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要約

現在のプロトコルは、正確に較正されたクラッシュ、厳密に整列した裂傷および位置ずれの裂傷、およびマウスの坐骨神経の移植済みおよび非移植されたギャップを含む外傷性末梢神経損傷(TPNI)について説明しています。カスタム設計のセンサーは、神経外傷を測定するために開発され、一般的に利用可能なツールで誘発され、TPNI後の再現性のある結果を保証します。

要約

外傷性末梢神経損傷 (TPNI) は、整形外科的外傷後の罹患率の一般的な原因です。神経を損傷し、筋肉を除神経する再現性のある正確な方法は、筋骨格研究の長年の目標でした。外傷を負った手足の多くは、患者の長期的な転帰を決定づける神経外傷を持っています。数年にわたって、圧迫、裂傷、神経ギャップ移植など、顕微手術による神経損傷の正確な方法が開発され、再現性のある結果評価が可能になりました。さらに、キャリブレーションされたクラッシュ傷害に対しては、ヒト患者の評価に使用される結果と臨床的に関連性のある相関関係を提供する新しい方法が作成されています。神経損傷のばらつきを低く抑えるための最小限の操作の原則により、これらのモデルにさらに多くの関連する組織損傷を追加することができます。これには、直接的な筋肉の挫傷や四肢損傷の他の要素が含まれます。最後に、萎縮の評価と行動結果の正確な分析により、これらの方法は、人間の外傷性四肢損傷のすべての要素を現実的に組み込んだ筋骨格系外傷を研究するための完全なパッケージになります。

概要

外傷性末梢神経損傷 (TPNI) は、整形外科的外傷後の罹患率の一般的な原因です 1,2,3。毎年、外傷患者の約3%が神経損傷1,4を患っており、その発生率は3,50,000例5で、50,000件の外科的修復6が行われています。TPNIは広範囲の重症度で発生し、機能回復はこれらの損傷の種類と重症度に直接依存します7,8,9。それほど深刻ではない外傷(例:軽度の挫傷、不完全な裂傷など)は最初にミエリン鞘と軸索を損傷しますが、より深刻な力(例:重度の挫傷、完全な裂傷など)は結合神経組織を破壊します。例えば、ミエリンと軸索に加えて、Endoneurium、Perineurium、およびEpineuriumです1,10。TPNIの患者さんは、いずれ神経機能が回復し、筋萎縮が回復することを望んでいます。何十年にもわたる研究は、治療手順の進歩にもかかわらず、完全な回復を強化または確保するための正確な治療法を提供していません11,12。

神経断裂は、顕微鏡下で行われることが多い外科的修復なしには治癒しません。修理は通常、エンドツーエンドで行われ、修理現場に緊張がかからないように努力します。神経移植は、修復が緊張なく行われるようにするために使用されます13,14。これらの修復に使用されている一見高度な方法にもかかわらず、機能回復は一般的に印象的ではありません11,12。リハビリテーションはしばしば不完全で満足のいくものではありません。最適な機能回復には、損傷部位(神経橋)を横切り、標的臓器を神経支配するための軸索を再生する必要があります。これらのプロセスは、軸索のミスディレクションまたは成長阻害によって複雑になり、筋萎縮と最終的には回復の失敗をもたらします15,16,17,18。神経修復後の機能的転帰(例えば、エンドツーエンドの縫合、等接など)は、束状並置19,20の精度に依存することが示されています。したがって、切除された神経断端とその束の適切な方向性は、神経修復において重要であり、それなしでは、最適な軸索再生を行っても機能回復が不十分になることが予想されます。顕微手術による縫合糸の修復自体がトラウマ的なプロセスであり、転帰を劇的に改善する新しい方法という点では、ほとんど何も起こっていません。この分野には再現性のある神経切断動物モデルがないため、機能レベルと組織レベルでの信頼性の高い回復測定を可能にする予測可能なギャップが生じます。そのような方法が利用可能であれば、神経血管新生および除神経後の萎縮21,22における変動変化の問題なしに、神経再生の特性評価を可能にするであろう。多くのグループは、この種の変動性を制限するより優れたモデルを使用しようとしています。1つの方法は、神経修復が最小限に抑えられ、神経断端が完全に反対になるようにすることです。

これは、段階的カットとフィブリン接着剤(STG)と呼ばれる標準化された末梢神経切断技術を使用して最もよく達成されます。このSTGモデルの修理はフィブリン接着剤で固定されており、ギャップ距離は標準化され、最小限に抑えられています21,22。フィブリン接着剤自体は、おそらく同じ理由で、修復後の瘢痕形成に対する有益な効果とともに、これらの修復のために人間に使用されています23,24。本方法の鍵は、裂傷が完了する前に神経修復が始まり、固定された損傷パターンを確保することです。この現在の方法は、ゴールドスタンダードのエピニューラル縫合による神経切断の特徴的な病態生理学と密接な共通性を示し、フィブリン接着剤の悪影響は神経再生に観察されませんでした。マウスのフィブリン接着剤による坐骨神経切断の修復は、縫合による初期の神経再生と比較して軸索の伸長を改善し、これらの知見はSTGと一致しています。これにより、モデル内の修復に関連する神経外傷が効果的に標準化されます。同様の原理は、接着22の前に神経を反転させることによってミスアライメントを調査するために使用されました。これにより、ほぼ同じ量の操作がギャップや外傷の増加なしにアライメントの違いに寄与した神経損傷を直接比較することが可能になりました。これにより、神経損傷による神経血管の変化21,22、筋萎縮21,22、および機能回復21,22に対するアライメントの影響を直接調査することが容易になりました。現在の調査は、意図的かつ正確に位置がずれた神経断端の研究を可能にするすべてです。

