ブタ末梢血からの血液伸長内皮細胞(BOEC)の特性評価

要約

内皮は、血管新生、止血、炎症、恒常性などの多くの生理学的機能において重要な役割を果たす動的な統合構造です。内皮は、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病などの病態生理においても重要な役割を果たしています。内皮細胞は血管とリンパ管の内層を形成し、構造と機能の不均一性を示します。ヒト末梢血由来の内皮細胞の機能性を、造血幹細胞由来の内皮前駆細胞や成熟血液伸長内皮細胞(または内皮コロニー形成細胞)を中心に、様々なグループが評価しています。これらの細胞は、治療および疾患モデリングのための自家リソースを提供します。異種細胞は、同様の条件で飼育された遺伝的に類似した動物を使用することによって達成されるそれらの利用可能性および均質性のために、代替の治療薬源を提供し得る。したがって、ブタ末梢血からの高度に増殖性の血液伸長内皮細胞の単離および拡大のための堅牢なプロトコルが提示されている。これらの細胞は、心血管組織工学、細胞療法、疾患モデリング、薬物スクリーニング、内皮細胞生物学の研究、異種移植における炎症反応および凝固反応を調べるための in vitro 共培養など、多くの用途に使用できます。

概要

内皮は非常に複雑で動的な構造であり、血管壁の重要な構成要素です。血管の内面を裏打ちし、循環血液と周囲の組織との間の物理的インターフェースを提供します。この不均一な構造は、血管新生、炎症、血管調節、止血などのさまざまな機能を果たすことが知られています¹、^2、3、4。ヒト臍帯静脈内皮細胞は、内皮細胞の機能を評価するために広く研究されている細胞型です。しかし、患者固有のバッチ変動性、一貫性のない表現型、および最小分割効率は、これらすべての機能を改善できる細胞源を決定する必要性を示唆しています⁵。

初代内皮細胞の均質な集団を得ることは技術的に困難な場合があり、初代内皮細胞は高い増殖能力を持っていません⁶。したがって、血管再生を研究し、病態生理学的プロセスを評価するために、さまざまなグループが末梢血に由来するさまざまな種類の内皮細胞、例えば内皮前駆細胞(EPC)または血液伸長内皮細胞(BOEC)を取得して評価することを試みてきました6,7,8,9。.紡錘形の初期EPCは造血幹細胞(HSC)に由来し、成長力が限られており、成熟内皮細胞を産生する血管新生能力も限られています。さらに、それらは炎症性単球によく似ています。さらに、機能的で増殖する成熟内皮細胞にさらに分化するそれらの能力は、依然として議論の余地がある⁶、⁷、^9、10である。末梢血単核細胞(PBMC)の連続培養は、後期増殖EPC、BOEC、または内皮コロニー形成細胞(ECFC)として知られる細胞の二次集団を生じさせる可能性があります⁶、^7、9、10。Medinaらは2018年に、EPCの限界、命名法の曖昧さ、および^EPC11の下で継続的にグループ化された多くの異なる細胞型との一致の一般的な欠如を認めました。対照的に、BOECは、血管修復、健康と病気、および細胞療法におけるその役割で認識されるようになりました。これらの細胞のさらなる研究および治療的使用は、循環前駆細胞からこれらの細胞型を一貫して導出するためのプロトコルに依存するであろう。

BOECなどの初代細胞は、増殖性の高い成熟内皮細胞⁶を得るための代理として使用することができる。BOECは初期のEPCとは表現型的に異なり、石畳の形態や付着接合部やカベオラの発現などの典型的な内皮の特徴を示します¹²。Hebbelらによる遺伝子プロファイリング^13,14,15は、BOECまたはECFCが微小血管および大血管形成を促進する真の内皮細胞であることを発見しました。したがって、BOECは、病態生理学的プロセスおよび遺伝的変異を評価するためのツールとして使用できます¹⁶。それらはまた、血管再生のための細胞療法のための優れた細胞源と考えられています¹⁷。したがって、これらの高度に増殖する細胞を一貫して導出するための標準化されたプロトコルが不可欠です。

BOECは、ヒトの病態生理学的および遺伝的変異を研究するための強力なツールを提供しますが、BOECのより均質な供給源は、より堅牢で信頼性の高い実験および治療結果を提供する可能性があります。優れた均質性は、同様の条件で飼育された遺伝的に類似した動物に由来する異種細胞源を使用することによって達成することができる¹⁸。異種細胞源は宿主の免疫応答を誘発する傾向がありますが、免疫調節戦略は、免疫適合性のある動物および細胞を含む動物製品を生成することを目的として開発されています。特にブタは末梢血の豊富な供給源であり、人間との解剖学的および生理学的類似性のために医療機器および他の治療法を研究するために一般的に使用されている。したがって、この研究は、ブタ末梢血からの高増殖性BOECの分離と拡大のためのプロトコルを改良します。以下に詳述するプロトコルは、比較的少量の血液から多数のBOECを取得するための簡単で信頼性の高い方法です。培養物を数回の継代で拡張して、単一の血液サンプルから数百万の細胞を生成することができます。

