研究线粒体功能障碍的 体外 方法:一种Cybrid模型

摘要

透软骨圆柱体是通过将线粒体 DNA （mtDNA） 耗尽的细胞 （rho⁰ 细胞） 与来自线粒体疾病患者的细胞形成体（去核细胞）融合而获得的杂交细胞。它们可以确定疾病的核或线粒体起源，评估生化活性，并确认mtDNA相关变异的致病作用。

摘要

进行氧化磷酸化（OXPHOS）的线粒体呼吸链复合物的缺乏是人类线粒体疾病的生化标志物。从遗传学的角度来看，OXPHOS代表了一个独特的例子，因为它是由两个不同的遗传系统互补产生的:核DNA（nDNA）和线粒体DNA（mtDNA）。因此，OXPHOS缺陷可能是由于影响核和线粒体编码基因的突变引起的。

King和Attardi于1989年发表的开创性工作表明，耗尽mtDNA（名为rho⁰）的人类细胞系可以被外源线粒体重新填充，以获得所谓的"透射粒体cybrids"。由于这些含有来自线粒体疾病（MD）患者的线粒体和来自rho⁰ 细胞的细胞核的cybrids，因此可以验证缺陷是mtDNA相关还是nDNA相关。这些cybrids也是验证突变的致病性并在生化水平上研究其影响的强大工具。本文提出了一个详细的方案，描述了cybrid的产生，选择和表征。

引言

线粒体疾病（MD）是一组多系统综合征，由核（nDNA）或线粒体（mtDNA）^{DNA 1}突变引起的线粒体功能受损引起。它们是最常见的遗传性代谢疾病之一，患病率为1:5，000。mtDNA相关疾病遵循线粒体遗传学的规则:母体遗传，异质和阈值效应以及有丝分裂^分离2。人类mtDNA是一个16.6 kb的双链DNA环，其中包含一个短的对照区，其中包含复制和转录所需的序列，13个蛋白质编码基因（呼吸链的所有亚基），22个tRNA和2个rRNA基因³。

在健康个体中，存在一个单一的mtDNA基因型（同质），而在病理条件下存在多个基因型（异质体）。有害的异质突变必须克服一个关键阈值，以破坏OXPHOS并引起可能影响任何器官的疾病^{，在任何年龄4}。OXPHOS的双重遗传学决定了遗传:常染色体隐性遗传或显性遗传，nDNA突变X连锁，母体mtDNA突变，以及nDNA和mtDNA的散发病例。

在线粒体医学时代开始时，King和Attardi⁵ 的一项具有里程碑意义的实验通过创建含有肿瘤细胞系细胞核的杂交细胞，其中mtDNA完全耗尽（rho⁰ 细胞）和来自MD患者的线粒体，为理解导致MD的突变的起源奠定了基础。 并且确定核或线粒体基因组中是否存在突变并不容易。该方法于1989年描述，然后被在线粒体医学领域的几位研究人员使用^{6，7，8，9};最近发布了¹⁰个详细的协议，但尚未制作视频。如今，当NGS可以精确而快速地识别突变的位置时，为什么这样的协议应该具有相关性？答案是，cybrid生成仍然是最先进的方案，可以了解任何新型mtDNA突变的致病作用，将异质体的百分比与疾病的严重程度相关联，并在没有患者自身核背景贡献的同质核系统中进行生化研究^11，12，13.

该协议描述了如何从在35mm培养皿中生长的融合的，患者来源的成纤维细胞中获得细胞形成体。在细胞查拉辛B存在下离心培养皿允许分离去核细胞体，然后在聚乙二醇（PEG）存在下与rho⁰ 细胞融合。然后将得到的圆孢子在选择性培养基中培养，直到克隆出现。代表性结果部分显示了所得cybrids的分子表征示例，以证明mtDNA与供体患者的成纤维细胞相同，并且nDNA与肿瘤rho⁰ 细胞系的核DNA相同。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

注意:使用人类成纤维细胞可能需要道德批准。本研究中使用的成纤维细胞来自MD患者，并按照伦理要求储存在机构生物库中。对细胞的使用提供了知情同意。在室温（RT，22-25°C）的无菌层流柜下执行所有细胞培养程序。使用适用于细胞培养和无菌设备的无菌过滤溶液。在37°C的加湿培养箱中用5%CO₂生长所有细胞系。应每周进行一次支原体检测，以确保无支原体培养。143BTK-rho⁰的细胞可以产生如前所述⁵.

