Ein In-vitro-Ansatz zur Untersuchung der mitochondrialen Dysfunktion: Ein Cybrid-Modell

Zusammenfassung

Transmitochondriale Cybride sind Hybridzellen, die durch Verschmelzung von mitochondrialen DNA (mtDNA)-deplementierten Zellen (rho^0-Zellen ) mit Zytoplasten (enukleierten Zellen) von Patienten mit mitochondrialen Störungen erhalten werden. Sie ermöglichen die Bestimmung des nuklearen oder mitochondrialen Ursprungs der Krankheit, die Bewertung der biochemischen Aktivität und die Bestätigung der pathogenetischen Rolle von mtDNA-bezogenen Varianten.

Zusammenfassung

Der Mangel an den mitochondrialen Atmungskettenkomplexen, die eine oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) durchführen, ist der biochemische Marker für mitochondriale Erkrankungen beim Menschen. Aus genetischer Sicht stellt der OXPHOS ein einzigartiges Beispiel dar, da er aus der Komplementarität zweier unterschiedlicher genetischer Systeme resultiert: Kern-DNA (nDNA) und mitochondrialer DNA (mtDNA). Daher können OXPHOS-Defekte auf Mutationen zurückzuführen sein, die nukleäre und mitochondriale kodierte Gene betreffen.

Die bahnbrechende Arbeit von King und Attardi, die 1989 veröffentlicht wurde, zeigte, dass menschliche Zelllinien, die von mtDNA (genannt Rho⁰) erschöpft waren, von exogenen Mitochondrien wieder besiedelt werden konnten, um die sogenannten "transmitochondrialen Cybrids" zu erhalten. Dank dieser Cybriden, die Mitochondrien enthalten, die von Patienten mit mitochondrialen Störungen (MDs) und Kernen aus^Rho-0-Zellen stammen, kann überprüft werden, ob ein Defekt mtDNA- oder nDNA-bezogen ist. Diese Cybriden sind auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Pathogenität einer Mutation zu validieren und ihre Auswirkungen auf biochemischer Ebene zu untersuchen. Dieses Dokument enthält ein detailliertes Protokoll, das die Generierung, Auswahl und Charakterisierung von Cybrid beschreibt.

Einleitung

Mitochondriale Störungen (MDs) sind eine Gruppe von Multisystemsyndromen, die durch eine Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktionen aufgrund von Mutationen entweder in der Kern- (nDNA) oder der mitochondrialen (mtDNA) DNA^{1 verursacht werden}. Sie gehören mit einer Prävalenz von 1:5.000 zu den häufigsten vererbten Stoffwechselerkrankungen. mtDNA-assoziierte Erkrankungen folgen den Regeln der mitochondrialen Genetik: mütterliche Vererbung, Heteroplasmie und Schwelleneffekt sowie mitotische Segregation². Human mtDNA ist ein doppelsträngiger DNA-Kreis von 16,6 kb, der eine kurze Kontrollregion mit Sequenzen enthält, die für die Replikation und Transkription benötigt werden, 13 proteinkodierende Gene (alle Untereinheiten der Atmungskette), 22 tRNA und 2 rRNA-Gene³.

Bei gesunden Personen gibt es einen einzigen mtDNA-Genotyp (Homoplasmatik), während mehr als ein Genotyp unter pathologischen Zuständen koexistiert (Heteroplasmie). Schädliche heteroplasmatische Mutationen müssen eine kritische Schwelle überwinden, um OXPHOS zu stören und Krankheiten zu verursachen, die jedes Organ in jedem Alter^{betreffen können 4}. Die duale Genetik von OXPHOS diktiert die Vererbung: autosomal-rezessiv oder dominant und X-chromosomal für nDNA-Mutationen, mütterlich für mtDNA-Mutationen sowie sporadische Fälle sowohl für nDNA als auch für mtDNA.

