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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
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  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive le lesioni traumatiche dei nervi periferici (TPNI), tra cui schiacciamento calibrato con precisione, lacerazione rigorosamente allineata e disallineata, nonché lacune innestate e non innestate del nervo sciatico nei topi. Vengono sviluppati sensori progettati su misura per misurare il trauma nervoso, indotto con strumenti comunemente disponibili per garantire risultati riproducibili post-TPNI.

Abstract

La lesione traumatica del nervo periferico (TPNI) è una causa comune di morbilità a seguito di trauma ortopedico. Metodi riproducibili e precisi per ferire il nervo e denervare il muscolo sono stati a lungo un obiettivo nella ricerca muscoloscheletrica. Molti arti lesionati traumaticamente hanno un trauma nervoso che definisce l'esito a lungo termine del paziente. Nel corso di diversi anni, sono stati sviluppati metodi precisi per produrre lesioni nervose microchirurgiche, tra cui schiacciamento, lacerazioni e innesto di intercapedine nervosa, consentendo valutazioni dei risultati riproducibili. Inoltre, sono stati creati metodi più recenti per le lesioni da schiacciamento calibrate che offrono correlazioni clinicamente rilevanti con gli esiti utilizzati per valutare i pazienti umani. I principi della manipolazione minima per garantire una bassa variabilità nelle lesioni nervose consentono di aggiungere ancora più lesioni tissutali associate in questi modelli. Ciò include lo schiacciamento muscolare diretto e altri componenti della lesione dell'arto. Infine, la valutazione dell'atrofia e l'analisi precisa degli esiti comportamentali rendono questi metodi un pacchetto completo per lo studio del trauma muscoloscheletrico che incorpora realisticamente tutti gli elementi della lesione traumatica dell'arto umano.

Introduzione

La lesione traumatica del nervo periferico (TPNI) è una causa comune di morbilità dopo un trauma ortopedico 1,2,3. Ogni anno, circa il 3% dei pazienti traumatizzati subisce lesioni nervose 1,4, con un'incidenza di 3,50,000 casi5, con conseguenti 50,000 riparazioni chirurgiche6. Le TPNI si verificano in un'ampia gamma di gravità e il recupero funzionale dipende direttamente dal tipo e dalla gravità di queste lesioni 7,8,9. Traumi meno gravi (ad esempio, lieve schiacciamento, lacerazione incompleta, ecc.) danneggeranno prima la guaina mielinica e gli assoni, mentre forze più gravi (ad esempio, forte schiacciamento, lacerazioni complete, ecc.) interromperanno i tessuti nervosi connettivi; Ad esempio, l'endoneurio, il perineurio e l'epinevrio oltre alla mielina e agli assoni 1,10. I pazienti con TPNI sperano che la funzione nervosa alla fine ritorni e che l'atrofia muscolare venga invertita. Decenni di ricerca non hanno fornito trattamenti precisi per migliorare o garantire il completo recupero, nonostante i progressi nelle procedure di trattamento11,12.

Le transezioni nervose non guariranno senza la riparazione chirurgica, che viene spesso eseguita al microscopio. Le riparazioni vengono in genere eseguite end-to-end, facendo uno sforzo per garantire che il sito di riparazione non sia sotto tensione. L'innesto nervoso viene utilizzato per garantire che le riparazioni siano prive di tensione13,14. Nonostante i metodi apparentemente avanzati utilizzati in queste riparazioni, il recupero funzionale è generalmente insignificante11,12. La riabilitazione è spesso incompleta e insoddisfacente. Il recupero funzionale ottimale richiede la rigenerazione degli assoni per attraversare il sito della lesione (ponte nervoso) e innervare l'organo bersaglio. Questi processi sono complicati da depistaggio assonale o arresto della crescita, con conseguente atrofia muscolare e eventuale mancato recupero 15,16,17,18. È stato dimostrato che gli esiti funzionali a seguito di riparazione nervosa (ad esempio, sutura end-to-end, isotrapianto, ecc.) dipendono dall'accuratezza dell'apposizione fascicolare19,20. La corretta direzionalità dei monconi nervosi sezionati e dei loro fascicoli è quindi fondamentale nella riparazione dei nervi, senza la quale ci si può aspettare uno scarso recupero funzionale anche con una rigenerazione assonale ottimale. La riparazione microchirurgica della sutura è di per sé un processo traumatico e poco è accaduto in termini di nuovi metodi per migliorare drasticamente i risultati. Il campo manca di modelli animali di transezione nervosa riproducibili, che si traducono in lacune prevedibili che consentono misurazioni affidabili del recupero a livello funzionale e tissutale. Tali metodi, se disponibili, consentirebbero la caratterizzazione della rigenerazione nervosa senza i problemi di cambiamenti variabili nella vascolarizzazione neurale e nell'atrofia post-denervazione21,22. Molti gruppi si sforzano di utilizzare modelli migliori che limitino questo tipo di variabilità. Un modo è garantire che le riparazioni nervose siano minimamente manipolate e che i monconi nervosi siano perfettamente contrastati.