1. 细胞培养

1. 在开始任何手术之前，验证MD患者成纤维细胞中是否存在突变，并通过限制性片段长度多态性（RFLP）和/或全mtDNA测序分析来量化异质或同质的百分比¹⁴。
2. 在四个35mm培养皿中培养成纤维细胞，每个培养皿含有2mL完整培养基（表1）。让细胞生长至80%汇合（48小时）。
3. 在^100mm培养皿中的8mL补充培养基（表1）中培养143BTK-rho 0细胞。
4. 将细胞保持在37°C的培养箱中，具有5%CO₂。
5. 通过测序技术检查rho⁰ 细胞中mtDNA的缺失¹⁴。

2. 成纤维细胞的摘除术

1. 通过在121°C下高压灭菌灭菌4个250 mL适合离心的瓶子灭菌20分钟。在实验室烤箱或室温下干燥。
2. 在37°C下预热离心机。
3. 使用2mL 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤含有成纤维细胞的35mm培养皿两次，不含（不含）钙和镁。
4. 用70%乙醇清洁培养皿的外表面，等到酒精蒸发。
5. 从盘子上取下盖子，从瓶子上取下螺旋盖。将每个培养皿（不带盖子）倒置在每个250 mL离心机瓶的底部。
6. 向每个瓶子中缓慢加入32mL去核培养基（表1），使培养基进入培养皿并与细胞接触。使用长玻璃巴斯德移液器去除盘子上的任何气泡，在本生火焰中弯曲尖端。
   注意:重要的是要去除气泡，让培养基进入培养皿并与细胞接触。
7. 用螺旋盖关闭每个瓶子，然后将其转移到离心机中。
8. 在37°C和8，000× g下离心20分钟，最大加速，减速慢。注意平衡离心机:配重每瓶。如有必要，通过添加合适体积的去核培养基来调整重量。
9. 在离心过程中，使用真空或10 mL血清移液管从143BTK-rho⁰培养板中吸取并丢弃培养基，并使用4 mL 1x PBS（不含钙和镁）洗涤两次。
10. 加入2mL胰蛋白酶以完全覆盖细胞单层。
11. 将培养皿置于37°C培养箱中〜2分钟。
12. 从培养箱中取出培养皿，使用倒置显微镜观察活细胞的细胞分离（物镜4x或10x），并通过加入2mL补充培养基来抑制酶活性。
13. 用10 mL移液管将培养皿中的4mL细胞悬浮液吸出，并将其转移到15mL锥形管中。
14. 使用Burker血细胞计数器室或自动计数器计数细胞。
15. 在离心结束时（步骤2.8），从瓶子中吸取培养基并将其丢弃。
16. 通过将瓶子倒置在先前喷有70%乙醇的无菌纱布上来去除培养皿。用70%乙醇清洁盘子的外表面及其盖子。等到酒精蒸发，然后关闭盘子。
17. 在继续之前，使用倒置显微镜检查细胞的细胞形成（物镜4x或10x）。寻找极细长的成纤维细胞，因为它们的细胞核被细胞Chalasin B诱导挤出。
18. 向每个35mm培养皿中，加入1×10⁶个143BTK-rho⁰细胞重悬于2mL的143BTK-rho⁰培养基中，补充5%胎牛血清（FBS）。
19. 将培养皿在37°C和5%CO₂的加湿培养箱中放置3小时，让143BTK-rho⁰细胞沉降在鬼魂上。不要打扰餐具。

3. 核化成纤维细胞与rho ⁰ 细胞融合

1. 孵育3小时后，吸出并从培养皿中丢弃培养基。
2. 用2毫升Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）高糖（不含血清）或最低必需培养基（MEM）洗涤贴壁细胞两次。
3. 吸出并丢弃培养基。
4. 向细胞中加入500μLPE溶液（参见 材料表）并孵育1分钟。
5. 吸出并丢弃PEG溶液。
6. 使用2 mL DMEM高血糖（不含血清）或MEM洗涤细胞三次。
7. 加入2mL融合培养基（表1），并在培养箱中用5%CO 2在37°C下孵_育过夜。