プロトコル

すべての動物実験は、ウィスコンシン医科大学とメイヨークリニックのそれぞれの施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

注:この研究では、ヨークシャー/ランドレース/デュロックのクロス家畜豚(Sus domestic us)、オスとメス、40〜80 kg、3〜6か月齢を使用しました。

1.ブタ末梢血の採取

1. 材料を準備します。
   1. ヘパリン溶液を滅菌生理食塩水で100 U / mLに希釈します。.
   2. 2つの50 mLコニカルチューブと2つの60 mLシリンジのそれぞれに3〜4 mLのヘパリン溶液を追加します。
   3. 希釈していないヘパリン溶液(1,000 U / mL)を延長チューブに引き込みます。
   4. ヘパリン充填延長チューブの一方の端に19 G針を接続し、もう一方の端にヘパリン含有60 mLシリンジを接続します。
2. 制度的方針に従って豚を麻酔する
   1. 麻酔を誘発するために、アトロピン(0.05 mg / kg)、チレタミン/ゾラゼパム(2-5 mg / kg)、およびキシラジン(2 mg / kg)のIM注射を投与します。.
      注:動物が意識を失い、下顎筋が硬くなくなると、適切な麻酔が達成されます。
   2. 動物を仰臥位に置き、安定感を高めるために丸めたタオルを両側に置きます。
   3. 麻酔下での乾燥を防ぐために眼科用軟膏を目に塗ります。
   4. 毛布、加熱パッド、および/または加熱された手順テーブルを含む麻酔中の熱サポートを提供します。
3. ベタジンスクラブ溶液で大腿鼠径部をきれいにします。
4. 19 Gの針で大腿静脈または動脈に穴を開け、ゆっくりと(~1-2 mL / s)50 mLの血液をシリンジに引き込みます。
   注: 描画が速すぎると、セルが損傷する可能性があります。
5. 針を所定の位置に残し、すぐに延長チューブをねじり、60 mLシリンジを外します
6. 血液をヘパリン含有50mLのコニカルチューブにゆっくりと移します。
7. 50 mLのコニカルチューブにしっかりと蓋をし、数回静かに反転させて混合し、氷の上に置きます。
8. 残りのヘパリン含有60 mLシリンジを延長チューブに接続し、延長チューブのネジを外し、さらに50 mLの血液をシリンジにゆっくりと吸引します。
9. すぐに動脈または静脈から針を外し、残りの血液を延長チューブからシリンジにゆっくりと引き抜きます。
10. 60 mLシリンジを延長チューブから外し、残りのヘパリン含有50 mLコニカルチューブに血液をゆっくりと移します。
11. 50 mLのコニカルチューブにしっかりと蓋をし、数回静かに反転させて混合し、氷の上に置きます。
12. ブタの大腿鼠径部に圧力止血を適用します。
13. 制度的方針に従って豚を回復します。動物が胸骨横臥を維持し、通常の住居/犬小屋エリアに戻るのに十分な意識を取り戻すまで、動物を継続的に監視します。

2. 単核球の単離

1. 4本の50 mLコニカルチューブでリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で血液を1:1に希釈します。
   注:この作業は、細胞培養物の汚染を避けるために、無菌技術を使用して細胞培養フードで実行する必要があります。
2. 25 mLの室温ですぐに使用できる密度勾配溶液を8本の50 mLコニカルチューブに加えます。
3. 50 mLのコニカルチューブを含む各密度勾配溶液の内側に沿って、チューブをピペットチップに対して鋭角に保持することにより、25 mLの血液/生理食塩水を非常にゆっくりとピペットします。
   注意: 血液溶液は、密度勾配溶液の上に穏やかに重なり、明確に定義されたインターフェースを維持する必要があります。
4. チューブを560 x g および室温(RT)で30分間遠心分離します。
   注意: 最良の結果を得るには、可能であれば遠心分離機ブレーキを無効にしてください。
5. 薄いピペットを使用して、各チューブからバフィーコート(密度勾配溶液の上と透明な血漿の下の単核細胞の濁った層)を注意深く収集し、2つの新しい50 mLコニカルチューブに均等に分配します。チューブを含む密度勾配溶液を廃棄します。
   注意: 密度勾配溶液とプラズマをできるだけ少なく収集しながら、できるだけ多くのバフィーコートを収集します。

