改良的小鼠神经性疼痛备用神经损伤手术模型

摘要

改良手术是一种用于小鼠或大鼠幸免神经损伤模型的简化方法，只需要一次结扎和一次切割即可损伤腓总神经和腓肠神经。

摘要

备用神经损伤 （SNI） 是一种模拟周围神经损伤主要症状的动物模型，用于研究小鼠和大鼠神经性疼痛的分子和细胞机制。目前，有两种类型的 SNI 模型，一种是用完整的腓肠神经切割和结扎腓总神经和胫神经，在本研究中定义为 SNIs，另一种是用完整的胫神经切割和结扎腓总神经和腓肠神经，在本研究中定义为 SNIt。因为腓肠神经是纯粹的感觉神经，而胫神经同时包含运动和感觉纤维，所以 SNIt 模型的运动缺陷比 SNIs 模型少得多。在传统的 SNIt 小鼠模型中，腓总神经和腓肠神经分别被切割和结扎。这里描述了一种改进的 SNIt 手术方法，只需一次结扎和一次切割即可损伤腓总神经和腓肠神经，手术时间更短，这更容易执行并降低了拉伸坐骨神经或胫神经的潜在风险，并产生与传统 SNIt 模型相似的机械超敏反应。

引言

手术或创伤后神经损伤引起的神经性疼痛具有损害生活质量的重大经济负担。成功开发了许多神经损伤模型，包括脊神经结扎术 （SNL）¹、坐骨神经慢性缩窄性损伤 （CCI）²、部分坐骨神经结扎术 （pSNL）³、坐骨神经交易 （SNT）⁴ 和幸存神经损伤 （SNI）^5,6,7,8，以模拟大鼠和小鼠周围神经损伤的主要症状，用于研究神经性疼痛 ^6,7,8,9,10。然而，每种手术模型都有其优点和局限性，因此应特别注意探索和开发手术模型¹⁰。

啮齿动物 SNI 模型对机械刺激产生长期超敏反应。但是，这有点令人困惑，因为有两种不同的 SNI 模型。最初的 SNI 模型是在 Woolf 的实验室开发的，其中腓总神经和胫神经受损，腓肠神经完好无损 ^5,6。第二个 SNI 模型是在 Basbaum 的实验室开发的，其中腓总神经和腓肠神经受损，胫神经完好无损 ^7,8。最初的 Woolf 模型在这里被定义为 SNIs，因为腓肠神经保持完整，而 Basbaum 的模型在这里被定义为 SNIt，因为胫神经保持完整。因为腓肠神经是纯粹的感觉神经，而胫神经同时包含运动和感觉纤维，所以 SNIt 模型的运动缺陷比 SNIs 模型少得多。然而，与 SNIs 模型不同的是，SNIt 模型中的小鼠不会发展为热超敏反应，但在两种模型中都会发展为机械超敏反应。虽然 SNIt 模型是一个相对简单的程序，但它需要分别结扎腓肠神经和腓总神经，并且存在拉伸坐骨神经或胫神经的潜在风险 6,7,8,9。

腓总神经、胫骨神经和腓肠神经是坐骨神经的三个分支，可以在腓肠肌的上缘清楚地识别出来（图 1）:胫神经位于腓肠肌下方，腓总神经（头侧）和腓肠神经（尾侧）位于腓肠肌上方¹¹.基于其解剖学特征，开发了一种改良的小鼠 SNIt 手术程序，只需一次神经结扎和一次神经切割即可将腓总神经和腓肠神经结扎在一起，从而缩短了手术时间。

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研究方案

动物实验经 UCSF 机构动物护理和使用委员会批准，并根据 NIH 实验动物护理和使用指南进行。本研究使用体重 20-30 g 的成年 C57BL/6 小鼠。von Frey 评估在下午 1:00 到 3:00 之间进行。

1. 麻醉和小鼠准备

1. 将小鼠以 1.0 L/min 的流速放入充满 2% 异氟醚的 O₂ 溶液中的塑料室中，直至完全麻醉。
2. 使用棉绒涂抹器用眼药膏覆盖眼睛。
3. 在整个手术过程中，将小鼠的鼻子放入具有 2% 异氟醚流量的柔性鼻锥中。
4. 将鼠标置于右侧位置。保持左腿抬起，膝盖屈曲，并用胶带固定。
5. 用电动剃须刀和脱毛霜去除大腿和膝盖周围的毛发。用 2% 的洗必泰和 70% 的酒精对皮肤进行消毒。
6. 以镊子为标准测试对后肢或尾巴上的捏刺激没有反应，确保在手术前有足够的麻醉深度。为鼠标提供散热支持。
   注意:在执行 SNIt 模型之前和之后均未使用局部麻醉剂或 NSAID，因为局部麻醉剂和非甾体抗炎药可显着减轻^{SNIt 12} 后的神经性疼痛行为。

