Un enfoque in vitro para estudiar la disfunción mitocondrial: un modelo cibrido

Resumen

Los cibridos transmitocondiales son células híbridas obtenidas mediante la fusión de células agotadas de ADN mitocondrial (ADNmt) (células rho⁰ ) con citólogos (células enucleadas) derivadas de pacientes afectados por trastornos mitocondriales. Permiten la determinación del origen nuclear o mitocondrial de la enfermedad, la evaluación de la actividad bioquímica y la confirmación del papel patogénico de las variantes relacionadas con el ADNmt.

Resumen

La deficiencia de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial que llevan a cabo la fosforilación oxidativa (OXPHOS) es el marcador bioquímico de los trastornos mitocondriales humanos. Desde un punto de vista genético, el OXPHOS representa un ejemplo único porque resulta de la complementación de dos sistemas genéticos distintos: el ADN nuclear (nDNA) y el ADN mitocondrial (ADNmt). Por lo tanto, los defectos de OXPHOS pueden deberse a mutaciones que afectan a genes codificados nucleares y mitocondriales.

El trabajo innovador de King y Attardi, publicado en 1989, mostró que las líneas celulares humanas agotadas de ADNmt (llamadas rho⁰) podrían ser repobladas por mitocondrias exógenas para obtener los llamados "cibridas transmitocondriales". Gracias a estos cibridos que contienen mitocondrias derivadas de pacientes con trastornos mitocondriales (DM) y núcleos de células rho⁰ , es posible verificar si un defecto está relacionado con el ADNmt o el ADNm. Estos cibridos también son una poderosa herramienta para validar la patogenicidad de una mutación y estudiar su impacto a nivel bioquímico. Este artículo presenta un protocolo detallado que describe la generación, selección y caracterización de cibridas.

Introducción

Los trastornos mitocondriales (DM) son un grupo de síndromes multisistémicos causados por un deterioro en las funciones mitocondriales debido a mutaciones en el ADN nuclear (nDNA) o mitocondrial (ADNmt)¹. Se encuentran entre las enfermedades metabólicas hereditarias más comunes, con una prevalencia de 1:5.000. Las enfermedades asociadas al ADNmt siguen las reglas de la genética mitocondrial: herencia materna, heteroplasmia y efecto umbral, y segregación mitótica². El ADNmt humano es un círculo de ADN de doble cadena de 16,6 kb, que contiene una región de control corta con secuencias necesarias para la replicación y trans....

Protocolo

NOTA: El uso de fibroblastos humanos puede requerir aprobación ética. Los fibroblastos utilizados en este estudio se derivaron de pacientes con MD y se almacenaron en el biobanco institucional de conformidad con los requisitos éticos. Se dio consentimiento informado para el uso de las celdas. Realizar todos los procedimientos de cultivo celular bajo un gabinete de flujo laminar estéril a temperatura ambiente (RT, 22-25 °C). Utilice soluciones filtradas estériles adecuadas para cultivo celular y equipos estériles. Cultive todas las líneas celulares en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO₂. Las pruebas de micoplasma deben realizarse semanalment....

Resultados

La generación de cibridas requiere 3 días de trabajo de laboratorio más un período de selección (~ 2 semanas) y 1-2 semanas adicionales para el crecimiento de clones. Los pasos críticos son la calidad de los citoplastos y el período de selección. La morfología de los cibridos se asemeja a la de las células donantes rho⁰. La asignación del ADNmt y el ADNn correctos en los cibridas es obligatoria para confirmar la identidad de las células. Un ejemplo se da en la Figura 2.......

Discusión

El ADNmt tiene una tasa de mutación muy alta en comparación con el ADNnm debido a la falta de histonas protectoras y su ubicación cerca de la cadena respiratoria, lo que expone a la molécula a efectos oxidativos dañinos no contrarrestados eficientemente por los sistemas de reparación¹⁶. Las primeras mutaciones patógenas del ADNmt se identificaron en ^{1988 17,18}, y desde entonces, se han descrito un gran número de mutaciones. La tecn.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bromo-2'-Deoxyuridine	Sigma-Aldrich (Merck)	B5002-500MG
6 well Plates	Corning	3516
96 well Plates	Corning	3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kit	QIAGEN	13323
Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25	7,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mL	Beckman Coulter	356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioidea	Sigma-Aldrich (Merck)	C2743-200UL
Dialyzed FBS	Gibco	26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)	EuroClone	ECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)	EuroClone	ECB4004L
Ethanol Absolute Anhydrous	Carlo Erba	414601
FetalClone III (Bovine Serum Product)	Cytiva - HyClone Laboratories	SH30109.03
Glass pasteur pipettes	VWR	M4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy	Nikon	ECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor	Beckman Coulter	339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770	Labotech	29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)	EuroClone	ECB 3000D
Minimum Essential Medium MEM	Euroclone	ECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution)	Sigma-Aldrich (Merck)	P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x)	EuroClone	ECB3001D
Primo TC Dishes 100 mm	EuroClone	ET2100
Primo TC Dishes 35 mm	EuroClone	ET2035
Sodium Pyruvate 100 mM	EuroClone	ECM0542D
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSS	EuroClone	ECB3051D
Uridine	Sigma-Aldrich (Merck)	U3003-5G