Modello modificato di chirurgia delle lesioni nervose risparmiate del dolore neuropatico nei topi

Riepilogo

La chirurgia modificata è un metodo semplificato per il modello di lesione nervosa risparmiata da topi o ratti che richiede solo una legatura e un taglio per ferire sia il nervo peroneo comune che quello surale.

Abstract

La lesione del nervo risparmiato (SNI) è un modello animale che imita i sintomi cardinali della lesione del nervo periferico per studiare il meccanismo molecolare e cellulare del dolore neuropatico nei topi e nei ratti. Attualmente, ci sono due tipi di modello SNI, uno per tagliare e legare il peroneo comune e i nervi tibiale con nervo surale intatto, che è definito come SNI in questo studio, e un altro per tagliare e legare il peroneo comune e i nervi surali con nervo tibiale intatto, che è definito come SNIt in questo studio. Poiché il nervo surale è puramente sensoriale mentre il nervo tibiale contiene sia fibre motorie che sensoriali, il modello SNIt ha un deficit motorio molto inferiore rispetto al modello SNI. Nel modello murino SNIt tradizionale, il peroneo comune e i nervi surali vengono tagliati e legati separatamente. Qui viene descritto un metodo di chirurgia SNIt modificato per danneggiare sia il comune nervo peroneo che quello surale con una sola legatura e un taglio con un tempo di procedura più breve, che è più facile da eseguire e riduce il potenziale rischio di stiramento dei nervi sciatico o tibiale e produce un'ipersensibilità meccanica simile al modello SNIt tradizionale.

Introduzione

Il dolore neuropatico indotto da lesioni nervose a seguito di un intervento chirurgico o di un trauma ha un onere economico significativo che compromette la qualità della vita. Una serie di modelli di lesioni nervose, tra cui la legatura del nervo spinale (SNL)¹, la lesione da costrizione cronica (CCI)² al nervo sciatico, la legatura parziale del nervo sciatico (pSNL)³, la transazione del nervo sciatico (SNT)⁴ e la lesione del nervo risparmiato (SNI)5,6,7,8, sono stati sviluppati con successo per imitare i sintomi cardinali della lesione del nervo periferico nei ratti e nei topi per studiare il meccanismo molecolare e cellulare di dolore neuropatico 6,7,8,9,10. Tuttavia, ogni modello chirurgico ha i suoi vantaggi e i suoi limiti, quindi è necessario prestare particolare attenzione all'esplorazione e allo sviluppo dei modelli chirurgici¹⁰.

Il modello SNI dei roditori produce un'ipersensibilità a lungo termine alla stimolazione meccanica. Tuttavia, è un po' confuso perché ci sono due diversi modelli SNI. Il modello iniziale di SNI è stato sviluppato nel laboratorio di Woolf, in cui il peroneo comune e i nervi tibiale sono stati danneggiati, lasciando intatto il nervo surale ^5,6. Il secondo modello SNI è stato sviluppato nel laboratorio di Basbaum, in cui il peroneo comune e i nervi surali sono stati feriti, lasciando intatto il nervo tibiale ^7,8. Il modello iniziale di Woolf è definito come SNI qui perché il nervo surale è lasciato intatto, e il modello di Basbaum è definito come SNIt qui perché il nervo tibiale è lasciato intatto. Poiché il nervo surale è puramente sensoriale mentre il nervo tibiale contiene sia fibre motorie che sensoriali, il modello SNIt ha un deficit motorio molto inferiore rispetto al modello SNI. Tuttavia, a differenza del modello SNIs, i topi nel modello SNIt non sviluppano ipersensibilità termica, ma l'ipersensibilità meccanica si sviluppa in entrambi i modelli. Sebbene il modello SNIt sia una procedura relativamente semplice, richiede la legatura separata dei nervi surale e peroneo comune con il potenziale rischio di allungamento dei nervi sciatico o tibiale 6,7,8,9.

I nervi peroneo, tibiale e surale comune sono tre rami del nervo sciatico e possono essere chiaramente identificati sul bordo superiore del muscolo gastrocnemio (Figura 1): il nervo tibiale passa sotto il muscolo gastrocnemio e il peroneo comune (lato cefalico) e il nervo surale (lato caudale) sono sopra il muscolo gastrocnemio¹¹. Sulla base delle sue caratteristiche anatomiche, è stata sviluppata una procedura chirurgica SNIt di topo modificata per legare i nervi peroneo e surale comuni insieme a una sola legatura nervosa e un taglio del nervo, il che si traduce in una riduzione del tempo della procedura.

