Modelo de cirurgia de lesão nervosa poupada modificada de dor neuropática em camundongos

Resumo

A cirurgia modificada é um método simplificado para o modelo de lesão nervosa poupada de camundongo ou rato que requer apenas uma ligadura e um corte para lesionar os nervos fibular e sural comuns.

Resumo

A lesão do nervo poupado (SNI) é um modelo animal que imita os sintomas cardinais da lesão do nervo periférico para estudar o mecanismo molecular e celular da dor neuropática em camundongos e ratos. Atualmente, existem dois tipos de modelo de SNI, um para cortar e ligar os nervos fibular comum e tibial com nervo sural intacto, que é definido como SNIs neste estudo, e outro para cortar e ligar os nervos fibular comum e sural com nervo tibial intacto, que é definido como SNIt neste estudo. Como o nervo sural é puramente sensorial, enquanto o nervo tibial contém fibras motoras e sensoriais, o modelo SNIt tem muito menos déficit motor do que o modelo SNIs. No modelo tradicional de camundongo SNIt, os nervos fibular comum e sural são cortados e ligados separadamente. Aqui, um método de cirurgia SNIt modificado é descrito para danificar os nervos fibular e sural comuns com apenas uma ligadura e um corte com um tempo de procedimento mais curto, o que é mais fácil de realizar e reduz o risco potencial de alongamento dos nervos ciático ou tibial, e produz hipersensibilidade mecânica semelhante ao modelo SNIt tradicional.

Introdução

A dor neuropática induzida por lesão nervosa após cirurgia ou trauma tem um ônus econômico significativo que prejudica a qualidade de vida. Uma série de modelos de lesão nervosa, incluindo ligadura do nervo espinhal (SNL)¹, lesão por constrição crônica (CCI)² no nervo ciático, ligadura parcial do nervo ciático (pSNL)³, transação do nervo ciático (SNT)⁴ e lesão do nervo poupado (SNI)5,6,7,8, foram desenvolvidos com sucesso para imitar os sintomas cardinais da lesão do nervo periférico em ratos e camundongos para estudar o mecanismo molecular e celular de dor neuropática 6,7,8,9,10. No entanto, cada modelo cirúrgico tem seus benefícios e limitações, portanto, atenção especial deve ser dada à exploração e desenvolvimento dos modelos cirúrgicos¹⁰.

O modelo SNI de roedores produz hipersensibilidade de longo prazo à estimulação mecânica. No entanto, é um pouco confuso porque existem dois modelos SNI diferentes. O modelo inicial de SNI foi desenvolvido no laboratório de Woolf, no qual os nervos fibular comum e tibial foram lesados, deixando o nervo sural intacto ^5,6. O segundo modelo de SNI foi desenvolvido no laboratório de Basbaum, no qual os nervos fibular comum e sural foram lesados, deixando o nervo tibial intacto ^7,8. O modelo inicial de Woolf é definido como SNIs aqui porque o nervo sural é deixado intacto, e o modelo de Basbaum é definido como SNIt aqui porque o nervo tibial é deixado intacto. Como o nervo sural é puramente sensorial, enquanto o nervo tibial contém fibras motoras e sensoriais, o modelo SNIt tem muito menos déficit motor do que o modelo SNIs. No entanto, ao contrário do modelo SNIs, os camundongos no modelo SNIt não desenvolvem hipersensibilidade térmica, mas a hipersensibilidade mecânica se desenvolve em ambos os modelos. Embora o modelo SNIt seja um procedimento relativamente fácil, ele requer a ligadura dos nervos sural e fibular comum separadamente, com o risco potencial de estiramento dos nervos ciático ou tibial 6,7,8,9.

