Modifiziertes Modell der Chirurgie der Nervenverletzung bei neuropathischen Schmerzen bei Mäusen

Zusammenfassung

Die modifizierte Operation ist eine vereinfachte Methode für das Modell der Nervenverletzung von Mäusen oder Ratten, die nur eine Ligatur und einen Schnitt erfordern, um sowohl den Nervus peroneus als auch den Nervus suralis zu verletzen.

Zusammenfassung

Die verschonte Nervenverletzung (SNI) ist ein Tiermodell, das die Kardinalsymptome der peripheren Nervenschädigung nachahmt, um den molekularen und zellulären Mechanismus neuropathischer Schmerzen bei Mäusen und Ratten zu untersuchen. Derzeit gibt es zwei Arten von SNI-Modellen, eines zum Schneiden und Ligattieren des Nervus peroneus communis und des Nervus tibialis mit intaktem Nervus suralis, der in dieser Studie als SNIs definiert wird, und ein weiteres zum Schneiden und Ligatieren des Nervus peroneus communis und des Nervus suralis mit intaktem Nervus tibialis, der in dieser Studie als SNIt definiert wird. Da der Nervus suralis rein sensorisch ist, während der Nervus tibialis sowohl motorische als auch sensorische Fasern enthält, weist das SNIt-Modell ein viel geringeres motorisches Defizit auf als das SNI-Modell. Im traditionellen SNIt-Mausmodell werden der Nervus peroneus communis und der Nervus suralis getrennt durchtrennt und ligiert. Hier wird eine modifizierte SNIt-Operationsmethode beschrieben, die sowohl den Nervus peroneus communis als auch den Nervus suralis mit nur einer Ligatur und einem Schnitt mit einer kürzeren Eingriffszeit schädigt, was einfacher durchzuführen ist und das potenzielle Risiko einer Dehnung des Ischias- oder Tibianervs verringert und eine ähnliche mechanische Überempfindlichkeit wie das traditionelle SNIt-Modell hervorruft.

Einleitung

Nervenverletzungsinduzierte neuropathische Schmerzen nach Operationen oder Traumata stellen eine erhebliche wirtschaftliche Belastung dar, die die Lebensqualität beeinträchtigt. Eine Vielzahl von Modellen für Nervenverletzungen, darunter die Ligatur des Spinalnervs (SNL)¹, die chronische Verengungsverletzung (CCI)² des Ischiasnervs, die partielle Ligatur des Ischiasnervs (pSNL)³, die Ischiasnerventransaktion (SNT)⁴ und die verschonte Nervenverletzung (SNI)5,6,7,8, wurden erfolgreich entwickelt, um die Kardinalsymptome der peripheren Nervenverletzung bei Ratten und Mäusen nachzuahmen, um den molekularen und zellulären Mechanismus der Neuropathische Schmerzen 6,7,8,9,10. Jedes Operationsmodell hat jedoch seine Vorteile und Grenzen, daher sollte der Erforschung und Entwicklung der Operationsmodelle besondere Aufmerksamkeit gewidmet^{werden 10}.

Das SNI-Modell der Nagetiere führt zu einer langfristigen Überempfindlichkeit gegenüber mechanischer Stimulation. Es ist jedoch etwas verwirrend, da es zwei verschiedene SNI-Modelle gibt. Das erste SNI-Modell wurde in Woolfs Labor entwickelt, bei dem der Nervus peroneus communis und der Nervus tibialis verletzt wurden, wobei der Nervus suralis intakt blieb ^5,6. Das zweite SNI-Modell wurde in Basbaums Labor entwickelt, bei dem der Nervus peroneus communis und der Nervus suralis verletzt wurden, wobei der Nervus tibialis intakt blieb ^7,8. Das ursprüngliche Woolf-Modell wird hier als SNIs definiert, weil der Nervus suralis intakt bleibt, und das Basbaum-Modell wird hier als SNIt definiert, weil der Nervus tibialis intakt bleibt. Da der Nervus suralis rein sensorisch ist, während der Nervus tibialis sowohl motorische als auch sensorische Fasern enthält, weist das SNIt-Modell ein viel geringeres motorisches Defizit auf als das SNI-Modell. Im Gegensatz zum SNIs-Modell entwickeln Mäuse im SNIt-Modell jedoch keine thermische Überempfindlichkeit, sondern in beiden Modellen eine mechanische Überempfindlichkeit. Obwohl das SNIt-Modell ein relativ einfaches Verfahren ist, erfordert es die getrennte Ligatur des Nervus suralis und des Nervus peroneus communis, mit dem potenziellen Risiko einer Dehnung des Ischias- oder Tibianervs 6,7,8,9.

