小鼠外伤性周围神经损伤

摘要

本方案描述了创伤性周围神经损伤 （TPNI），包括精确校准的挤压、严格对齐和错位的撕裂伤，以及小鼠坐骨神经的移植和非移植间隙。定制设计的传感器用于测量神经创伤，使用常用工具诱导，以确保 TPNI 后结果的可重复性。

摘要

创伤性周围神经损伤 （TPNI） 是骨科创伤后发病的常见原因。长期以来，损伤神经和去神经支配肌肉的可重复和精确的方法一直是肌肉骨骼研究的目标。许多创伤性损伤的肢体都有神经创伤，这决定了患者的长期预后。几年来，已经开发出产生显微外科神经损伤的精确方法，包括挤压、撕裂和神经间隙移植，允许进行可重复的结果评估。此外，为校准的挤压伤创建了新的方法，这些方法与用于评估人类患者的结果提供了临床相关的相关性。确保神经损伤低变异性的最小作原则允许在这些模型中添加更多相关的组织损伤。这包括直接肌肉挤压和肢体损伤的其他组成部分。最后，萎缩评估和行为结果的精确分析使这些方法成为研究肌肉骨骼创伤的完整包，它真实地结合了人类创伤性肢体损伤的所有要素。

引言

创伤性周围神经损伤 （TPNI） 是骨科创伤后发病的常见原因 ^1,2,3。每年，大约 3% 的创伤患者遭受神经损伤 ^1,4，发生率为 3,50,000 例⁵，导致 50,000 次手术修复⁶。TPNI 的严重程度范围很广，功能恢复直接取决于这些损伤的类型和严重程度 ^7,8,9。较轻的创伤（例如，轻度挤压、不完全撕裂伤等）将首先损伤髓鞘和轴突，而更严重的力量（例如，严重挤压、完全撕裂等）会破坏结缔神经组织;例如，除了髓鞘和轴突外，还有神经内膜、神经束膜和神经外膜 ^1,10。TPNI 患者希望神经功能最终会恢复，肌肉萎缩会逆转。尽管治疗程序取得了进步，但数十年的研究没有提供精确的治疗方法来增强或确保完全康复^11,12。

如果不进行手术修复，神经横断不会愈合，这通常是在显微镜下进行的。维修通常是端到端进行的，努力确保维修现场没有张力。神经移植用于确保修复无张力^13,14。尽管这些修复使用了看似先进的方法，但功能恢复通常并不令人印象深刻^11,12。康复往往不完整且不令人满意。最佳功能恢复需要再生轴突穿过损伤部位（神经桥）并支配靶器官。这些过程因轴突方向错误或生长迟缓而复杂化，导致肌肉萎缩并最终无法恢复 15,16,17,18。已经表明，神经修复后的功能结果（例如，端到端缝合、异种移植等）取决于束并置的准确性^19,20。因此，横断神经残端及其束的适当方向性在神经修复中至关重要，没有它，即使具有最佳的轴突再生，功能恢复也会很差。显微外科缝合修复本身就是一个创伤性的过程，在大幅改善结果的新方法方面几乎没有进展。该领域缺乏可重复的神经横断动物模型，这导致可预测的差距，从而可以在功能和组织水平上进行可靠的恢复测量。如果可用，这些方法将允许表征神经再生，而不会出现神经血管化可变变化和去神经支配后萎缩的问题^21,22。许多小组努力使用更好的模型来限制这种可变性。一种方法是确保神经修复得到最小程度的纵，并且神经残端完全对立。

