Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Транспамохондриальные цибриды представляют собой гибридные клетки, полученные путем слияния митохондриальной ДНК (мтДНК)-истощенных клеток (rho0 клеток) с цитопластами (энуклеированными клетками), полученными от пациентов, страдающих митохондриальными нарушениями. Они позволяют определить ядерное или митохондриальное происхождение заболевания, оценить биохимическую активность и подтвердить патогенетическую роль вариантов, связанных с мтДНК.

Аннотация

Дефицит комплексов митохондриальной дыхательной цепи, осуществляющих окислительное фосфорилирование (OXPHOS), является биохимическим маркером митохондриальных нарушений человека. С генетической точки зрения OXPHOS представляет собой уникальный пример, потому что он является результатом дополнения двух различных генетических систем: ядерной ДНК (нДНК) и митохондриальной ДНК (мтДНК). Таким образом, дефекты OXPHOS могут быть вызваны мутациями, влияющими на ядерные и митохондриальные кодированные гены.

Новаторская работа Кинга и Аттарди, опубликованная в 1989 году, показала, что клеточные линии человека, истощенные мтДНК (названные rho0), могут быть повторно заселены экзогенными митохондриями для получения так называемых «транспамохондриальных цибрид». Благодаря этим цибридам, содержащим митохондрии, полученные от пациентов с митохондриальными расстройствами (МД) и ядрами из клеток rho0 , можно проверить, связан ли дефект с мтДНК или нДНК. Эти цибриды также являются мощным инструментом для проверки патогенности мутации и изучения ее влияния на биохимическом уровне. В этой статье представлен подробный протокол, описывающий генерацию, отбор и характеристику цибрид.

Введение

Митохондриальные расстройства (МД) представляют собой группу мультисистемных синдромов, вызванных нарушением митохондриальных функций из-за мутаций в ядерной (нДНК) или митохондриальной (мтДНК) ДНК1. Они являются одними из наиболее распространенных наследственных метаболических заболеваний, с распространенностью 1: 5000. мтДНК-ассоциированные заболевания следуют правилам митохондриальной генетики: материнское наследование, гетероплазма и пороговый эффект, митотическая сегрегация2. МтДНК человека представляет собой двухцепочечный круг ДНК размером 16,6 кб, который содержит короткую контрольную область с последовательностями, необходимыми для репликации и транскрипции, 13 генов, кодирующих белок (все субъединицы дыхательной цепи), 22 тРНК и 2 гена рРНК3.

У здоровых людей существует один единственный генотип мтДНК (гомоплазма), тогда как в патологических состояниях сосуществует более одного генотипа (гетероплазмы). Вредные гетероплазматические мутации должны преодолеть критический порог, чтобы нарушить OXPHOS и вызвать заболевания, которые могут поразить любой орган в любом возрасте4 лет. Двойная генетика OXPHOS диктует наследование: аутосомно-рецессивная или доминантная и X-сцепленная для мутаций нДНК, материнская для мутаций мтДНК, плюс спорадические случаи как для нДНК, так и для мтДНК.

В начале эры митохондриальной медицины знаковый эксперимент Кинга и Аттарди5 установил основу для понимания происхождения мутации, ответственной за MD, путем создания гибридных клеток, содержащих ядра из опухолевых клеточных линий, в которых мтДНК была полностью истощена (rho0 клеток) и митохондрий у пациентов с MD. Методы секвенирования следующего поколения (NGS) в то время были недоступны. и было нелегко определить, присутствует ли мутация в ядерном или митохондриальном геноме. Метод, описанный в 1989 году, затем использовался несколькими исследователями, работающими в области митохондриальной медицины 6,7,8,9; подробный протокол был недавно опубликован10, но видео еще не было сделано. Почему такой протокол должен быть актуален в настоящее время, когда NGS может точно и быстро определить, где находится мутация? Ответ заключается в том, что генерация цибрид по-прежнему является современным протоколом для понимания патогенной роли любой новой мутации мтДНК, корреляции процента гетероплазмы с тяжестью заболевания и выполнения биохимического исследования в однородной ядерной системе, в которой вклад автохтонного ядерного фона пациента отсутствует11, 12,13.

Этот протокол описывает, как получить цитопласты из сливающихся фибробластов, полученных от пациента, выращенных в 35 мм чашках Петри. Центрифугирование посуды в присутствии цитохалазина В позволяет выделить энуклеированные цитопласты, которые затем сплавляются с rho0 клетками в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ). Полученные цибриды затем культивируются в селективной среде до тех пор, пока не появятся клоны. В разделе репрезентативных результатов приведен пример молекулярной характеристики полученных цибрид, чтобы доказать, что мтДНК идентична фибробластам пациентов-доноров и что нДНК идентична ядерной ДНК опухолевой клеточной линии rho0 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование фибробластов человека может потребовать этического одобрения. Фибробласты, используемые в этом исследовании, были получены от пациентов с МД и хранились в институциональном биобанке в соответствии с этическими требованиями. На использование камер было дано информированное согласие. Выполняйте все процедуры культивирования клеток под стерильным ламинарным проточным шкафом при комнатной температуре (RT, 22-25 °C). Используйте стерильно-фильтрованные растворы, подходящие для клеточных культур и стерильного оборудования. Вырастите все клеточные линии в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO2. Тесты на микоплазму следует проводить еженедельно, чтобы обеспечить культуры без микоплазмы. Клетки 143BTK-rho0 могут быть сгенерированы, как описано ранее5.