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Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'UCSF e sono stati condotti in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. In questo studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6 del peso di 20-30 g. La valutazione von Frey è stata eseguita tra le 13:00 e le 15:00.

1. Anestesia e preparazione del topo

1. Posizionare un topo in una camera di plastica riempita con isoflurano al 2% in O₂ a una portata di 1,0 L/min fino a quando non è completamente anestetizzato.
2. Coprire gli occhi con un unguento oftalmico utilizzando un applicatore di cotone idrofilo.
3. Posizionare il muso del topo in un cono nasale flessibile con flusso di isoflurano al 2% durante la procedura chirurgica.
4. Posizionare il mouse in una posizione laterale destra. Tenere la gamba sinistra sollevata con la flessione del ginocchio e fissarla con del nastro adesivo.
5. Rimuovi i peli intorno alla zona della coscia e del ginocchio con un rasoio elettrico e una crema depilatoria. Disinfettare la pelle con clorexidina al 2% e alcol al 70%.
6. Garantire una profondità di anestesia sufficiente prima dell'intervento chirurgico testando l'assenza di risposta allo stimolo di pizzicamento sull'arto posteriore o sulla coda con una pinzetta come standard. Fornire supporto termico al mouse.
   NOTA: Nessun anestetico locale o FANS è stato utilizzato prima e dopo l'esecuzione del modello SNIt perché l'anestetico locale e i FANS riducono significativamente il comportamento del dolore neuropatico dopo SNIt¹².

2. Chirurgia SNIt modificata

1. Praticare un'incisione di 1 cm partendo dal primo 1/3 della linea orizzontale che attraversa il ginocchio con un angolo di circa 30° rispetto alla linea verticale con un bisturi (Figura 2A).
2. Due linee bianche possono essere visualizzate sotto il muscolo bicipite femorale (BFM) dopo aver separato l'incisione cutanea, con la linea spessa mediale (cefalade) come femore e la linea sottile laterale (caudale) come nervo sciatico (Figura 2B).
3. Sezionare smussatamente il BFM lungo la linea bianca caudale con micro pinze curve e micro forbici per esporre il nervo sciatico. Evitare danni ai vasi sanguigni durante la dissezione contundente. In caso di danni accidentali ai vasi, utilizzare tamponi di cotone idrofilo sterili per assorbire il sangue e applicare una pressione adeguata per fermare l'emorragia.
4. Differenziare i tre rami dal nervo sciatico sul bordo superiore del muscolo gastrocnemio. Il nervo tibiale è quello con il diametro maggiore che passa sotto il muscolo gastrocnemio, mentre i nervi surali (laterale, il diametro più piccolo) e il nervo peroneo comune (mediale) corrono sopra il muscolo gastrocnemio (Figura 2C e Figura 3A).
5. A seconda di come il BFM viene sezionato e aperto, visualizzare il nervo peroneo comune come laterale (Figura 2C) o mediale (Figura 3A) rispetto al nervo tibiale.
6. Separare il nervo peroneo comune e il nervo surale dai tessuti vicini utilizzando una micro pinza curva.
7. Legare i nervi peroneo e surale comuni insieme con una sutura 6-0, poiché entrambi i nervi corrono sopra il muscolo gastrocnemio, ma il nervo tibiale passa sotto il muscolo gastrocnemio (Figura 2D e Figura 3B, C). Osservare l'arto per la contrazione dopo la legatura stretta. Per il metodo tradizionale, legare separatamente i nervi peroneo comune e surale.
8. Tagliare il nervo in una parte distale entro 2-4 mm dalla legatura con un paio di micro forbici. Assicurarsi che il nervo tibiale rimanga intatto durante l'intera procedura. Per il metodo tradizionale, tagliare i nervi peroneo e surale comuni nella parte distale entro 2-4 mm dalla legatura e rimuovere una sezione di 2 mm, separatamente.
9. Chiudere lo strato muscolare con una sutura di seta 6-0 e l'incisione cutanea con clip per ferite.
10. Dopo l'intervento chirurgico, riportare i topi nella stanza degli animali fino al completo recupero dall'anestesia. Controllare quotidianamente la presenza di incisioni intatte, la normale assunzione di cibo, il consumo di acqua, le condizioni generali del corpo, i movimenti regolari e la toelettatura. Rimuovere le clip della ferita 7-14 giorni dopo l'intervento.

