestreichen.
   1. Stellen Sie eine Stammlösung von Fibronektin im menschlichen Plasma her, indem Sie sie in sterilem Wasser auf 1 mg/ml verdünnen. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C.
   2. Stellen Sie 3,6 ml einer Arbeitslösung von Fibronektin her, indem Sie 600 μl Fibronektin-Stammlösung in 3 ml PBS verdünnen.
   3. Übertragen Sie 600 μl der Fibronektin-Arbeitslösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte und schütteln Sie sie vorsichtig, bis sie gleichmäßig bedeckt ist.
   4. Warten Sie 30 Minuten, bis das Fibronektin die Vertiefungen beschichtet hat, und saugen Sie die Lösung vorsichtig aus jeder Vertiefung ab.
2. Während Sie darauf warten, dass sich das Fibronektin bedeckt, waschen Sie die mononukleären Zellen
   1. Füllen Sie die Röhrchen mit bis zu 45 ml PBS auf
   2. 5 min bei 560 x g und 4 °C mit niedriger Bremse zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand aus beiden Röhrchen ab.
   3. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 25 ml PBS.
   4. Wiederholen Sie den Vorgang, um ein zweites Mal zu waschen.
3. Jedes Zellpellet wird in 5 ml PBS resuspendiert und 15 ml 0,8%ige Ammoniumchloridlösung in jedes Röhrchen gegeben.
   HINWEIS: Dieser Schritt dient dazu, die verbleibenden roten Blutkörperchen zu lysieren.
4. 10 Minuten auf Eis inkubieren.
5. Waschen Sie die Zellen wie zuvor, indem Sie die Röhrchen mit PBS auffüllen und 5 min bei 560 x g und 4 °C mit niedriger Bremse zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand aus beiden Röhrchen ab.
6. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 25 ml PBS und wiederholen Sie den Vorgang zum zweiten Waschen.
7. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 6 ml EGM-2-Nährmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1x antibiotischer/antimykotischer Lösung, die 10.000 U/ml Penicillin, 10 mg/ml Streptomycin und 25 μg/ml Amphotericin enthält.
   HINWEIS: EGM-2-Nährmedium besteht aus EBM-2-Nährmedium, ergänzt mit 200 μl Hydrocortison, 2 ml humanem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (hFGF-B), 500 μl vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), 500 μl rekombinantem Analogon des insulinähnlichen Wachstumsfaktors (_R3 IGF-1), 500 μl Ascorbinsäure, 500 μl humanem epidermalem Wachstumsfaktor (hEGF), 500 μl Gentamicin/Amphotericin und 500 μl Heparin pro 500 ml.
8. Übertragen Sie vorsichtig 2 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung der mit Fibronektin beschichteten 6-Well-Platte und schütteln Sie sie vorsichtig, bis sie gleichmäßig bedeckt ist.
   HINWEIS: Das Ziel ist es, so viele Zellen wie möglich zu besiedeln, um die Anzahl der sich bildenden Endothelkolonien zu maximieren.

4. Zellkultur

1. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ und 100 % Luftfeuchtigkeit.
2. Geben Sie am nächsten Tag vorsichtig 1 ml frisches Nährmedium in jede Vertiefung.
   HINWEIS: Es ist wichtig, vorsichtig zu sein, um Zellen, die lose an der Fibronektinbeschichtung haften, nicht zu stören.
3. Führen Sie am nächsten Tag einen halben Nährmedienwechsel durch, indem Sie vorsichtig 1,5 ml Nährmedium aus jeder Vertiefung absaugen und durch 1,5 ml frisches Nährmedium ersetzen.
4. Führen Sie an jedem der nächsten 5 Tage vorsichtig einen vollständigen Nährmedienwechsel in jeder Vertiefung durch (2 ml frisches Nährmedium pro Vertiefung).
5. Wechseln Sie danach das Nährmedium dreimal pro Woche vorsichtig.
6. Visualisieren Sie die Zellkulturen regelmäßig unter Lichtmikroskopie mit geringer Leistung (4x Objektiv).
   HINWEIS: Adhärente Kolonien von Blutauswuchs-Endothelzellen (BOEC) beginnen 7-10 Tage nach dem Ausplattieren in den Vertiefungen zu erscheinen. Nicht adhärente Zelltypen werden mit mittleren Veränderungen verworfen, und andere adhärente Zelltypen werden sich allmählich auflösen, wenn die BOEC-Kolonien wachsen.
7. Wenn ~70%-80% konfluieren, werden die BOECs in einen mit Fibronektin beschichteten T-75-Kolben geleitet und das Nährmedium dreimal pro Woche gewechselt.
   Anmerkungen: Die Aussaatdichte kann gesteuert werden, indem die Kolonien stattdessen in einen T25-Kolben geleitet werden. Nachfolgende Passagen erfordern keine Fibronektinbeschichtung, und der Wechsel des Nährmediums kann auf zwei Mal pro Woche reduziert werden.
8. Zellen aus den Gängen 1-3 können für Experimente verwendet oder in ein Gefriermedium überführt und für die zukünftige Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

Ergebnisse

Die Morphologie der kultivierten Zellen wurde vom Beginn der Kultur bis zur Beobachtung von BOEC-Kolonien beobachtet (Abbildung 1). Eine kleinere Population adhärenter Zellen begann sich an die Kulturschalen anzuheften und zu wachsen, während nicht-adhärente Zellen mit Nährmedienwechsel entfernt wurden (Abbildung 1B). Die Kolonien erschienen erstmals an Tag 6 als eine Ansammlung von endothelialen Zellen, die von einem zentralen Punkt aus radial nach außen p...

Diskussion

BOECs sind ein leistungsfähiges Werkzeug, das in verschiedenen wissenschaftlichen und therapeutischen Ansätzen eingesetzt werden kann ^7,8,16. BOECs wurden verwendet, um die EC-Genexpression zu analysieren, um die Schlüsselfaktoren aufzuklären, die für die Entwicklung von Gefäßerkrankungen und Krebs verantwortlich sind 5,19,20,21....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
19 G needle	Covidien	1188818112
50 mL conical tubes	Corning	352098
6 well plate	BD Falcon	353046
60 mL syringes	Covidien	8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%)	Stemcell Technologies	07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x)	Gibco	15240-062
Centrifuge	Thermo Scientific	75-253-839
EGM-2 culture medium	Lonza Walkersville	CC-3162
Extension tube	Hanna Pharmaceutical Supply Co.	03382C6227
Fetal bovine serum (FBS)	Atlas Biologicals	F-0500-A
Ficoll-Paque 1077	Cytiva	17144003	Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL)	Pfizer	00069-0058-01
Human plasma fibronectin	Gibco	33016-015
Ice	N/A	N/A
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Pipette set	Eppendorf	2231300004
Sterile water	Gibco	15230-162
Thin pipette	Celltreat Scientific	229280