1. Культура клеток

  1. Перед началом любой процедуры проверьте наличие мутации в фибробластах, полученных от пациента (пациентов) MD, и количественно оцените процент гетероплазмы или гомоплазмы с помощью полиморфизма длины фрагмента рестрикции (RFLP) и / или анализа секвенирования всей мтДНК14.
  2. Семена фибробластов в четырех чашках Петри по 35 мм, каждая из которых содержит 2 мл полной питательной среды (таблица 1). Дайте клеткам расти до 80% слива (48 ч).
  3. Вырастите 143BTK-rho0 клеток в 8 мл дополненной питательной среды (таблица 1) в чашке Петри 100 мм.
  4. Поддерживайте клетки в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
  5. Проверьте отсутствие мтДНК в клетках rho0 методом секвенирования14.

2. Энуклеация фибробластов

  1. Стерилизуйте четыре бутылки, подходящие для центрифуги объемом 250 мл, путем автоклавной стерилизации при 121 °C в течение 20-минутного цикла. Высушите их в лабораторной печи или в РТ.
  2. Предваряют центрифугу при 37 °C.
  3. Дважды вымойте посуду толщиной 35 мм, содержащую фибробласты, используя 2 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) без (без) кальция и магния.
  4. Очистить внешнюю поверхность посуды 70% этанолом и подождать, пока спирт испарится.
  5. Снимите крышки с посуды и завинчивающиеся крышки с бутылок. Поместите каждое блюдо без крышки вверх ногами на дно каждой бутылки центрифуги объемом 250 мл.
  6. Медленно добавляйте 32 мл энуклеационной среды в каждую бутылку (таблица 1), позволяя среде войти в блюдо и войти в контакт с клетками. Удалите все пузырьки с посуды с помощью длинной стеклянной пипетки Пастера, искривив кончик в пламени Бунзена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить пузырьки, чтобы позволить среде войти в блюдо и войти в контакт с клетками.
  7. Закройте каждую бутылку винтовой крышкой и перенесите их в центрифугу.
  8. Центрифуга в течение 20 мин при 37 °C и 8 000 × g, ускорение макс., замедление медленное. Обратите внимание на балансировку центрифуги: противовес каждой бутылки. При необходимости отрегулируйте вес, добавив подходящий объем энуклеационной среды.
  9. Во время центрифугирования используйте вакуум или серологическую пипетку объемом 10 мл, чтобы аспирировать и выбросить среду из культуральных пластин 143BTK-rho0 и промыть их дважды, используя 4 мл 1x PBS без кальция и магния.
  10. Добавьте 2 мл трипсина, чтобы полностью покрыть клеточный монослой.
  11. Поместите посуду в инкубатор при температуре 37 °C на ~2 мин.
  12. Выньте чашки из инкубатора, наблюдайте за отслоением клеток с помощью перевернутого микроскопа для живых клеток (цели 4x или 10x) и ингибируйте активность фермента, добавляя 2 мл дополненной питательной среды.
  13. Аспирировать 4 мл клеточной суспензии в чашке пипеткой 10 мл и переложить ее в коническую трубку объемом 15 мл.
  14. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометрической камеры Беркера или автоматизированного счетчика.
  15. В конце центрифугирования (стадия 2.8) аспирируйте среду из бутылок и выбросьте ее.
  16. Снимите посуду, перевернув флаконы на стерильной марле, предварительно опрысканной 70% этанолом. Очистите внешнюю поверхность посуды и ее крышки 70% этанолом. Подождите, пока спирт испарится, а затем закройте посуду.
  17. Прежде чем продолжить, проверьте образование цитопласта (призрака) с помощью инвертированного микроскопа для живых клеток (объектив 4x или 10x). Ищите чрезвычайно вытянутые фибробласты из-за экструзии их ядер, индуцированных цитохалазином B.
  18. К каждой посуде размером 35 мм добавляют 1 × 106 из 143BTK-rho0 клеток, повторно суспендированных в 2 мл 143BTK-rho0 питательной среды, дополненной 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS).
  19. Оставьте посуду на 3 ч в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 и дайте клеткам 143BTK-rho0 осесть на призраках. Не потревожите посуду.

3. Слияние энуклеированных фибробластов с rho 0 клетками

  1. После 3 ч инкубации аспирировать и выбросить среду из посуды.
  2. Дважды промыть адгезивные клетки 2 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco с высоким содержанием глюкозы без сыворотки или минимальной существенной средой (MEM).
  3. Аспирировать и выбросить среду.
  4. Добавьте к клеткам 500 мкл раствора ПЭГ (см. Таблицу материалов) и инкубируйте ровно 1 мин.
  5. Аспирировать и выбросить раствор ПЭГ.
  6. Промыть клетки три раза, используя 2 мл DMEM с высоким содержанием глюкозы без сыворотки или с MEM.
  7. Добавьте 2 мл термоядерной среды (таблица 1) и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.