Zu Beginn der Ära der mitochondrialen Medizin schuf ein bahnbrechendes Experiment von King und Attardi⁵ die Grundlage, um den Ursprung einer Mutation zu verstehen, die für einen MD verantwortlich ist, indem Hybridzellen geschaffen wurden, die Kerne aus Tumorzelllinien enthielten, in denen mtDNA vollständig erschöpft war (rho 0-Zellen) und Mitochondrien von Patienten mit MDs. Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) waren zu diesem Zeitpunkt noch nicht verfügbar. Und es war nicht einfach festzustellen, ob eine Mutation im nuklearen oder mitochondrialen Genom vorhanden war. Die 1989 beschriebene Methode wurde dann von mehreren Forschern verwendet, die auf dem Gebiet der mitochondrialen Medizin ^arbeiteten 6,7,8,9; Ein detailliertes Protokoll wurde kürzlich^{veröffentlicht 10}, aber es wurde noch kein Video gemacht. Warum sollte ein solches Protokoll heutzutage relevant sein, wenn NGS genau und schnell identifizieren könnte, wo sich eine Mutation befindet? Die Antwort ist, dass die Cybrid-Erzeugung immer noch das State-of-the-Art-Protokoll ist, um die pathogene Rolle jeder neuartigen mtDNA-Mutation zu verstehen, den Prozentsatz der Heteroplasmie mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren und eine biochemische Untersuchung in einem homogenen Kernsystem durchzuführen, in dem der Beitrag des autochthonen nuklearen Hintergrunds des Patienten fehlt^{11, 12,13}

Dieses Protokoll beschreibt, wie man Zytoplasten aus konfluierenden, von Patienten abgeleiteten Fibroblasten erhält, die in 35-mm-Petrischalen gezüchtet werden. Die Zentrifugation der Schalen in Gegenwart von Cytochalasin B ermöglicht die Isolierung von enukleierten Zytoplasten, die dann in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG^{) mit Rho-0-Zellen} verschmolzen werden. Die resultierenden Cybriden werden dann in selektivem Medium kultiviert, bis Klone entstehen. Der Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" zeigt ein Beispiel für die molekulare Charakterisierung der resultierenden Cybrids, um zu beweisen, dass die mtDNA mit der der Fibroblasten der Spenderpatienten identisch ist und dass die nDNA mit der Kern-DNA der tumoralen^{Rho-0-Zelllinie} identisch ist.

Protokoll

HINWEIS: Die Verwendung menschlicher Fibroblasten kann eine ethische Genehmigung erfordern. Die in dieser Studie verwendeten Fibroblasten wurden von MD-Patienten abgeleitet und in der institutionellen Biobank in Übereinstimmung mit ethischen Anforderungen gespeichert. Für die Nutzung der Zellen wurde eine Einwilligung nach Aufklärung erteilt. Führen Sie alle Zellkulturverfahren unter einem sterilen Laminar-Flow-Schrank bei Raumtemperatur (RT, 22-25 °C) durch. Verwenden Sie steril gefilterte Lösungen, die für Zellkultur- und Sterilanlagen geeignet sind. Züchten Sie alle Zelllinien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO₂. Mykoplasmentests sollten wöchentlich durchgeführt werden, um mykoplasmenfreie Kulturen zu gewährleisten. 143BTK^- rho⁰ Zellen können wie zuvor beschrieben^{erzeugt werden 5}.

1. Kultur von Zellen

1. Bevor Sie mit einem Verfahren beginnen, überprüfen Sie das Vorhandensein der Mutation in Fibroblasten, die von MD-Patienten abgeleitet wurden, und quantifizieren Sie den Prozentsatz der Heteroplasmie oder Homoplasmie durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) und / oder ganze mtDNA-Sequenzierungsanalysen¹⁴.
2. Samenfibroblasten in vier 35-mm-Petrischalen mit jeweils 2 ml Complete Culture Medium (Tabelle 1). Lassen Sie die Zellen wachsen, bis 80% konfluent (48 h).
3. Züchten Sie^143BTK- rho 0 Zellen in 8 ml Supplementiertem Kulturmedium (Tabelle 1) in einer 100 mm Petrischale.
4. Die Zellen werden in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO₂ gehalten.
5. Überprüfen Sie das Fehlen von mtDNA in rho^0-Zellen durch Sequenzierungstechniken¹⁴.

