אפיון צמיחת דם תאי אנדותל (BOEC) מדם היקפי חזירי

Abstract

האנדותל הוא מבנה משולב דינמי הממלא תפקיד חשוב בתפקודים פיזיולוגיים רבים כגון אנגיוגנזה, המוסטאזיס, דלקת והומאוסטזיס. האנדותל גם ממלא תפקיד חשוב בפתופיזיולוגיות כגון טרשת עורקים, יתר לחץ דם וסוכרת. תאי אנדותל יוצרים את הרירית הפנימית של כלי הדם והלימפה ומפגינים הטרוגניות במבנה ובתפקוד. קבוצות שונות העריכו את הפונקציונליות של תאי אנדותל שמקורם בדם היקפי אנושי תוך התמקדות בתאי אב אנדותל שמקורם בתאי גזע המטופויטיים או בתאי אנדותל בוגרים (או תאים יוצרי מושבות אנדותל). תאים אלה מספקים משאב אוטולוגי לטיפולים ולמידול מחלות. תאים קסנוגניים עשויים לספק מקור חלופי לטיפולים בשל זמינותם וההומוגניות המושגת על ידי שימוש בבעלי חיים דומים גנטית שגודלו בתנאים דומים. לפיכך, הוצג פרוטוקול חזק לבידוד והרחבה של תאי אנדותל בעלי שגשוג דם גבוה מדם היקפי חזירי. תאים אלה יכולים לשמש ליישומים רבים כגון הנדסת רקמות לב וכלי דם, תרפיה תאית, מידול מחלות, בדיקת תרופות, לימוד ביולוגיה של תאי אנדותל, ותרביות מבחנה כדי לחקור תגובות דלקתיות וקרישה בהשתלת קסנו.

Introduction

האנדותל הוא מבנה מורכב ודינמי ביותר ומרכיב חיוני בדופן כלי הדם. הוא מצפה את פני השטח הפנימיים של כלי הדם כדי לספק ממשק פיזי בין מחזור הדם לבין הרקמות הסובבות אותו. מבנה הטרוגני זה ידוע לבצע פונקציות שונות כגון אנגיוגנזה, דלקת, vasoregulation, hemostasis 1,2,3,4. תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי הם סוג תא שנחקר באופן נרחב כדי להעריך את הפונקציונליות של תאי אנדותל. עם זאת, השתנות האצווה הספציפית למטופל, פנוטיפ לא עקבי ויעילות פיצול מינימלית מצביעים על צורך לקבוע מקור תא שיכול לשפר את כל התכונות הללו⁵.

השגת אוכלוסייה הומוגנית של תאי אנדותל ראשוניים יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית, ולתאי אנדותל ראשוניים אין יכולת שגשוג גבוהה⁶. לפיכך, כדי לחקור התחדשות כלי דם ולהעריך תהליכים פתופיזיולוגיים, קבוצות שונות ניסו להשיג ולהעריך סוגים שונים של תאי אנדותל שמקורם בדם היקפי, למשל, תאי אב אנדותל (EPC) או תאי אנדותל צמיחת דם (BOECs)6,7,8,9 . ה-EPCs המוקדמים בצורת ציר מקורם בתאי גזע המטופויטיים (HSC) ויש להם עוצמת גדילה מוגבלת ויכולת אנגיוגנית מוגבלת לייצר תאי אנדותל בוגרים. יתר על כן, הם דומים מאוד מונוציטים דלקתיים. בנוסף, יכולתם להמשיך ולהתמיין לתאי אנדותל מתפקדים, מתרבים ובוגרים עדיין שנויה במחלוקת 6,7,9,10. התרבית המתמשכת של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) יכולה להצמיח אוכלוסייה משנית של תאים הידועים בשם EPCs מאוחרים, BOECs או תאים יוצרי מושבות אנדותל (ECFCs)6,7,9,10. מדינה ואחרים בשנת 2018, הכירו במגבלות של EPCs, בעמימות של המינוח שלהם, יחד עם חוסר התאמה כללי עם סוגי תאים מובחנים רבים המקובצים ברציפות תחת EPCs¹¹. לעומת זאת, BOECs הפכו מוכרים על תפקידם בתיקון כלי דם, בריאות ומחלות, וטיפול תאי. מחקר נוסף ושימוש טיפולי בתאים אלה יסתמכו על פרוטוקולים כדי להפיק באופן עקבי סוגי תאים אלה מתאי אב במחזור.