4. Cybrid的选择和扩展

1. 过夜孵育后，从培养箱中取出板，如上所述对细胞进行胰蛋白酶消化（步骤2.9-2.13），并将每个35mm培养皿的内容物转移到100mm培养皿中。
2. 加入8mL选择培养基（表1），并将板置于37°C的培养箱中，含5%CO₂。
3. 每2-3天更换一次培养基。
4. 等待约10-15天的选择，直到细胞集落出现。
5. 通过收集所有克隆并产生"大量"培养物作为cybrids的备份来冷冻四个培养皿中的一个，最终可以重新克隆并用于进一步研究。
6. 胰蛋白酶消化剩余的培养皿中的细胞，计数和接种到补充培养基中以50-100个细胞/培养皿中的一个或多个培养皿中（表1），直到克隆出现。让他们成长几天。
7. 通过在室温下以1，200× g 离心3分钟来沉淀剩余的细胞，并丢弃上清液。
8. 从沉淀中提取DNA（见 材料表）。
9. 通过先前报道的可变次数的串联重复（VNTR）分析进行基因分型¹⁵。
10. 使用立体显微镜从培养皿中用克隆圆柱体或移液器尖端从培养皿中拾取克隆以避免不同克隆的池化，并将其转移到96孔板中，每个孔含有200μL补充培养基（表1）。
11. 扩增每个克隆，直到有足够的细胞用于冷冻和提取DNA。
12. 通过RFLP或其他测序方法验证每个克隆的突变百分比。理想情况下，尝试获得具有野生型mtDNA（0%突变）的克隆和具有不同突变百分比的克隆，两者都加起来是同质突变mtDNA（100%突变）。有关 cybrid 生成协议的示意图，请参见 图 1 。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

产生cybrids需要3天的实验室工作加上一个选择期（约2周）和额外的1-2周用于克隆的生长。关键步骤是细胞质细胞的质量和选择期。环杂蚴的形态类似于rho⁰ 供体细胞的形态。在环杂交中分配正确的mtDNA和nDNA是确认细胞身份所必需的。 图 2 给出了一个示例。在这种情况下，我们从来自携带异质m.3243A>G的患者的成纤维细胞开始产生cybrids，这是与线粒体肌病，脑病，乳酸?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

与nDNA相比，mtDNA具有非常高的突变率，因为缺乏保护性组蛋白并且其位置靠近呼吸链，这使得分子暴露于修复系统¹⁶无法有效抵消的破坏性氧化作用。第一个致病性mtDNA突变是在1988^{年发现的17，18}，从那时起，已经描述了大量的突变。NGS技术是筛选整个线粒体基因组并轻松识别变异¹⁴的相关方法。然而，评估从未描述过...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bromo-2'-Deoxyuridine	Sigma-Aldrich (Merck)	B5002-500MG
6 well Plates	Corning	3516
96 well Plates	Corning	3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kit	QIAGEN	13323
Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25	7,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mL	Beckman Coulter	356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioidea	Sigma-Aldrich (Merck)	C2743-200UL
Dialyzed FBS	Gibco	26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)	EuroClone	ECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)	EuroClone	ECB4004L
Ethanol Absolute Anhydrous	Carlo Erba	414601
FetalClone III (Bovine Serum Product)	Cytiva - HyClone Laboratories	SH30109.03
Glass pasteur pipettes	VWR	M4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy	Nikon	ECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor	Beckman Coulter	339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770	Labotech	29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)	EuroClone	ECB 3000D
Minimum Essential Medium MEM	Euroclone	ECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution)	Sigma-Aldrich (Merck)	P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x)	EuroClone	ECB3001D
Primo TC Dishes 100 mm	EuroClone	ET2100
Primo TC Dishes 35 mm	EuroClone	ET2035
Sodium Pyruvate 100 mM	EuroClone	ECM0542D
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSS	EuroClone	ECB3051D
Uridine	Sigma-Aldrich (Merck)	U3003-5G