3. Valutazione di von Frey per la soglia meccanica

1. Acclimatare i topi per 6 giorni all'ambiente della sala prove e ai materiali di prova per eseguire la valutazione von-Frey. Posiziona i mouse in cilindri di plastica trasparente su una griglia di rete metallica rialzata per 1 ora di assuefazione. Posiziona dei fogli bianchi tra ogni cilindro per evitare qualsiasi segnale visivo da parte di ogni animale in testa.
2. Durante questo periodo, eseguire l'assuefazione ogni 2 giorni e misurare la linea di base dei monofilamenti di von Frey sotto la parte medio-plantare della zampa posteriore dopo l'ultima assuefazione.
3. Esegui la valutazione di von Frey con un tester cieco. Stimola la parte medio-plantare della zampa posteriore con i filamenti di von Frey utilizzando il paradigma up-down¹³. Applicare il filamento von Frey sulla superficie plantare perpendicolarmente con forza applicata per provocare un leggero arricciamento.
4. Verifica le risposte positive come il ritiro improvviso della zampa, il sussulto improvviso o l'improvviso leccamento delle zampe. Esercitare lo stimolo successivo a un intervallo di 5 s per evitare l'influenza dello stimolo precedente.
5. Confermare la soglia meccanica per zampa effettuando una media di 3 sessioni.
6. Sulla base della soglia di ritiro della zampa posteriore del 50% decisa dal metodo su-giù, utilizzare il metodo della risposta percentuale con filamento da 0,16 g per valutare ulteriormente la differenza.
7. Registrare la percentuale delle risposte positive dopo 10 stimoli di filamento da 0,16 g applicati alla parte medio-plantare della zampa posteriore indipendentemente dalle risposte.
8. Eseguire le valutazioni di von Frey il giorno 1 prima dell'intervento e dopo l'intervento nei giorni 1, 3, 5, 7 e 14.

4. Analisi statistica

1. Riporta i dati continui normalmente distribuiti come media ±errore standard della media (SEM). Analizza i dati continui con il t-test a 2 code o l'ANOVA a due vie a misure ripetute. Elabora tutti i dati utilizzando un software di analisi statistica, con significatività statistica a livello di p < 0,05.

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Risultati

Il confronto dei tempi di procedura tra metodi modificati e tradizionali.
Il tempo della procedura dall'inizio del taglio della pelle alla fine della chiusura della pelle è stato registrato rispettivamente in 5 topi con l'approccio modificato e in 5 topi con l'approccio tradizionale. È stato utilizzato un numero minimo di animali per ottenere risultati con significatività statistica. Rispetto al controllo dell'approccio tradizionale ^7,1...

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Discussione

Rispetto al tradizionale metodo SNIt del topo che lega separatamente il nervo peroneo comune e il nervo surale 6,7,8,9, il modello SNIt modificato presenta tre vantaggi: (1) ha meno rischi di contrarre o allungare i nervi sciatico o tibiale; (2) Non è necessario rimuovere i monconi del nervo distale dopo il taglio del nervo perché legando insieme il nervo per...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 suture	Henry Schein	9007482	Nerve ligation and close the muscular layer
Iris Scissors	Integra Miltex	12460598	Cut muscle and fascia
Mayo dissecting scissors	Fisherbrand	895120	Cut skin incision
Micro forcep	Fisherbrand	16100110	Blunt dissection biceps femoris muscle
Micro Scissors	Excelta	17467496	Cut nerve
Microdissection Forceps	Fisherbrand	16100123	Separate the common peroneal and the sural nerves from the neighboring tissues
Needle Holder	Fisherbrand	8966	Hold 6-0 needle
Prism software	Graph Pad	version 8.0	Statistical analysis software
Wound clips	Roboz Surgical	NC1878744	Close skin incision