Os nervos fibular, tibial e sural comum são três ramos do nervo ciático e podem ser claramente identificados na borda superior do músculo gastrocnêmio (Figura 1): o nervo tibial passa por baixo do músculo gastrocnêmio e o fibular comum (lado cefálico) e o nervo sural (lado caudal) estão acima do músculo gastrocnêmio¹¹. Com base em suas características anatômicas, um procedimento de cirurgia SNIt de camundongo modificado foi desenvolvido para ligar os nervos fibular e sural comuns juntamente com apenas uma ligadura nervosa e um corte de nervo, o que resulta em menor tempo de procedimento.

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Protocolo

Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSF e foram conduzidos de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Camundongos C57BL/6 adultos pesando 20-30 g foram usados neste estudo. A avaliação de von Frey foi realizada entre 13:00 e 15:00 horas.

1. Anestesia e preparação do camundongo

1. Coloque um camundongo em uma câmara de plástico cheia de isoflurano a 2% em O₂ a uma taxa de fluxo de 1,0 L/min até que esteja totalmente anestesiado.
2. Cubra os olhos com pomada oftálmica usando um aplicador de algodão.
3. Coloque o focinho do camundongo em um cone nasal flexível com fluxo de isoflurano a 2% durante todo o procedimento cirúrgico.
4. Coloque o mouse em uma posição lateral direita. Mantenha a perna esquerda para cima com flexão do joelho e prenda-a com fita adesiva.
5. Remova os pelos ao redor da coxa e joelho com um barbeador elétrico e creme depilatório. Desinfete a pele com clorexidina a 2% e álcool a 70%.
6. Garanta profundidade de anestesia suficiente antes da cirurgia, testando nenhuma resposta ao estímulo de pinça no membro posterior ou na cauda com uma pinça como padrão. Forneça suporte térmico ao mouse.
   NOTA: Nenhum anestésico local ou AINE foi usado antes e depois da realização do modelo SNIt, pois o anestésico local e o AINE reduzem significativamente o comportamento da dor neuropática após o SNIt¹².

2. Cirurgia SNIt modificada

1. Corte uma incisão de 1 cm começando no primeiro 1/3 da linha horizontal cruzando o joelho com um ângulo de aproximadamente 30° da linha vertical com um bisturi (Figura 2A).
2. Duas linhas brancas podem ser visualizadas sob o músculo bíceps femoral (BFM) após a separação da incisão na pele, com a linha grossa medial (cefálica) como fêmur e a linha fina lateral (caudal) como nervo ciático (Figura 2B).
3. Dissecção romba BFM ao longo da linha branca caudal com micropinça curva e microtesoura para expor o nervo ciático. Evite danos aos vasos sanguíneos durante a dissecção romba. Se ocorrer dano acidental ao vaso, use cotonetes estéreis para absorver o sangue e aplique a pressão adequada para parar o sangramento.
4. Diferencie os três ramos do nervo ciático na borda superior do músculo gastrocnêmio. O nervo tibial é aquele com maior diâmetro passando sob o músculo gastrocnêmio, enquanto os nervos sural (lateral, o menor diâmetro) e o nervo fibular comum (medial) correm acima do músculo gastrocnêmio (Figura 2C e Figura 3A).
5. Dependendo de como o BFM é dissecado e aberto, visualize o nervo fibular comum como lateral (Figura 2C) ou medial (Figura 3A) ao nervo tibial.
6. Separe os nervos fibular comum e sural dos tecidos vizinhos usando uma micropinça curva.
7. Ligue os nervos fibular e sural comuns com uma sutura 6-0, pois ambos os nervos correm acima do músculo gastrocnêmio, mas o nervo tibial passa sob o músculo gastrocnêmio (Figura 2D e Figura 3B, C). Observe o membro quanto à contração após a ligadura apertada. Para o método tradicional, ligue os nervos fibular e sural comuns separadamente.
8. Corte o nervo em uma parte distal dentro de 2-4 mm da ligadura com uma microtesoura. Certifique-se de que o nervo tibial permaneça intocado durante todo o procedimento. Para o método tradicional, corte os nervos fibular e sural comuns na parte distal dentro de 2-4 mm da ligadura e remova uma seção de 2 mm, separadamente.
9. Feche a camada muscular com uma sutura de seda 6-0 e a incisão na pele com clipes de ferida.
10. Após a cirurgia, devolva os camundongos à sala dos animais até a recuperação total da anestesia. Verifique diariamente se há incisões intactas, ingestão normal de alimentos, consumo de água, condição geral do corpo, movimentos regulares e higiene. Remova os clipes da ferida 7 a 14 dias após a cirurgia.