3.細胞の洗浄とメッキ

1. 6ウェルプレートをフィブロネクチンでコーティングします。
   1. ヒト血漿フィブロネクチンを滅菌水で1 mg / mLに希釈してストック溶液を作ります。アリコートは-20°Cで保存してください。
   2. 600 μLのフィブロネクチンストック溶液を3 mLのPBSで希釈して、3.6 mLのフィブロネクチンの作業溶液を作ります。
   3. 600 μLのフィブロネクチン作業溶液を6ウェルプレートの各ウェルに移し、均一にコーティングされるまで穏やかに揺り動かします。
   4. フィブロネクチンがウェルをコーティングするまで30分待ち、各ウェルから溶液を静かに吸引します。
2. フィブロネクチンがコーティングするのを待っている間に、単核球を洗います
   1. チューブに最大45 mLのPBSを補充します
   2. 560 x g 、低ブレーキで4°Cで5分間遠心分離します。両方のチューブから上清を吸引します。
   3. 各細胞ペレットを25 mLのPBSに再懸濁します。
   4. 繰り返してもう一度洗います。
3. 各細胞ペレットを5 mLのPBSに再懸濁し、15 mLの0.8%塩化アンモニウム溶液を各チューブに加えます。
   注:このステップは、残りの赤血球を溶解することです。
4. 氷上で10分間インキュベートします。
5. 以前と同様に、チューブにPBSを補充し、560 x g 、低ブレーキで4°Cで5分間遠心分離して細胞を洗浄します。両方のチューブから上清を吸引します。
6. 各細胞ペレットを25 mLのPBSに再懸濁し、もう一度洗浄を繰り返します。
7. 各細胞ペレットを、10%ウシ胎児血清(FBS)と10,000 U/mLペニシリン、10 mg/mLストレプトマイシンおよび25 μg/mLアムホテリシンを含む1x抗生物質/抗真菌溶液を添加した6 mLのEGM-2培養液に再懸濁します。
   注:EGM-2培地は、200μLのヒドロコルチゾン、2mLのヒト線維芽細胞増殖因子(hFGF-B)、500μLの血管内皮増殖因子(VEGF)、500μLのインスリン様成長因子(_R3IGF-1 )の組換えアナログ、500μLのアスコルビン酸、500μLのヒト上皮成長因子(hEGF)を添加したEBM-2培養培地からなる。 500 mLあたり500 μLのゲンタマイシン/アンホテリシン、および500 μLのヘパリン。
8. 2 mLの細胞懸濁液をフィブロネクチンコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに静かに移し、均一にコーティングされるまで穏やかに揺り動かします。
   注:目標は、形成される内皮コロニーの数を最大化するために、できるだけ多くの細胞を播種することです。

4. 細胞培養

1. 細胞を37°C、5%_CO2、湿度100%でインキュベートします。
2. 翌日、1 mLの新鮮な培養液を各ウェルに穏やかに加えます。
   注:フィブロネクチンコーティングに緩く接着している細胞を乱さないように優しくすることが重要です。
3. 翌日、各ウェルから1.5 mLの培養液を静かに吸引し、1.5 mLの新鮮な培地と交換して、半培養液交換を行います。
4. 次の5日間のそれぞれで、各ウェルに完全培養培地交換を静かに行います(1ウェルあたり2 mLの新鮮な培地)。
5. その後、週に3回培養液を静かに交換します。
6. 低出力(対物レンズ4倍)光学顕微鏡下で細胞培養を定期的に可視化します。
   注:付着性血液伸長内皮細胞(BOEC)コロニーは、プレーティング後7〜10日でウェルに現れ始めます。非接着細胞型は培地の変更とともに廃棄され、他の接着細胞型はBOECコロニーが成長するにつれて徐々に消散します。
7. BOECをフィブロネクチンコーティングT-75フラスコに~70%-80%コンフルエントに通過させ、培養培地の交換を週に3回続けます。
   注:播種密度は、代わりにコロニーをT25フラスコに継代させることで制御できます。その後の継代はフィブロネクチンコーティングを必要とせず、培地交換は週に2回に減らすことができます。
8. 継代1〜3からの細胞は、実験に使用したり、凍結培地に移して将来の使用のために液体窒素中に保存したりすることができる。

結果

培養開始からBOECコロニーが観察されるまで培養細胞の形態が観察された(図1)。より小さな集団の接着細胞が培養皿に付着して増殖し始めましたが、非接着細胞は培地の変更とともに除去されました(図1B)。コロニーは、中心点から放射状に外側に増殖する内皮様細胞の集まりとして6日目に最初に現れました(図1D)。培養が進む...

ディスカッション

BOECは、さまざまな科学的および治療的アプローチで使用できる強力なツールです^7、8、16。BOECは、血管疾患および癌の発症に関与する重要な要因を解明するためにEC遺伝子発現を分析するために使用されています5,19,20,21。BOEC?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
19 G needle	Covidien	1188818112
50 mL conical tubes	Corning	352098
6 well plate	BD Falcon	353046
60 mL syringes	Covidien	8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%)	Stemcell Technologies	07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x)	Gibco	15240-062
Centrifuge	Thermo Scientific	75-253-839
EGM-2 culture medium	Lonza Walkersville	CC-3162
Extension tube	Hanna Pharmaceutical Supply Co.	03382C6227
Fetal bovine serum (FBS)	Atlas Biologicals	F-0500-A
Ficoll-Paque 1077	Cytiva	17144003	Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL)	Pfizer	00069-0058-01
Human plasma fibronectin	Gibco	33016-015
Ice	N/A	N/A
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Pipette set	Eppendorf	2231300004
Sterile water	Gibco	15230-162
Thin pipette	Celltreat Scientific	229280