Ciò si ottiene al meglio utilizzando una tecnica standardizzata di transezione del nervo periferico chiamata taglio graduale e colla di fibrina (STG). Le riparazioni in questo modello STG sono fissate con colla di fibrina e le distanze tra le fessure sono standardizzate e ridotte al minimo21,22. La stessa colla di fibrina viene impiegata negli esseri umani per queste riparazioni, probabilmente per le stesse ragioni, insieme ai suoi effetti benefici sulla formazione di cicatrici post-riparazione23,24. La chiave del metodo attuale è che la riparazione del nervo inizia prima che la lacerazione sia completata, garantendo un modello di lesione fisso. Questo metodo attuale ha mostrato una stretta comunanza con la fisiopatologia caratteristica della transezione nervosa con la sutura epineurale gold standard e l'impatto negativo della colla di fibrina non è stato osservato sulla rigenerazione nervosa. La riparazione della transezione del nervo sciatico con colla di fibrina nei topi migliora l'allungamento dell'assone rispetto alla rigenerazione nervosa precoce tramite sutura, e questi risultati sono coerenti con l'STG. L'STG beneficia anche del principio della manipolazione minima, in cui il nervo non viene mai toccato per il posizionamento della sutura21. Questo standardizza efficacemente il trauma nervoso associato alla riparazione nel modello. Principi simili sono stati utilizzati per studiare il disallineamento capovolgendo il nervo prima di incollare22. Ciò ha permesso il confronto diretto delle lesioni nervose in cui quasi la stessa quantità di manipolazione ha contribuito alle differenze di allineamento senza aumentare il divario o il trauma. Ciò ha facilitato l'esame diretto dell'effetto dell'allineamento sui cambiamenti neurovascolari indotti da lesioni nervose21,22, sull'atrofia muscolare21,22 e sul recupero funzionale21,22. La presente indagine è tutto ciò che consente lo studio di monconi nervosi disallineati intenzionalmente e precisamente.

La maggior parte dei nervi nella TPNI non sono recisi, non hanno lacune o difetti e sembrano essere in grado di recuperare, eppure in molti di questi casi, gli arti rimangono permanentemente disfunzionali a causa di lesioni nervose e interventi confusi. I TPNI sperimentali vengono solitamente eseguiti su lesioni da schiacciamento del nervo sciatico dei roditori (SNCI) utilizzando trascinatori di aghi bloccanti (ND), pinze o dispositivi simili e un chirurgo esperto per creare una lesione da schiacciamento precisa e riproducibile 25,26,27,28,29,30. I modelli animali SNCI dipendono dalla precisione innata dell'operatore per limitare la variazione di pressione, ma questa non viene mai misurata in modo esplicito. Ciò si traduce in variabilità tra gli animali e gli studi, senza una guida chiara sulla pressione standardizzata. Si prevede quindi che la capacità di fornire e segnalare con precisione una serie coerente e accurata di lesioni con varie intensità note possa giovare al campo TPNI. Un modello perfetto può fornire un SNCI di una gravità nota della lesione nervosa di ciascun animale da parte di qualsiasi laboratorio o ricercatore per un'autentica replicabilità inter-studio e del dispositivo. Per risolvere questa carenza, è stato costruito un dispositivo digitale calibrato unico contenente un resistore sensibile alla forza (FSR), in grado di riportare la pressione (in tempo reale) applicata a un nervo. Questo dispositivo è stato quindi testato per la replicabilità di varie pressioni di lesione da schiacciamento dispiegate da diversi tipi di pinze e ND31.