这最好通过使用一种称为逐步切割和纤维蛋白胶 （STG） 的标准化周围神经横断技术来实现。该 STG 模型中的修复用纤维蛋白胶固定，间隙距离标准化并最小化^21,22。纤维蛋白胶本身也被用于人类进行这些修复，可能出于相同的原因，以及它对修复后疤痕形成的有益影响^23,24。目前方法的关键是神经修复在撕裂伤完成之前开始，确保固定的损伤模式。目前的这种方法与金标准神经外缝合的神经横断特征性病理生理学具有密切的共性，并且未观察到纤维蛋白胶对神经再生的负面影响。与通过缝合进行的早期神经再生相比，用纤维蛋白胶修复小鼠坐骨神经横断面可改善轴突的伸长，这些发现与 STG 一致。STG 还受益于最小作原理，其中缝合定位从不接触神经²¹。这有效地标准化了模型中与修复相关的神经创伤。类似的原理被用于通过在胶合之前翻转神经来研究错位²²。这允许直接比较神经损伤，其中几乎相同数量的作导致对齐差异，而不会增加间隙或创伤。这促进了对准对神经损伤诱导的神经血管变化^21,22 、肌肉萎缩^21,22 和功能恢复^21,22 的影响的直接检查。目前的调查是允许有目的地和精确地研究错位的神经残端的全部内容。

TPNI 中的大多数神经没有被切断，没有间隙或缺陷，并且似乎能够恢复，但在许多情况下，肢体因神经损伤和混淆干预而永久功能障碍。实验性 TPNI 通常使用锁定针驱动器 （ND）、镊子或类似设备对啮齿动物坐骨神经挤压伤 （SNCI） 进行，并由经验丰富的外科医生进行精确且可重复的挤压伤 25,26,27,28,29,30.SNCI 动物模型依靠先天作员的精度来限制压力变化，但这从未被明确测量过。这导致动物和研究之间存在差异，没有关于标准化压力的明确指导。因此，可以预期，精确交付和报告具有各种已知强度的连贯、准确系列伤害的能力可能会使 TPNI 领域受益。一个完美的模型可以由任何实验室或研究人员为每只动物提供已知神经损伤严重程度的 SNCI，以实现真实的研究间和设备可重复性。为了解决这一缺陷，构建了一个独特的校准数字设备，其中包含一个力敏电阻器 （FSR），能够熟练地报告施加到神经上的压力（实时）。然后测试了该装置由各种类型的镊子和 ND 施加的各种挤压伤压力的可复制性³¹。

最后，开发了一种特定的方法来解决³² 号神经的间隙。文献中的神经间隙是通过切除神经切片然后将其修复回缺损来诱导的 13,33,34。这种外科手术所需的作通常与缝合相结合，并且神经残端以不同的方式回缩 21,32,34。这是基于这样一个推理，即使用同基因超大神经移植物，神经残端回缩永远不会成为问题³²。该方法需要同时对两只或三只动物进行手术，将 7 mm 的移植物放入另一只动物诱导的 5 mm 缺损中。然后，如果需要，使用第二只动物的缺损大小来移植另一只动物的更小缺损。这导致了一种全面的同步手术方法，以移植总是大于神经缺损的供体神经的缺损，以确保无张力修复。与最小作的要求相结合，这提供了一种途径，可以直接在同基因动物中研究嫁接长度，而没有文献中普遍存在的不对称移植物间隙 20,32,34。

研究方案

实验设计和动物方案得到了宾夕法尼亚州立大学医学院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。这些研究使用成年 C57BL/6J 雄性小鼠，10 周龄，体重 20-25 g。动物在无菌动物管理条件下被安置在动物设施中，并在进行研究前至少 5 天适应环境。

1. 动物准备

1. 通过使用 26 G 针头 腹膜内 注射，使用氯胺酮 （100 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （10 mg/kg） 的混合物对动物进行深度麻醉。
2. 使用修剪器剃掉动物的右后肢和下背部，然后使用无菌棉签涂抹器用含 10% 聚维酮碘溶液的酒精清洁（参见 材料表）。
3. 使用无菌棉签涂抹器将眼用润滑软膏涂抹在眼睛上，以避免眼睛干燥。
4. 准备后，将动物放在恒温加热垫上（参见 材料表）以将体温保持在 37 °C。
5. 将小鼠的后肢贴在加热垫上，并小心地对称放置它们，使膝关节与身体成直角。
6. 通过高压灭菌对所有手术工具进行消毒，然后将它们放在无菌垫上。
   注意：外科医生在进行手术前必须佩戴无菌口罩、长袍和手套。