Der Nervus peroneus, der Nervus tibialis und der Nervus suralis sind drei Äste des Nervus ischias, die am oberen Rand des Musculus gastrocnemius deutlich zu erkennen sind (Abbildung 1): Der Nervus tibialis verläuft unter dem Musculus gastrocnemius, und der Nervus peroneus communis (cephaladale Seite) und der Nervus suralis (kaudale Seite) befinden sich oberhalb des Musculus gastrocnemius¹¹. Basierend auf seinen anatomischen Merkmalen wurde ein modifiziertes Maus-SNIt-Operationsverfahren entwickelt, bei dem der Nervus peroneus communis und der Nervus suralis mit nur einer Nervenligatur und einem Nervenschnitt ligiert werden, was zu einer Verkürzung der Eingriffszeit führt.

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Protokoll

Tierversuche wurden vom UCSF Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. In dieser Studie wurden adulte C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von 20-30 g verwendet. Das von Frey-Assessment wurde zwischen 13:00 und 15:00 Uhr durchgeführt.

1. Anästhesie und Vorbereitung der Maus

1. Legen Sie eine Maus in eine mit 2% Isofluran in O₂ gefüllte Kunststoffkammer bei einer Durchflussrate von 1,0 l/min, bis sie vollständig betäubt ist.
2. Decken Sie die Augen mit einer Augensalbe mit einem Watteapplikator ab.
3. Setzen Sie die Schnauze der Maus während des gesamten chirurgischen Eingriffs in einen flexiblen Nasenkegel mit 2 % Isofluran ein.
4. Platzieren Sie die Maus in einer rechten seitlichen Position. Halten Sie das linke Bein mit Kniebeugung oben und sichern Sie es mit Klebeband.
5. Entfernen Sie die Haare im Oberschenkel- und Kniebereich mit einem Elektrorasierer und einer Haarentfernungscreme. Desinfizieren Sie die Haut mit 2% Chlorhexidin und 70% Alkohol.
6. Stellen Sie vor der Operation eine ausreichende Anästhesietiefe sicher, indem Sie mit einer Pinzette standardmäßig keine Reaktion auf Einklemmreize an der Hintergliedmaße oder am Schwanz testen. Bieten Sie der Maus thermische Unterstützung.
   HINWEIS: Vor und nach der Durchführung des SNIt-Modells wurde kein Lokalanästhetikum oder NSAID verwendet, da Lokalanästhetikum und NSAID das neuropathische Schmerzverhalten nach SNIt¹² signifikant reduzieren.

2. Modifizierte SNIt-Operation

1. Schneiden Sie mit einem Skalpell einen 1 cm langen Schnitt beginnend am ersten 1/3 der horizontalen Linie, die das Knie mit einem Winkel von etwa 30° von der vertikalen Linie kreuzt (Abbildung 2A).
2. Unter dem Musculus biceps femoris (BFM) sind nach der Trennung des Hautschnitts zwei weiße Linien zu sehen, wobei die mediale (cephalad) dicke Linie als Femur und die laterale (kaudale) dünne Linie als Ischiasnerv dargestellt wird (Abbildung 2B).
3. Präparieren Sie BFM stumpf entlang der kaudalen weißen Linie mit einer gebogenen Mikrozange und einer Mikroschere, um den Ischiasnerv freizulegen. Vermeiden Sie Schäden an Blutgefäßen bei stumpfer Dissektion. Wenn es zu einer versehentlichen Beschädigung des Gefäßes kommt, verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um Blut aufzunehmen, und üben Sie den richtigen Druck aus, um die Blutung zu stoppen.
4. Unterscheiden Sie die drei Äste vom Ischiasnerv am oberen Rand des Musculus gastrocnemius. Der Nervus tibialis ist derjenige mit dem größten Durchmesser, der unter dem Musculus gastrocnemius verläuft, während der Nervus suralis (lateral, der kleinste Durchmesser) und der Nervus peroneus communus (medial) über dem Musculus gastrocnemius verlaufen (Abbildung 2C und Abbildung 3A).
5. Je nachdem, wie das BFM präpariert und eröffnet wird, stellen Sie sich den Nervus peroneus communis lateral (Abbildung 2C) oder medial (Abbildung 3A) zum Nervus tibialis vor.
6. Trennen Sie den Nervus peroneus communis und den Nervus suralis mit Hilfe einer Kurven-Mikrozange von den Nachbargeweben.
7. Lizieren Sie den Nervus peroneus communus und den Nervus suralis mit einer 6-0-Naht, da beide Nerven über dem Musculus gastrocnemius verlaufen, der Nervus tibialis jedoch unter dem Musculus gastrocnemius verläuft (Abbildung 2D und Abbildung 3B,C). Beobachten Sie, wie sich die Gliedmaße nach der engen Ligatur zusammenzieht. Bei der traditionellen Methode ligatieren Sie den Nervus peroneus communus und den Nervus suralis separat.
8. Schneiden Sie den Nerv an einem distalen Teil innerhalb von 2-4 mm um die Ligatur mit einer Mikroschere. Stellen Sie sicher, dass der Nervus tibialis während des gesamten Eingriffs unberührt bleibt. Bei der traditionellen Methode wird der Nervus peroneus communis und der Nervus suralis am distalen Teil innerhalb von 2-4 mm von der Ligatur durchtrennt und ein 2 mm großer Abschnitt separat entfernt.
9. Verschließen Sie die Muskelschicht mit einer 6-0 Seidennaht und den Hautschnitt mit Wundklammern.
10. Nach der Operation bringen Sie die Mäuse in den Tierraum zurück, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt haben. Überprüfen Sie täglich auf intakte Schnitte, normale Nahrungsaufnahme, Wasserverbrauch, allgemeinen Körperzustand, regelmäßige Bewegungen und Pflege. Entfernen Sie die Wundclips 7-14 Tage nach der Operation.