תאים ראשוניים כגון BOECs יכולים לשמש כפונדקאית להשגת תאי אנדותל בוגרים בעלי שגשוג גבוה⁶. BOECs נבדלים פנוטיפית מ- EPCs מוקדמים ומציגים תכונות אנדותל טיפוסיות כגון מורפולוגיה מרוצפת וביטוי של צמתים דבקים ומערות¹². פרופיל גנים שנערך על ידי Hebbel et ^al.13,14,15 מצא כי BOECs או ECFCs הם תאי אנדותל אמיתיים כפי שהם מקדמים היווצרות כלי דם וכלי דם גדולים. לפיכך, BOECs יכולים לשמש ככלי להערכת תהליכים פתופיזיולוגיים ושונות גנטית¹⁶. הם נחשבים גם למקור תאי מצוין לטיפול תאי להתחדשות כלי הדם¹⁷. לפיכך, פרוטוקול סטנדרטי כדי לגזור באופן עקבי תאים אלה מאוד שגשוג הוא חיוני.

בעוד BOECs מספקים כלי רב עוצמה לחקר השונות הפתופיזיולוגית והגנטית האנושית, מקור הומוגני יותר של BOECs עשוי לספק תוצאות ניסוייות וטיפוליות חזקות ואמינות יותר. הומוגניות מעולה יכולה להיות מושגת על ידי שימוש במקורות תאים קסנוגניים שמקורם בבעלי חיים דומים גנטית שגדלו בתנאים דומים¹⁸. בעוד מקורות תאים קסנוגניים נוטים לעורר תגובה חיסונית של המאכסן, אסטרטגיות אימונומודולציה מפותחות במטרה לייצר בעלי חיים ומוצרים מן החי התואמים למערכת החיסון, כולל תאים. חזירים, בפרט, הם מקור שופע של דם היקפי והם משמשים בדרך כלל לחקר מכשירים רפואיים וטיפולים אחרים בשל דמיון אנטומי ופיזיולוגי לבני אדם. לפיכך, מחקר זה מזקק את הפרוטוקול לבידוד והרחבה של BOECs מתרבים מאוד מדם היקפי חזירי. הפרוטוקול המפורט להלן הוא שיטה פשוטה ואמינה להשגת מספר רב של BOECs מנפח קטן יחסית של דם. ניתן להרחיב את התרביות באמצעות מספר מעברים כדי ליצור מיליוני תאים מדגימת דם אחת.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בהתאמה במכללה הרפואית של ויסקונסין ומאיו קליניק.

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בחזירי בית יורקשייר/לנדרייס/דורוק (Sus domesticus), זכר ונקבה, 40-80 ק"ג, בני 3-6 חודשים.

1. איסוף דם היקפי חזירי

1. הכינו חומרים.
   1. לדלל את תמיסת הפרין ל 100 U/mL במי מלח סטריליים.
   2. הוסף 3-4 מ"ל של תמיסת הפרין לכל אחד משני צינורות חרוטי 50 מ"ל ושני מזרקים 60 מ"ל.
   3. משוך תמיסת הפרין לא מדוללת (1,000 U/mL) לתוך צינור מאריך.
   4. חבר מחט 19 G לקצה אחד של צינור הארכה מלא הפרין ומזרק המכיל הפרין 60 מ"ל לקצה השני.
2. להרדים חזיר בהתאם למדיניות המוסדית
   1. מתן הזרקת IM של אטרופין (0.05 מ"ג/ק"ג), טילטמין/זולאזפאם (2-5 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (2 מ"ג/ק"ג) להשראת הרדמה.
      הערה: הרדמה מספקת מושגת ברגע שהחיה מחוסרת הכרה ושרירי הלסת אינם נוקשים.
   2. הניחו את בעל החיים במצב שכיבה והניחו מגבות מגולגלות משני הצדדים כדי לספק יציבות.
   3. יש למרוח משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
   4. לספק תמיכה תרמית במהלך ההרדמה כולל שמיכות, כריות חימום ו / או שולחן הליך מחומם.
3. נקו את אזור המפשעה של עצם הירך עם תמיסת פילינג בטאדין.
4. נקב את וריד הירך או עורק הירך עם מחט 19 G ולאט (~ 1-2 מ"ל / שנייה) למשוך 50 מ"ל של דם לתוך המזרק.
   הערה: ציור מהיר מדי עלול לגרום נזק לתאים.
5. השארת המחט במקום, מיד לסובב את צינור ההארכה לנתק את מזרק 60 מ"ל
6. מעבירים לאט את הדם לצינור חרוטי המכיל הפרין 50 מ"ל.
7. מכסים היטב את הצינור החרוטי 50 מ"ל, הופכים בעדינות כמה פעמים כדי לערבב, ומניחים על קרח.
8. חברו את המזרק הנותר המכיל הפרין 60 מ"ל לצינור המאריך, שחררו את הצינור המאריך ושאבו לאט לאט 50 מ"ל נוספים של דם לתוך המזרק.
9. מיד להסיר את המחט מן העורק או הווריד ולאט לאט למשוך את הדם שנותר מן הצינור הרחבה לתוך מזרק.
10. נתקו את מזרק 60 מ"ל מצינור ההארכה והעבירו באיטיות את הדם לצינור החרוטי הנותר המכיל הפרין 50 מ"ל.
11. מכסים היטב את הצינור החרוטי 50 מ"ל, הופכים בעדינות כמה פעמים כדי לערבב, ומניחים על קרח.
12. יש להפעיל המוסטאזיס לחץ על אזור המפשעה של עצם הירך של החזיר.
13. להחזיר את החזיר על פי המדיניות המוסדית. יש להשגיח באופן רציף על בעל החיים עד שהוא חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה ולחזור לאזור הדיור/כלבייה הרגיל.