2. 创伤性周围神经损伤 （TPNI） 模型生成

1. 准备好后，使用剪刀和精密立体变焦双目显微镜沿股骨长度做一个横向皮肤切口（~2 cm）（见 材料表）。
2. 使用解剖剪刀和显微外科镊子通过髂胫束钝性暴露坐骨神经 （SN）。避免对 SN 造成任何医源性机械损伤。
3. TPNI 手术后用手术缝合钉闭合皮肤（步骤 4-9）。作为镇痛药，皮下给予所有动物缓释丁丙诺啡 （0.05 mg/kg）（见 材料表）。
4. 按照以下步骤执行坐骨神经挤压伤 （SNCI）。
   1. 将 SN 放置在镊子尖端之间的扁平形状中，靠近三分叉约 3 毫米（图 1A）。
      注意：需要格外小心以避免畸形的位置，这会导致动物/组之间的实验结果发生变化。
   2. 使用校准的镊子和定制的铝制夹具（图 1C）^31,35 执行 SNCI，以在固定宽度 （3.5 mm） 上产生特定压力。
      注意：我们之前发布的报告^31,35 中提到了使用校准镊子和定制镗夹具的 SNCI 数字压力传感器装置的详细信息。定制夹具是通过在小块铝上钻孔制成的。这些夹具使用数字压力传感器确认可产生特定压力，使用公开可用的零件和规格，如前所述^31,35。
   3. 定位后，轻轻推动夹具以到达镊子上的阻滞，30 秒后，慢慢松开夹具并通过神经结构的改变确认损伤（图 1B）。
      注意：神经的结构改变证实了损伤的严重程度。这可以在试验病例中使用显微镜进行验证。
   4. SNCI 后，小心地将神经埋在肌肉之间，以避免外科医生造成医源性损伤。
      注意：校准镊子造成的挤压伤是准确、可靠且可重复的，这是使用精密捏压传感器装置³¹ 建立的（图 1D）。用镊子的不同夹具实时挤压伤压力的时间过程如图 2A、B 所示。
5. 执行横断面和胶水 （TG）。
   1. 使用解剖剪刀将 SN 完全横切到 SN 三分叉近端 ~3 毫米。
   2. 横断后，通过在横断部位周围涂抹 10 μL 纤维蛋白胶（参见 材料表）立即修复神经间隙，以限制切断神经末梢的进一步移位。纤维蛋白胶的凝固时间为 ~15 秒。
      注：由于回缩，横断后 SN 间隙不受控制且随意，这可能是结果的一个变量。
6. 执行 Stepwise Transection and Glue （STG）。
   1. 使用解剖剪刀将 SN 不完全（其宽度的 80%）在 SN 三分叉近端 ~3 mm 处横切，以防止形成间隙。
   2. 接下来，在切割部位周围涂抹 10 μL 纤维蛋白胶，并在胶水完全凝固（~10 秒）之前完全横切剩余 20% 的神经。
      注意：这种方法有效地减少了由切割神经末端的弹性回缩引起的间隙形成，但与 TG 模型不同，它也无需对神经进行额外的手术作（图 3A）。
7. Perform Flip and Transection with Glue （FTG） 执行翻转和横断面 （Flip and Transection with Glue （FTG）。
   1. 首先，从每侧将 SN 横切至其宽度的 40%（图 3B）。
   2. 横向翻转远端残端，在横断部位周围涂抹 10 μL 纤维蛋白胶。
   3. 接下来，在纤维蛋白胶完全凝固 （~10 s） 之前完全横切中枢 20% 神经。
   4. 在直接显微镜下确认完整的横断面。
8. 按照以下步骤进行神经间隙和移植。
   1. 在分级神经间隙和移植模型中，在 1 组实验中使用成对的小鼠串联进行级联同基因神经移植³² 。
   2. 在小鼠（比如小鼠 #1）中，在右侧 SN 上创建一个 7 毫米 （G-7/0） 的神经间隙，其中神经被解剖在 SN 三分叉近端 ~3 毫米处，并使用无菌刻度刻度距距 7 毫米（图 3C）。
      注意：在不移植的情况下解剖 7 毫米坐骨神经会产生无法修复的神经间隙。这只小鼠被标记为 G-7/0，因为移植了 7 毫米，但没有进行修复。
   3. 解剖后，立即将横断神经转移到含有磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的培养皿的无菌状态，并用 10 μL 纤维蛋白胶将 SN（小鼠 #1）的近端残端埋在肌肉下方。
   4. 接下来，在小鼠 #2 中，在右侧 SN 上创建一个 5 mm 的神经间隙，并在两端 （G-5/7） 使用纤维蛋白胶（10 μL，~10 s）从小鼠 #1 移植 7 mm 解剖的神经切片（图 3C）。
      注意：移植时，需要特别小心，以避免外科医生对 SN 的错位和其他医源性损伤。
9. 执行逐步横切和缝合 （STS）。
   1. 沿其宽度的 80% 对坐骨神经进行严重处理（图 3D），并使用 9-0 尼龙的神经外缝线修复残端。
   2. 完成后，对神经的剩余部分进行严重处理，并使用单个 9-0 尼龙缝合进行修复。
   3. 倒置神经以露出撕裂伤的背面，并使用两针 9-0 尼龙缝合完成修复。