2. Enukleation von Fibroblasten

1. Sterilisieren Sie vier zentrifugentaugliche 250-ml-Flaschen durch Autoklav-Sterilisation bei 121 °C für einen 20-minütigen Zyklus. Trocknen Sie sie im Laborofen oder bei RT.
2. Die Zentrifuge bei 37 °C vorwärmen.
3. Waschen Sie das 35-mm-Geschirr, das die Fibroblasten enthält, zweimal mit 2 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne (ohne Kalzium und Magnesium).
4. Reinigen Sie die Außenfläche des Geschirrs mit 70% Ethanol und warten Sie, bis der Alkohol verdunstet.
5. Entfernen Sie die Deckel vom Geschirr und die Schraubverschlüsse von den Flaschen. Stellen Sie jedes Gericht ohne Deckel kopfüber auf den Boden jeder 250 ml Zentrifugenflasche.
6. Geben Sie langsam 32 ml Enukleationsmedium in jede Flasche (Tabelle 1), so dass das Medium in die Schale eindringen und mit den Zellen in Kontakt kommen kann. Entfernen Sie alle Blasen aus dem Geschirr mit einer langen Pasteur-Pipette aus Glas und krümmen Sie die Spitze in einer Bunsenflamme.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Blasen zu entfernen, damit das Medium in die Schale eindringen und mit den Zellen in Kontakt kommen kann.
7. Verschließen Sie jede Flasche mit dem Schraubverschluss und geben Sie sie in die Zentrifuge.
8. Zentrifuge für 20 min bei 37 °C und 8.000 × g, Max. Beschleunigung, Verzögerung langsam. Achten Sie darauf, die Zentrifuge auszugleichen: Gegengewicht jeder Flasche. Falls erforderlich, passen Sie das Gewicht an, indem Sie ein geeignetes Volumen Enukleationsmedium hinzufügen.
9. Verwenden Sie während der Zentrifugation Vakuum oder eine serologische 10-ml-Pipette, um das Medium aus den 143BTK-rho ^{0-Kulturplatten} abzusaugen und zu entsorgen und sie zweimal mit 4 ml 1x PBS ohne Kalzium und Magnesium zu waschen.
10. Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu, um die Zell-Monoschicht vollständig abzudecken.
11. Das Geschirr für ~2 min in einen 37 °C Inkubator geben.
12. Entfernen Sie die Schalen aus dem Inkubator, beobachten Sie die Zellablösung mit einem inversen Mikroskop für lebende Zellen (Ziele 4x oder 10x) und hemmen Sie die Enzymaktivität durch Zugabe von 2 ml Supplementiertem Kulturmedium.
13. Die 4 ml der Zellsuspension in der Schale mit einer 10 ml Pipette absaugen und in ein 15 mL konisches Rohr geben.
14. Zählen Sie die Zellen mit einer Burker Hämozytometerkammer oder einem automatisierten Zähler.
15. Am Ende der Zentrifugation (Schritt 2.8) wird das Medium aus den Flaschen abgesaugt und entsorgt.
16. Entfernen Sie das Geschirr, indem Sie die Flaschen auf einer sterilen Gaze umdrehen, die zuvor mit 70% Ethanol besprüht wurde. Reinigen Sie die äußere Oberfläche des Geschirrs und seiner Deckel mit 70% Ethanol. Warten Sie, bis der Alkohol verdunstet ist, und schließen Sie dann das Geschirr.
17. Bevor Sie fortfahren, überprüfen Sie die Cytoplast (Geister-) Bildung mit einem inversen Mikroskop für lebende Zellen (Ziel 4x oder 10x). Suchen Sie nach extrem länglichen Fibroblasten aufgrund der Extrusion ihrer Kerne, die durch Cytochalasin B induziert werden.
18. Zu jeder 35-mm-Schale fügen Sie 1 × 10 6 von 143BTK- rho 0-Zellen hinzu, die in 2 ml 143BTK^- rho ^{0-Kulturmedium} resuspendiert sind, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS).
19. Das Geschirr 3 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂ stehen lassen und die 143BTK^{- rho 0} Zellen auf den Geistern absetzen lassen. Stören Sie das Geschirr nicht.

3. Fusion der enukleierten Fibroblasten mit ^Rho-0-Zellen

1. Nach 3 Stunden Inkubation das Medium absaugen und aus dem Geschirr entsorgen.
2. Waschen Sie die adhärenten Zellen zweimal mit 2 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit hoher Glukose ohne Serum oder mit Minimum Essential Medium (MEM).
3. Saugen Sie das Medium ab und verwerfen Sie es.
4. Geben Sie 500 μL PEG-Lösung (siehe Materialtabelle) in die Zellen und inkubieren Sie für genau 1 min.
5. Saugen Sie die PEG-Lösung an, und verwerfen Sie sie.
6. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 2 ml DMEM-hoher Glukose ohne Serum oder mit MEM.
7. 2 ml Fusionsmedium zugeben (Tabelle 1) und über Nacht im Inkubator bei 37 °C mit 5% CO₂ inkubieren.