4. Выбор и расширение Cybrid

  1. После ночной инкубации извлекают пластины из инкубатора, трипсинизируют клетки, как описано выше (этапы 2.9-2.13), и переносят содержимое каждой 35-мм посуды в посуду диаметром 100 мм.
  2. Добавьте 8 мл селекционной среды (таблица 1) и поместите пластины в инкубатор при 37 °C с 5% CO2.
  3. Меняйте среду каждые 2-3 дня.
  4. Подождите ~10-15 дней отбора, пока не появятся колонии клеток.
  5. Заморозьте одну из четырех чашек Петри, собрав всех клонов и создав «массивную» культуру в качестве резервной копии цибрид, которая в конечном итоге может быть восстановлена и использована для дальнейших исследований.
  6. Попробуйте клетки в оставшихся чашках для культивирования, подсчитайте и посейте в одну или несколько чашек Петри по 50-100 клеток на чашку в дополненной культуральной среде (таблица 1) до появления клонов. Пусть они растут в течение нескольких дней.
  7. Гранулируют оставшиеся ячейки центрифугированием при 1,200 × г в течение 3 мин при РТ и отбрасывают супернатант.
  8. Извлеките ДНК из гранулы (см. Таблицу материалов).
  9. Выполняют генотипирование методом анализа с переменным числом тандемно повторяющихся (VNTR), как сообщалось ранее15.
  10. Возьмите клоны из чашки Петри с помощью цилиндров клонирования или наконечника пипетки, используя стереомикроскоп, чтобы избежать объединения различных клонов, и перенесите их на 96-луночную пластину, каждая скважина содержит 200 мкл дополненной питательной среды (таблица 1).
  11. Расширяйте каждый клон до тех пор, пока не будет достаточно клеток для замораживания и извлечения ДНК.
  12. Проверьте процент мутаций каждого клона с помощью RFLP или других методов секвенирования. В идеале, попробуйте получить как клоны с мтДНК дикого типа (мутация 0%), так и клоны с различным процентом мутаций, оба складываются в гомоплазматическую мутантную мтДНК (100% мутация). На рисунке 1 показана принципиальная схема протокола генерации cybrid.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Генерация цибрид требует 3 дней лабораторных работ плюс период отбора (~2 недели) и дополнительные 1-2 недели для роста клонов. Важнейшими этапами являются качество цитопластов и период отбора. Морфология цибрид напоминает морфологию донорских клеток rho0. Назначение правильной мтДН...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

МтДНК имеет очень высокую частоту мутаций по сравнению с нДНК из-за отсутствия защитных гистонов и ее расположения близко к дыхательной цепи, что подвергает молекулу повреждающим окислительным эффектам, не эффективно противодействуемым системами репарации16. Первые пато?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Это исследование было проведено в Центре изучения митохондриальных педиатрических заболеваний (http://www.mitopedia.org), финансируемом Фондом Мариани. VT является членом Европейской референс-сети по редким нервно-мышечным заболеваниям (ERN EURO-NMD).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5-Bromo-2'-DeoxyuridineSigma-Aldrich (Merck)B5002-500MG
6 well PlatesCorning3516
96 well PlatesCorning3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kitQIAGEN13323
CentrifugeBeckman CoulterAvanti J-257,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mLBeckman Coulter356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioideaSigma-Aldrich (Merck)C2743-200UL
Dialyzed FBSGibco26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)EuroCloneECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)EuroCloneECB4004L
Ethanol Absolute AnhydrousCarlo Erba414601
FetalClone III (Bovine Serum Product)Cytiva - HyClone LaboratoriesSH30109.03
Glass pasteur pipettesVWRM4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell MicroscopyNikonECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum RotorBeckman Coulter339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770Labotech29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)EuroCloneECB 3000D
Minimum Essential Medium MEMEurocloneECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection KitLonzaLT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution)Sigma-Aldrich (Merck)P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x)EuroCloneECB3001D
Primo TC Dishes 100 mmEuroCloneET2100
Primo TC Dishes 35 mmEuroCloneET2035
Sodium Pyruvate 100 mMEuroCloneECM0542D
StereomicroscopeNikonSMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSSEuroCloneECB3051D
UridineSigma-Aldrich (Merck)U3003-5G

Ссылки

  1. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
  2. DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
  3. El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  6. Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
  7. Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
  8. Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
  9. Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95(2006).
  10. Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
  11. Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
  12. Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749(2021).
  13. Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364(2021).
  14. Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
  15. Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
  16. Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061(2020).
  17. Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
  18. Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
  19. Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
  20. Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214(2018).
  21. Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
  22. Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
  23. Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
  24. Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591(2020).
  25. Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
  26. Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
  27. Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
  28. Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

181

This article has been published

Video Coming Soon