Infine, è stato sviluppato un metodo specifico per affrontare le lacune nel nervo32. Le lacune nervose in letteratura sono indotte rimuovendo una sezione nervosa e poi riparandola nel difetto 13,33,34. La manipolazione richiesta per questa procedura chirurgica è spesso aggravata dalla sutura e i monconi del nervo si ritraggono in modo variabile 21,32,34. Si basava sul ragionamento che utilizzando innesti nervosi isogenici sovradimensionati, la retrazione del moncone nervoso non sarà mai un problema32. Il metodo richiedeva l'operazione simultanea su due o tre animali contemporaneamente, prelevando un innesto di 7 mm per inserire un difetto di 5 mm indotto in un altro animale. La dimensione del difetto del secondo animale è stata quindi utilizzata per innestare un difetto ancora più piccolo in un altro animale, se necessario. Ciò ha portato a un metodo completo per la chirurgia simultanea per innestare difetti con nervi donatori sempre più grandi del difetto nervoso per garantire una riparazione senza tensione. In combinazione con il requisito di una manipolazione minima, questo offre una strada per studiare la lunghezza dell'innesto direttamente negli animali singenici senza lacune asimmetriche dell'innesto che sono onnipresenti in letteratura 20,32,34.

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Protocollo

Il disegno sperimentale e i protocolli sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Penn State University College of Medicine. Per gli studi sono stati utilizzati topi maschi adulti C57BL/6J, di 10 settimane, del peso di 20-25 g. Gli animali sono stati alloggiati presso la struttura per animali in condizioni sterili di gestione degli animali e sono stati acclimatati almeno 5 giorni prima di condurre gli studi.

1. Preparazione degli animali

  1. Anestetizzare gli animali in profondità utilizzando un cocktail di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale utilizzando un ago da 26 G.
  2. Radere l'arto posteriore destro e la parte bassa della schiena degli animali utilizzando un rifinitore e quindi pulire con alcool preparato con soluzione di iodio povidone al 10% utilizzando applicatori sterili con punta di cotone (vedi Tabella dei materiali).
  3. Applicare un unguento lubrificante oftalmico sugli occhi utilizzando applicatori sterili con punta di cotone per evitare la secchezza degli occhi.
  4. Dopo la preparazione, posizionare gli animali su un termoforo omeotermico (vedi Tabella dei materiali) per mantenere la temperatura corporea a 37 °C.
  5. Fissa gli arti posteriori dei topi sul termoforo e posizionali con cura simmetricamente in modo che l'articolazione del ginocchio formi un angolo retto con il corpo.
  6. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave e poi posizionarli sul tampone sterile.
    NOTA: Il chirurgo deve indossare una maschera, un camice e guanti sterili prima di eseguire interventi chirurgici.