4. Cybrid-Auswahl und -Erweiterung

1. Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht die Platten aus dem Inkubator, trypsinisieren Sie die Zellen wie oben beschrieben (Schritte 2.9-2.13) und übertragen Sie den Inhalt jeder 35-mm-Schale in eine 100-mm-Schale.
2. 8 ml Auswahlmedium hinzufügen (Tabelle 1) und die Platten bei 37 °C mit 5 % CO₂ in den Inkubator stellen.
3. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
4. Warten Sie ~ 10-15 Tage der Selektion, bis Kolonien von Zellen erscheinen.
5. Frieren Sie eine der vier Petrischalen ein, indem Sie alle Klone sammeln und eine "massive" Kultur als Backup der Cybriden erzeugen, die schließlich neu geklont und für weitere Untersuchungen verwendet werden kann.
6. Trypsinisieren Sie die Zellen in den verbleibenden Kulturschalen, zählen und säen Sie sie in eine oder mehrere Petrischalen bei 50-100 Zellen / Schale im ergänzten Kulturmedium (Tabelle 1), bis Klone erscheinen. Lassen Sie sie für einige Tage wachsen.
7. Pelletieren Sie die verbleibenden Zellen durch Zentrifugation bei 1.200 × g für 3 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand.
8. Extrahieren Sie DNA aus dem Pellet (siehe Materialtabelle).
9. Führen Sie eine Genotypisierung nach variabler Anzahl der parallel wiederholten (VNTR) Analysen durch, wie zuvor berichtet¹⁵.
10. Nehmen Sie Klone aus der Petrischale mit Klonierungszylindern oder einer Pipettenspitze auf, indem Sie ein Stereomikroskop verwenden, um das Pooling verschiedener Klone zu vermeiden, und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-Platte, die jeweils 200 μL ergänztes Kulturmedium enthält (Tabelle 1).
11. Erweitern Sie jeden Klon, bis genügend Zellen zum Einfrieren und Extrahieren von DNA vorhanden sind.
12. Überprüfen Sie den Mutationsprozentsatz jedes Klons durch RFLP oder andere Sequenzierungsmethoden. Versuchen Sie idealerweise, sowohl Klone mit Wildtyp-mtDNA (0% Mutation) als auch Klone mit unterschiedlichen Mutationsprozentsätzen zu erhalten, die sich beide zu homoplasmatischer mutierter mtDNA (100% Mutation) addieren. In Abbildung 1 finden Sie ein schematisches Diagramm des Cybrid-Generierungsprotokolls.

Ergebnisse

Die Erzeugung von Cybriden erfordert 3 Tage Laborarbeit plus eine Selektionszeit (~ 2 Wochen) und zusätzliche 1-2 Wochen für das Wachstum von Klonen. Die kritischen Schritte sind die Qualität der Zytoplasten und der Selektionszeitraum. Die Morphologie der Cybriden ähnelt der der^{rho-0-Spenderzellen}. Die Zuordnung der korrekten mtDNA und nDNA in den Cybriden ist zwingend erforderlich, um die Identität der Zellen zu bestätigen. Ein Beispiel ist in Abbildung 2 dargestellt. In di...

Diskussion

Die mtDNA hat eine sehr hohe Mutationsrate im Vergleich zu nDNA aufgrund des Mangels an schützenden Histonen und ihrer Lage in der Nähe der Atmungskette, die das Molekül schädlichen oxidativen Effekten aussetzt, denen die Reparatursysteme nicht wirksam entgegenwirken¹⁶. Die ersten pathogenen mtDNA-Mutationen wurden^{1988 identifiziert 17,18,} und seitdem wurde eine große Anzahl von Mutationen beschrieben. Die NGS-Technologie ist ein rele...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bromo-2'-Deoxyuridine	Sigma-Aldrich (Merck)	B5002-500MG
6 well Plates	Corning	3516
96 well Plates	Corning	3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kit	QIAGEN	13323
Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25	7,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mL	Beckman Coulter	356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioidea	Sigma-Aldrich (Merck)	C2743-200UL
Dialyzed FBS	Gibco	26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)	EuroClone	ECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)	EuroClone	ECB4004L
Ethanol Absolute Anhydrous	Carlo Erba	414601
FetalClone III (Bovine Serum Product)	Cytiva - HyClone Laboratories	SH30109.03
Glass pasteur pipettes	VWR	M4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy	Nikon	ECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor	Beckman Coulter	339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770	Labotech	29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)	EuroClone	ECB 3000D
Minimum Essential Medium MEM	Euroclone	ECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution)	Sigma-Aldrich (Merck)	P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x)	EuroClone	ECB3001D
Primo TC Dishes 100 mm	EuroClone	ET2100
Primo TC Dishes 35 mm	EuroClone	ET2035
Sodium Pyruvate 100 mM	EuroClone	ECM0542D
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSS	EuroClone	ECB3051D
Uridine	Sigma-Aldrich (Merck)	U3003-5G