2. 改良 SNIt 手术

1. 从穿过膝盖的水平线的前 1/3 开始切一个 1 厘米的切口，与手术刀的垂直线成大约 30° 角（图 2A）。
2. 分离皮肤切口后，股二头肌 （BFM） 下方可以看到两条白线，内侧（头侧）粗线为股骨，外侧（尾）细线为坐骨神经（图2B）。
3. 用弯曲的微镊子和微剪刀沿尾部白线钝解剖 BFM，露出坐骨神经。避免钝性解剖时血管损伤。如果发生意外血管损伤，请使用无菌棉签吸收血液并施加适当的压力以止血。
4. 将这三个分支与腓肠肌上缘的坐骨神经区分开来。胫神经是直径最大的神经，穿过腓肠肌下方，而腓肠神经（外侧，直径最小）和腓总神经（内侧）位于腓肠肌上方（图 2C 和 图 3A）。
5. 根据 BFM 的解剖和打开方式，将腓总神经可视化为胫神经的外侧（图 2C）或内侧（图 3A）。
6. 使用曲线微型镊子将腓总神经和腓肠神经与邻近组织分开。
7. 用 6-0 缝合线将腓总神经和腓肠神经结扎在一起，因为两条神经都在腓肠肌上方运行，但胫神经在腓肠肌下方通过（图 2D 和 图 3B，C）。观察结扎紧后肢体的收缩情况。对于传统方法，分别结扎腓总神经和腓肠神经。
8. 用一把微型剪刀在结扎处 2-4 毫米内的远端部分切断神经。确保胫神经在整个过程中保持不变。对于传统方法，在结扎 2-4 毫米内切开远端的腓总神经和腓肠神经，并分别取出 2 毫米的切片。
9. 用 6-0 丝缝合线闭合肌肉层，并用伤口夹闭合皮肤切口。
10. 手术后，将小鼠放回动物室，直到从麻醉中完全恢复。每天检查切口是否完整、食物摄入量是否正常、饮水量、一般身体状况、规律的运动和仪容仪表。手术后 7-14 天取下伤口夹。

3. 机械阈值的 von Frey 评估

1. 将小鼠适应测试室环境和测试材料 6 天以进行 von-Frey 评估。将小鼠放在透明的塑料圆筒中，放在高架金属丝网网格上，适应 1 小时。在每个圆筒之间放置白纸，以防止每个测试动物出现任何视觉提示。
2. 在此期间，每 2 天进行一次习惯化，并在最后一次习惯化后测量后爪足底中部下 von Frey 单丝的基线。
3. 使用盲人测试员执行 von Frey 评估。使用上下范式¹³ 用 von Frey 细丝刺激后爪的足底中部。将 von Frey 细丝垂直涂抹在足底表面，用力造成轻微卷曲。
4. 验证积极的反应，如突然的爪子抽回、突然的畏缩或突然的舔爪子。以 5 s 的间隔施加下一个刺激，以避免前一个刺激的影响。
5. 通过平均进行 3 次训练来确认每只爪子的机械阈值。
6. 根据由上下法确定的 50% 后爪撤出阈值，使用 0.16 g 细丝的百分比反应法进一步评估差异。
7. 记录对后爪足底中部施加 0.16 g 细丝 10 次刺激后积极反应的百分比，无论反应如何。
8. 在手术前第 1 天和术后第 1、3、5、7 和 14 天进行 von Frey 评估。

4. 统计分析

1. 将正态分布的连续数据报告为平均值±平均值的标准误差 （SEM）。使用 2 尾 t 检验或双向重复测量方差分析分析连续数据。使用统计分析软件处理所有数据，具有 p < 0.05 水平的统计显着性。

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结果

改良方法和传统方法之间的手术时间比较。
分别在 5 只采用改良方法的小鼠和 5 只采用传统方法的小鼠中记录从切割皮肤开始到闭合皮肤结束的手术时间。使用最少数量的动物来获得具有统计学意义的结果。与传统方法 ^7,14 执行 SNIt 的对照相比，修改后的方法花费了几乎一半的手术时间 （236.2 ± 28.6 s vs. 4...

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讨论

与分别结扎腓总神经和腓肠神经的传统小鼠 SNIt 方法^相比 6,7,8,9，^改进的 SNIt 模型具有三个优点:（1） 收缩或拉伸坐骨神经或胫神经的风险较小;（2） 神经切割后无需切除远端神经残端，因为通过将腓总神经和腓肠神经连接在一起，远端神经残端在解剖学上与近端残端分离。?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 suture	Henry Schein	9007482	Nerve ligation and close the muscular layer
Iris Scissors	Integra Miltex	12460598	Cut muscle and fascia
Mayo dissecting scissors	Fisherbrand	895120	Cut skin incision
Micro forcep	Fisherbrand	16100110	Blunt dissection biceps femoris muscle
Micro Scissors	Excelta	17467496	Cut nerve
Microdissection Forceps	Fisherbrand	16100123	Separate the common peroneal and the sural nerves from the neighboring tissues
Needle Holder	Fisherbrand	8966	Hold 6-0 needle
Prism software	Graph Pad	version 8.0	Statistical analysis software
Wound clips	Roboz Surgical	NC1878744	Close skin incision