3. Von-Frey-Bewertung für mechanische Schwelle

1. Akklimatisieren Sie die Mäuse für 6 Tage an die Umgebung des Testraums und die Testmaterialien, um die von-Frey-Bewertung durchzuführen. Setzen Sie die Mäuse für 1 h Gewöhnung in durchsichtige Plastikzylinder auf ein erhöhtes Drahtgittergitter. Legen Sie weißes Papier zwischen jeden Zylinder, um visuelle Hinweise von jedem Versuchstier zu vermeiden.
2. Führen Sie während dieser Zeit alle 2 Tage eine Gewöhnung durch und messen Sie nach der letzten Gewöhnung die Grundlinie der von-Frey-Monofilamente unter dem mittleren Plantar der Hinterpfote.
3. Führen Sie die von-Frey-Bewertung mit einem Blindtester durch. Stimulieren Sie die mittlere Plantar der Hinterpfote mit von Frey-Filamenten nach dem Auf-Ab-Paradigma¹³. Tragen Sie das von-Frey-Filament senkrecht mit aufgewendeter Kraft auf die Plantaroberfläche auf, um eine leichte Kräuselung zu verursachen.
4. Überprüfen Sie positive Reaktionen wie plötzliches Zurückziehen der Pfoten, plötzliches Zucken oder plötzliches Pfotenlecken. Üben Sie den nächsten Reiz im Abstand von 5 s aus, um den Einfluss des vorherigen Reizes zu vermeiden.
5. Bestätigen Sie die mechanische Schwelle pro Pfote, indem Sie durchschnittlich 3 Sitzungen durchführen.
6. Basierend auf der Rücknahmeschwelle von 50 % der Hinterpfote, die durch die Auf-Ab-Methode festgelegt wurde, verwenden Sie die prozentuale Reaktionsmethode mit 0,16 g Filament, um die Differenz weiter zu bewerten.
7. Notieren Sie den Prozentsatz der positiven Reaktionen nach 10 Stimuli von 0,16 g Filament, die auf den mittleren Plantar der Hinterpfote aufgetragen wurden, unabhängig von den Reaktionen.
8. Führen Sie die von-Frey-Beurteilungen am Tag 1 vor der Operation und nach der Operation an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 14 durch.

4. Statistische Analyse

1. Melden Sie normalverteilte kontinuierliche Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Analysieren Sie die kontinuierlichen Daten mit einem 2-seitigen t-Test oder einer Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen. Verarbeiten Sie alle Daten mit einer statistischen Analysesoftware mit statistischer Signifikanz auf dem Niveau von p < 0,05.

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Ergebnisse

Der Vergleich der Eingriffszeit zwischen modifizierten und traditionellen Methoden.
Die Eingriffszeit vom Beginn des Schneidens der Haut bis zum Ende des Schließens der Haut wurde bei 5 Mäusen mit dem modifizierten Ansatz bzw. 5 Mäusen mit dem traditionellen Ansatz aufgezeichnet. Es wurde eine minimale Anzahl von Tieren verwendet, um Ergebnisse mit statistischer Signifikanz zu erhalten. Verglichen mit der Kontrolle des traditionellen Ansatzes

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Diskussion

Im Vergleich zur traditionellen SNIt-Methode der Maus, bei der der Nervus peroneus communis und der Nervus suralis getrennt ligiert^werden 6,7,8,9, hat das modifizierte SNIt-Modell drei Vorteile: (1) Es besteht ein geringeres Risiko, dass sich Ischias- oder Tibianerven zusammenziehen oder dehnen; (2) Es besteht keine Notwendigkeit, die distalen Nervenstümpfe na...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 suture	Henry Schein	9007482	Nerve ligation and close the muscular layer
Iris Scissors	Integra Miltex	12460598	Cut muscle and fascia
Mayo dissecting scissors	Fisherbrand	895120	Cut skin incision
Micro forcep	Fisherbrand	16100110	Blunt dissection biceps femoris muscle
Micro Scissors	Excelta	17467496	Cut nerve
Microdissection Forceps	Fisherbrand	16100123	Separate the common peroneal and the sural nerves from the neighboring tissues
Needle Holder	Fisherbrand	8966	Hold 6-0 needle
Prism software	Graph Pad	version 8.0	Statistical analysis software
Wound clips	Roboz Surgical	NC1878744	Close skin incision