2. Generazione di modelli di lesione traumatica del nervo periferico (TPNI)

  1. Dopo la preparazione, praticare un'incisione cutanea laterale (~2 cm) lungo la lunghezza del femore utilizzando una forbice e un microscopio binoculare stereo zoom di precisione (vedi Tabella dei materiali).
  2. Esporre senza mezzi termini il nervo sciatico (SN) attraverso la banda ileotibiale utilizzando forbici da dissezione e pinze microchirurgiche. Evitare qualsiasi danno meccanico iatrogeno al SN.
  3. Chiudere la pelle con graffette chirurgiche dopo gli interventi chirurgici TPNI (passaggi 4-9). Somministrare buprenorfina a lento rilascio (0,05 mg/kg) (vedi Tabella dei materiali) per via sottocutanea a tutti gli animali come analgesico.
  4. Eseguire la lesione da schiacciamento del nervo sciatico (SNCI) seguendo i passaggi seguenti.
    1. Posizionare l'SN a circa 3 mm prossimalmente alla triforcazione nella forma piatta tra le punte delle pinze (Figura 1A).
      NOTA: È necessario prestare la massima attenzione per evitare posizioni deformi, che portano variazioni nei risultati sperimentali tra animali/gruppi.
    2. Eseguire l'SNCI utilizzando pinze calibrate e maschere in alluminio personalizzate (Figura 1C)31,35 per ottenere una pressione specifica su una larghezza fissa (3,5 mm).
      NOTA: I dettagli del sensore di pressione digitale per SNCI che utilizza pinze calibrate e maschere di alesatura personalizzate sono menzionati nei nostri rapporti precedentemente pubblicati31,35. Le maschere personalizzate sono state realizzate praticando fori in piccoli pezzi di alluminio. È stato confermato che queste maschere producono pressioni specifiche utilizzando un sensore di pressione digitale, utilizzando parti e specifiche disponibili pubblicamente e descritte in precedenza31,35.
    3. Dopo il posizionamento, spingere delicatamente la maschera per raggiungere il blocco sulla pinza e, dopo 30 s, rilasciare lentamente la maschera e confermare la lesione dalla struttura alterata del nervo (Figura 1B).
      NOTA: Le alterazioni strutturali del nervo confermano il grado di gravità della lesione. Questo può essere verificato utilizzando la microscopia nei casi di prova.
    4. Dopo SNCI, seppellire attentamente il nervo tra i muscoli per evitare lesioni iatrogene da parte di un chirurgo.
      NOTA: Le lesioni da schiacciamento causate da pinze calibrate erano esatte, affidabili e riproducibili, il che è stato stabilito utilizzando il dispositivo sensore di pressione di pizzicodi precisione 31 (Figura 1D). L'andamento temporale della pressione della lesione da schiacciamento in tempo reale da parte di diverse maschere con pinza è illustrato nella Figura 2A, B.
  5. Eseguire la transezione e la colla (TG).
    1. Sezionare il SN completamente ~3 mm prossimalmente alla triforcazione SN utilizzando le forbici da dissezione.
    2. Dopo la transezione, riparare istantaneamente la fessura nervosa applicando 10 μL di colla di fibrina (vedi Tabella dei materiali) attorno al sito di transezione per limitare l'ulteriore spostamento delle estremità nervose recise. Il tempo di coagulazione della colla di fibrina era di ~15 s.
      NOTA: Il gap SN era incontrollato e casuale dopo la transezione a causa della retrazione, che potrebbe essere una variabile per l'esito risultante.
  6. Eseguire la transezione graduale e la colla (STG).
    1. Sezionare il SN in modo incompleto (80% della sua larghezza) ~3 mm prossimalmente alla triforcazione SN utilizzando le forbici da dissezione per prevenire la formazione di spazi vuoti.
    2. Successivamente, applicare 10 μL di colla di fibrina attorno al sito di taglio e sezionare completamente il restante 20% del nervo prima della completa coagulazione (~10 s) della colla.
      NOTA: Questo metodo ha effettivamente diminuito la formazione di spazi causati dalla retrazione elastica delle estremità nervose tagliate, ma era anche esente da ulteriori manipolazioni chirurgiche al nervo, a differenza del modello TG (Figura 3A).
  7. Eseguire il capovolgimento e la transezione con la colla (FTG).
    1. Innanzitutto, sezionare il SN al 40% della sua larghezza da ciascun lato (Figura 3B).
    2. Capovolgere trasversalmente il moncone distale e applicare 10 μL di colla di fibrina attorno al sito di transezione.
    3. Quindi, sezionare completamente il nervo centrale al 20% prima della completa coagulazione (~10 s) della colla di fibrina.
    4. Confermare la transezione completa al microscopio diretto.
  8. Eseguire il gap e l'innesto del nervo seguendo i passaggi seguenti.
    1. In un modello graduato di gap nervoso e innesto, utilizzare coppie di topi in serie per l'innesto nervoso singenico a cascata32 in 1 serie di esperimenti.
    2. In un topo (ad esempio, topo #1), creare uno spazio nervoso di 7 mm (G-7/0) sul SN destro, dove il nervo è stato sezionato a ~3 mm prossimalmente alla triforcazione SN e a una distanza di 7 mm da questa utilizzando una scala graduata sterile (Figura 3C).
      NOTA: Una lacuna nervosa irreparabile è stata creata sezionando un nervo sciatico di 7 mm senza innesto. Questo topo è etichettato G-7/0 perché viene prelevato un innesto di 7 mm, ma non viene eseguita alcuna riparazione.
    3. Dopo la dissezione, trasferire immediatamente il nervo sezionato nella condizione sterile della piastra di Petri contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e seppellire il moncone prossimale del SN (topo #1) sotto il muscolo con 10 μL di colla di fibrina.
    4. Successivamente, nel topo #2, creare uno spazio nervoso di 5 mm sul SN destro e innestare la sezione nervosa sezionata di 7 mm dal topo #1 utilizzando colla di fibrina (10 μL, ~10 s) su entrambe le estremità (G-5/7) (Figura 3C).
      NOTA: Durante l'innesto, è necessario prestare particolare attenzione al chirurgo per evitare disallineamenti e altre lesioni iatrogene del SN.
  9. Eseguire la transezione graduale e le suture (STS).
    1. Severa il nervo sciatico lungo l'80% della sua larghezza (Figura 3D) e ripara i monconi utilizzando punti epineurali di nylon 9-0.
    2. Dopo il completamento, sezionare la parte rimanente del nervo e riparare utilizzando un singolo punto di nylon 9-0.
    3. Capovolgere il nervo per esporre la parte posteriore della lacerazione e utilizzare due punti di nylon 9-0 per completare la riparazione.