2. בידוד תאים חד-גרעיניים

1. לדלל את הדם 1: 1 עם מלוחים חוצצים פוספט (PBS) בארבעה צינורות חרוטי 50 מ"ל.
   הערה: עבודה זו צריכה להתבצע במכסה מנוע של תרבית תאים תוך שימוש בטכניקה אספטית כדי למנוע זיהום של תרבית התא.
2. הוסף 25 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות מוכנה לשימוש בטמפרטורת החדר לשמונה צינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
3. לאט מאוד פיפטה 25 מ"ל של תמיסת דם/מלח לאורך החלק הפנימי של כל תמיסת שיפוע צפיפות המכילה צינור חרוטי 50 מ"ל על ידי החזקת הצינור בזווית חדה לקצה הפיפטה.
   הערה: תמיסת הדם צריכה להניח בעדינות שכבה על גבי תמיסת שיפוע הצפיפות ולשמור על ממשק מוגדר היטב.
4. צנטריפוגה את הצינורות במשך 30 דקות ב 560 x גרם ובטמפרטורת החדר (RT).
   הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השבת את בלם הצנטריפוגה במידת האפשר.
5. השתמש פיפטה דקה כדי לאסוף בזהירות את מעיל באפי (שכבה עכורה של תאים מונוגרעיניים מעל תמיסת שיפוע צפיפות מתחת פלזמה ברורה) מכל צינור ולהפיץ באופן שווה לתוך שני צינורות חרוטי חדשים 50 מ"ל. יש להשליך את תמיסת שיפוע הצפיפות המכילה צינורות.
   הערה: אספו כמה שיותר מהפרווה הבאפית תוך איסוף כמה שפחות מתמיסת שיפוע הצפיפות והפלזמה.

3. שטיפה וציפוי של תאים

1. מצפים צלחת 6 בארות עם פיברונקטין .
   1. הפוך פתרון מלאי של פיברונקטין פלזמה אנושי על ידי דילול אותו ל 1 מ"ג / מ"ל במים סטריליים. אחסן את aliquots ב -20 °C.
   2. הפוך 3.6 מ"ל של פתרון עבודה של פיברונקטין על ידי דילול 600 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פיברונקטין ב 3 מ"ל של PBS.
   3. מעבירים 600 μL של תמיסת העבודה פיברונקטין לכל באר של צלחת 6 בארות ורוקדים בעדינות עד לציפוי אחיד.
   4. המתינו 30 דקות עד שהפיברונקטין יצפה את הבארות ושאפו בעדינות את התמיסה מכל באר.
2. בזמן ההמתנה פיברונקטין לצפות, לשטוף את התאים mononuclear
   1. מלא את הצינורות עם עד 45 מ"ל של PBS
   2. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 560 x גרם ו 4 ° C עם בלימה נמוכה. שאפו את הסופרנאטנט משני הצינורות.
   3. השהה מחדש כל כדור תא ב 25 מ"ל של PBS.
   4. חזרו על הפעולה כדי לשטוף פעם נוספת.
3. השהה מחדש כל כדור תא ב -5 מ"ל של PBS והוסף 15 מ"ל של תמיסת אמוניום כלוריד 0.8% לכל צינור.
   הערה: שלב זה הוא ליזה של תאי הדם האדומים הנותרים.
4. דוגרים על קרח במשך 10 דקות.
5. שטפו את התאים כמו קודם על ידי מילוי צינורות עם PBS וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 560 x גרם ו 4 ° C עם בלימה נמוכה. שאפו את הסופרנאטנט משני הצינורות.
6. יש להשהות מחדש כל כדור תא ב-25 מ"ל של PBS ולחזור על השטיפה פעם נוספת.
7. יש להשהות מחדש כל כדורית ב-6 מ"ל של מדיום תרבית EGM-2 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ותמיסה אנטיביוטית/אנטי-מיקוטית אחת המכילה 10,000 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין 10 מ"ג/מ"ל ו-25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין.
   הערה: מדיום תרבית EGM-2 מורכב ממדיום תרבית EBM-2 בתוספת 200 μL של הידרוקורטיזון, 2 מ"ל של גורם גדילה פיברובלסטי אנושי (hFGF-B), 500 μL של גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF), 500 μL של אנלוגי רקומביננטי של גורם גדילה דמוי אינסולין (R₃ IGF-1), 500 μL של חומצה אסקורבית, 500 μL של גורם גדילה אפידרמיס אנושי (hEGF), 500 μL של gentamicin/amphotericin, ו 500 μL של הפרין לכל 500 מ"ל.
8. מעבירים בעדינות 2 מ"ל מתרחיף התא לכל באר של צלחת 6 בארות מצופה פיברונקטין ומנערים בעדינות עד לציפוי אחיד.
   הערה: המטרה היא לזרוע כמה שיותר תאים כדי למקסם את מספר מושבות האנדותל שייווצרו.