3. Avaliação de von Frey para limiar mecânico

1. Aclimatar os camundongos por 6 dias ao ambiente da sala de testes e materiais de teste para realizar a avaliação von-Frey. Coloque os ratos em cilindros de plástico transparente em uma grade de malha de arame elevada por 1 h de habituação. Coloque papéis brancos entre cada cilindro para evitar qualquer sugestão visual de cada animal de teste.
2. Durante este período, realize a habituação a cada 2 dias e meça a linha de base dos monofilamentos de von Frey sob o plantar médio da pata traseira após a última habituação.
3. Realize a avaliação de von Frey com um testador cego. Estimule o plantar médio da pata traseira com filamentos de von Frey usando o paradigma de cima para baixo¹³. Aplique o filamento de von Frey na superfície plantar perpendicularmente com força aplicada para causar leve ondulação.
4. Verifique as respostas positivas como retirada repentina da pata, recuo repentino ou lambida repentina da pata. Exerça o próximo estímulo em um intervalo de 5 s para evitar a influência do estímulo anterior.
5. Confirme o limiar mecânico por pata fazendo uma média de 3 sessões.
6. Com base no limite de retirada de 50% da pata traseira decidido pelo método de cima para baixo, use o método de resposta percentual com filamento de 0,16 g para avaliar ainda mais a diferença.
7. Registre a porcentagem de respostas positivas após 10 estímulos de filamento de 0,16 g aplicados no plantar médio da pata traseira, independentemente das respostas.
8. Realize as avaliações de von Frey no dia 1 pré-operatório e pós-operatório nos dias 1, 3, 5, 7 e 14.

4. Análise estatística

1. Relate dados contínuos normalmente distribuídos como média ± erro padrão da média (SEM). Analise os dados contínuos com teste t bicaudal ou ANOVA de medidas repetidas bidirecionais. Processe todos os dados usando software de análise estatística, com significância estatística no nível de p < 0,05.

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Resultados

A comparação do tempo de procedimento entre métodos modificados e tradicionais.
O tempo de procedimento desde o início do corte da pele até o final do fechamento da pele foi registrado em 5 camundongos com a abordagem modificada e 5 camundongos com a abordagem tradicional, respectivamente. Um número mínimo de animais foi utilizado para obter resultados com significância estatística. Em comparação com o controle da abordagem tradicional

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Discussão

Comparado ao método tradicional SNIt de camundongo que liga o nervo fibular comum e o nervo sural separadamente 6,7,8,9, o modelo SNIt modificado tem três vantagens: (1) tem menos risco de contrair ou esticar os nervos ciático ou tibial; (2) não há necessidade de remover os cotos do nervo distal após o corte do nervo porque, ligando o nervo fibular comum ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 suture	Henry Schein	9007482	Nerve ligation and close the muscular layer
Iris Scissors	Integra Miltex	12460598	Cut muscle and fascia
Mayo dissecting scissors	Fisherbrand	895120	Cut skin incision
Micro forcep	Fisherbrand	16100110	Blunt dissection biceps femoris muscle
Micro Scissors	Excelta	17467496	Cut nerve
Microdissection Forceps	Fisherbrand	16100123	Separate the common peroneal and the sural nerves from the neighboring tissues
Needle Holder	Fisherbrand	8966	Hold 6-0 needle
Prism software	Graph Pad	version 8.0	Statistical analysis software
Wound clips	Roboz Surgical	NC1878744	Close skin incision