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Risultati

Il sensore di pressione digitale su misura (Figura 1D) funziona rilevando la variazione di resistenza dell'FSR quando viene applicata una forza. Questo dispositivo rileva e registra le quantità di pressione più modeste applicate ad esso con un tempo di risposta di <5 μs, una frequenza di campionamento di 20 Hz e un intervallo di pressione di 2,5-25 libbre31. Le differenze nella pressione SNCI (Figura 1C

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Discussione

La storia della ricerca TPNI si estende su diversi decenni11,12. I primi esperimenti con cani e specie più grandi hanno stabilito l'importanza dei modelli animali nello studio dei risultati della TPNI 36,37,38. Nel corso del tempo, questi modelli si sono spostati in roditori più piccoli, con le loro misure di risultati convalidate stab...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del NIH (K08 AR060164-01A) e del DOD (W81XWH-16-1-0725; W81XWH-19-1-0773) oltre al supporto istituzionale del Pennsylvania State University College of Medicine, Hershey, PA 17033, USA.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Alcohol prepCOVIDIEN5110
BuprenorphineZooPharmBSRLAB0.5-211706
C57BL/6JJackson Laboratories, Bar HarborN/A
Cotton tipped applicatorsPuritan25-8062WC
Dissecting scissorASSIASSI.SDC18R8
Fibrin glue-TISSEELBaxter1501263
Force Sensitive Resistor (FSR)N/AFlexiForce A301
ForcepsFST-Dumont5SF Inox, 11252-00
GraphPad PrismGraphPad Software Inc.Version 8.4.3.
Homeothermic heating padKent ScientificRJ1675
Ketamine/KetavedVEDCOVED1220
Microsurgical ForcepsMiltex Premium instrumentsBL1901
Ophthalmic lubricant ointmentAkorn Animal HealthNDC 59399-162-35
Petri dishVWR25384-092
Phosphate-buffered salineGibco14190-144
Povidone iodineSolimoL0017765SA
Precision pinch pressure sensor deviceCustom madeN/A
ScissorMiltex Premium21-536
Stereo zoom binocular microscopeWorld Precision InstrumentsModel PZMIII
Sterile glovesCardinal Health9L19E511
Surgical staples3M-PreciseDS-25
Surgical Tape3M-Microphore1530-0
SuturesEthiconBV130-5
SyringeBD syringe309597
TrimmerPhilips ElectronicsMG3750
Xylazine/AnasedAkorn Animal Health, Inc.VAM4811

Riferimenti

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