4. תרבית תאים

1. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C, 5%_CO2 ו-100% לחות.
2. למחרת, להוסיף בעדינות 1 מ"ל של מדיום תרבית טרי לכל באר.
   הערה: חשוב להיות עדינים כדי לא להפריע לתאים הנצמדים באופן רופף לציפוי הפיברונקטין (fibronectin).
3. למחרת, בצע שינוי מדיום חצי תרבית על ידי שאיפה עדינה של 1.5 מ"ל של מדיום תרבות מכל באר והחלפתו ב -1.5 מ"ל של מדיום תרבות טרי.
4. בכל אחד מ-5 הימים הבאים, בצעו בעדינות שינוי מדיום תרבית מלא לכל באר (2 מ"ל מדיום תרבית טרי לכל באר).
5. לאחר מכן, לשנות בעדינות את המדיום התרבות שלוש פעמים בשבוע.
6. דמיינו באופן קבוע את תרביות התאים תחת מיקרוסקופ אור בהספק נמוך (4x אובייקטיבי).
   הערה: מושבות תאי אנדותל (BOEC) יתחילו להופיע בבארות 7-10 ימים לאחר הציפוי. סוגי תאים שאינם דבקים יושלכו עם שינויים בינוניים, וסוגי תאים דבקים אחרים יתפוגגו בהדרגה ככל שמושבות BOEC יגדלו.
7. יש להעביר את ה-BOECs לבקבוק T-75 מצופה פיברונקטין כאשר ~70%-80% מתמזגים, ולהמשיך להחליף מדיום תרבית שלוש פעמים בשבוע.
   הערה: ניתן לשלוט בצפיפות הזריעה על ידי העברת מושבות לבקבוק T25 במקום. המעברים הבאים אינם דורשים ציפוי פיברונקטין וניתן לצמצם את שינויי המדיום בתרבית לפעמיים בשבוע.
8. תאים ממעברים 1-3 עשויים לשמש לניסויים או להיות מועברים לתווך הקפאה ומאוחסנים בחנקן נוזלי לשימוש עתידי.

תוצאות

המורפולוגיה של התאים בתרבית נצפתה מתחילת התרבית ועד שנצפו מושבות BOEC (איור 1). אוכלוסייה קטנה יותר של תאים דבקים החלה להיצמד לצלחות התרבית ולגדול, בעוד שתאים לא נצמדים הוסרו עם שינויים בינוניים בתרבית (איור 1B). מושבות הופיעו לראשונה ביום 6 כאוסף של תאים דמויי ?...

Discussion

BOECs הם כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו בגישות מדעיות וטיפוליות שונות ^7,8,16. BOECs שימשו לניתוח ביטוי גנים EC כדי להבהיר את גורמי המפתח האחראים להתפתחות מחלות כלי דם וסרטן 5,19,20,21.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
19 G needle	Covidien	1188818112
50 mL conical tubes	Corning	352098
6 well plate	BD Falcon	353046
60 mL syringes	Covidien	8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%)	Stemcell Technologies	07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x)	Gibco	15240-062
Centrifuge	Thermo Scientific	75-253-839
EGM-2 culture medium	Lonza Walkersville	CC-3162
Extension tube	Hanna Pharmaceutical Supply Co.	03382C6227
Fetal bovine serum (FBS)	Atlas Biologicals	F-0500-A
Ficoll-Paque 1077	Cytiva	17144003	Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL)	Pfizer	00069-0058-01
Human plasma fibronectin	Gibco	33016-015
Ice	N/A	N/A
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Pipette set	Eppendorf	2231300004
Sterile water	Gibco	15230-162
Thin pipette	Celltreat Scientific	229280