Подход in vitro к изучению митохондриальной дисфункции: модель Cybrid

Резюме

Транспамохондриальные цибриды представляют собой гибридные клетки, полученные путем слияния митохондриальной ДНК (мтДНК)-истощенных клеток (rho⁰ клеток) с цитопластами (энуклеированными клетками), полученными от пациентов, страдающих митохондриальными нарушениями. Они позволяют определить ядерное или митохондриальное происхождение заболевания, оценить биохимическую активность и подтвердить патогенетическую роль вариантов, связанных с мтДНК.

Аннотация

Дефицит комплексов митохондриальной дыхательной цепи, осуществляющих окислительное фосфорилирование (OXPHOS), является биохимическим маркером митохондриальных нарушений человека. С генетической точки зрения OXPHOS представляет собой уникальный пример, потому что он является результатом дополнения двух различных генетических систем: ядерной ДНК (нДНК) и митохондриальной ДНК (мтДНК). Таким образом, дефекты OXPHOS могут быть вызваны мутациями, влияющими на ядерные и митохондриальные кодированные гены.

Новаторская работа Кинга и Аттарди, опубликованная в 1989 году, показала, что клеточные линии человека, истощенные мтДНК (названные rho⁰), могут быть повторно заселены экзогенными митохондриями для получения так называемых «транспамохондриальных цибрид». Благодаря этим цибридам, содержащим митохондрии, полученные от пациентов с митохондриальными расстройствами (МД) и ядрами из клеток rho⁰ , можно проверить, связан ли дефект с мтДНК или нДНК. Эти цибриды также являются мощным инструментом для проверки патогенности мутации и изучения ее влияния на биохимическом уровне. В этой статье представлен подробный протокол, описывающий генерацию, отбор и характеристику цибрид.

Введение

Митохондриальные расстройства (МД) представляют собой группу мультисистемных синдромов, вызванных нарушением митохондриальных функций из-за мутаций в ядерной (нДНК) или митохондриальной (мтДНК) ДНК¹. Они являются одними из наиболее распространенных наследственных метаболических заболеваний, с распространенностью 1: 5000. мтДНК-ассоциированные заболевания следуют правилам митохондриальной генетики: материнское наследование, гетероплазма и пороговый эффект, митотическая сегрегация². МтДНК человека представляет собой двухцепочечный круг ДНК размером 16,6 кб, который содержит короткую контрольную область с последовательностя....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование фибробластов человека может потребовать этического одобрения. Фибробласты, используемые в этом исследовании, были получены от пациентов с МД и хранились в институциональном биобанке в соответствии с этическими требованиями. На использование камер было дано информированное согласие. Выполняйте все процедуры культивирования клеток под стерильным ламинарным проточным шкафом при комнатной температуре (RT, 22-25 °C). Используйте стерильно-фильтрованные растворы, подходящие для клеточных культур и стерильного оборудования. Вырастите все клеточные линии в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO₂. Тесты на микоплазму следует проводить еже....

Результаты

Генерация цибрид требует 3 дней лабораторных работ плюс период отбора (~2 недели) и дополнительные 1-2 недели для роста клонов. Важнейшими этапами являются качество цитопластов и период отбора. Морфология цибрид напоминает морфологию донорских клеток rho⁰. Назначение правильной мтДН.......

Обсуждение

МтДНК имеет очень высокую частоту мутаций по сравнению с нДНК из-за отсутствия защитных гистонов и ее расположения близко к дыхательной цепи, что подвергает молекулу повреждающим окислительным эффектам, не эффективно противодействуемым системами репарации¹⁶. Первые пато?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bromo-2'-Deoxyuridine	Sigma-Aldrich (Merck)	B5002-500MG
6 well Plates	Corning	3516
96 well Plates	Corning	3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kit	QIAGEN	13323
Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25	7,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mL	Beckman Coulter	356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioidea	Sigma-Aldrich (Merck)	C2743-200UL
Dialyzed FBS	Gibco	26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)	EuroClone	ECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)	EuroClone	ECB4004L
Ethanol Absolute Anhydrous	Carlo Erba	414601
FetalClone III (Bovine Serum Product)	Cytiva - HyClone Laboratories	SH30109.03
Glass pasteur pipettes	VWR	M4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy	Nikon	ECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor	Beckman Coulter	339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770	Labotech	29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)	EuroClone	ECB 3000D
Minimum Essential Medium MEM	Euroclone	ECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution)	Sigma-Aldrich (Merck)	P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x)	EuroClone	ECB3001D
Primo TC Dishes 100 mm	EuroClone	ET2100
Primo TC Dishes 35 mm	EuroClone	ET2035
Sodium Pyruvate 100 mM	EuroClone	ECM0542D
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSS	EuroClone	ECB3051D
Uridine	Sigma-Aldrich (Merck)	U3003-5G