结果

定制的数字压力传感器设备（图 1D）通过检测施加力时 FSR 的电阻变化来工作。该设备感应并记录施加在其上的最适度的压力量，响应时间为 <5 μs，采样率为 20 Hz，压力范围为 2.5-25 lbs³¹。由压力传感器设备（图 1D）感应和指示的镊子（图 1C）诱导的 SNCI（图 1A

讨论

TPNI 研究的历史可以追溯到几十年^11,12。对狗和大型物种的早期实验确立了动物模型在 TPNI 结果研究中的重要性 36,37,38。随着时间的推移，这些模型已经转移到较小的啮齿动物中，其已建立和常用的验证结果测量为 39,40,41。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol prep	COVIDIEN	5110
Buprenorphine	ZooPharm	BSRLAB0.5-211706
C57BL/6J	Jackson Laboratories, Bar Harbor	N/A
Cotton tipped applicators	Puritan	25-8062WC
Dissecting scissor	ASSI	ASSI.SDC18R8
Fibrin glue-TISSEEL	Baxter	1501263
Force Sensitive Resistor (FSR)	N/A	FlexiForce A301
Forceps	FST-Dumont	5SF Inox, 11252-00
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.	Version 8.4.3.
Homeothermic heating pad	Kent Scientific	RJ1675
Ketamine/Ketaved	VEDCO	VED1220
Microsurgical Forceps	Miltex Premium instruments	BL1901
Ophthalmic lubricant ointment	Akorn Animal Health	NDC 59399-162-35
Petri dish	VWR	25384-092
Phosphate-buffered saline	Gibco	14190-144
Povidone iodine	Solimo	L0017765SA
Precision pinch pressure sensor device	Custom made	N/A
Scissor	Miltex Premium	21-536
Stereo zoom binocular microscope	World Precision Instruments	Model PZMIII
Sterile gloves	Cardinal Health	9L19E511
Surgical staples	3M-Precise	DS-25
Surgical Tape	3M-Microphore	1530-0
Sutures	Ethicon	BV130-5
Syringe	BD syringe	309597
Trimmer	Philips Electronics	MG3750
Xylazine/Anased	Akorn Animal Health, Inc.	VAM4811