TPNIの神経のほとんどは切断されておらず、隙間や欠損がなく、回復可能であるように見えますが、これらのケースの多くでは、神経損傷や混乱した介入により、手足は永久に機能不全のままです。実験的TPNIは、齧歯類の坐骨神経挫傷(SNCI)に対して、ロッキングニードルドライバー(ND)、鉗子、または同様の装置、および経験豊富な外科医を使用して、正確で再現性のある挫傷を創り出すために慣習的に行われる25,26,27,28,29,30.SNCI動物モデルは、圧力変動を制限するためにオペレーターの生来の精度に依存していますが、これが明示的に測定されることはありません。このため、動物と研究の間でばらつきが生じ、標準化された圧力に関する明確なガイダンスはありません。したがって、さまざまな既知の強度で一貫性のある正確な一連の損傷を正確に提供および報告する能力は、TPNI分野に利益をもたらす可能性があると期待されています。完璧なモデルは、どの研究室や研究者でも、既知の神経損傷の重症度のSNCIを各動物に提供でき、本物の相互研究とデバイスの再現性を実現します。この欠点に対処するために、神経に加えられた圧力(リアルタイム)の報告に長けたフォースセンシティブレジスター(FSR)を含む独自のキャリブレーションされたデジタルデバイスが構築されました。次に、この装置は、さまざまな種類の鉗子およびNDによって展開されるさまざまな挫傷圧力の再現性についてテストされました31。

最後に、神経32のギャップに対処するための特定の方法が開発されました。文献の神経ギャップは、神経切片を取り除き、それを修復して欠陥に戻すことによって誘発されます13,33,34。この外科的処置に必要な操作は、しばしば縫合と組み合わされ、神経の断端はさまざまに収縮します21,32,34。それは、等遺伝子の特大の神経移植片を使用すると、神経断端の収縮が問題になることは決してないという推論に基づいていました32。この方法では、一度に2匹または3匹の動物に同時手術を行い、7mmの移植片を別の動物に誘発した5mmの欠損物に配置する必要がありました。次に、2番目の動物の欠陥サイズを使用して、必要に応じて別の動物にさらに小さな欠陥を移植しました。これにより、緊張のない修復を確実にするために、常に神経欠損よりも大きいドナー神経と欠損を移植する同時手術の包括的な方法が生まれました。最小限の操作の要件と結合すると、これは、文献20,32,34に遍在する非対称のグラフトギャップなしに、同系動物で直接グラフトの長さを研究する手段を提供します。

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プロトコル

実験デザインと動物実験プロトコルは、ペンシルベニア州立大学医学部の動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました。研究には、10週齢、体重20〜25gの成体C57BL/6J雄マウスを使用しました。動物は無菌動物管理条件下で動物施設に収容され、研究を実施する少なくとも5日前に順応しました。

1.動物の調理

  1. ケタミン (100 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) のカクテルを使用して、26 G の針を使用した腹腔内注射 により 、動物に深く麻酔をかけます。
  2. トリマーを使用して動物の右後肢と腰を剃り、滅菌綿チップのアプリケーターを使用して10%ポビドンヨード溶液を調製したアルコールで洗浄します( 材料の表を参照)。
  3. 眼の乾燥を避けるために、滅菌綿の先端のアプリケーターを使用して眼科用潤滑剤軟膏を目に塗ります。.
  4. 準備後、動物を恒温パッド( 材料の表を参照)に置き、体温を37°Cに保ちます。
  5. マウスの後肢を加熱パッドにテープで固定し、膝関節が体と直角になるように対称的になるように慎重に配置します。
  6. すべての手術器具をオートクレーブ滅菌し、滅菌パッドの上に置きます。
    注:外科医は、手術を行う前に滅菌マスク、ガウン、手袋を着用する必要があります。

2. TPNI(Traumatic Peripheral Nerve Injury)モデルの生成

  1. 準備後、ハサミと精密ステレオズーム双眼顕微鏡を使用して、大腿骨の長さに沿って皮膚の外側切開(~2cm)を行います( 材料の表を参照)。
  2. 解剖はさみと顕微手術用鉗子を使用して、腸脛靭帯を通して坐骨神経(SN)を鈍く露出させます。SNへの医原性の機械的損傷を避けてください。
  3. TPNI手術後は、外科用ステープルで皮膚を閉じます(ステップ4〜9)。徐放性ブプレノルフィン(0.05 mg / kg)( 材料表を参照)を鎮痛薬としてすべての動物に皮下投与します。.
  4. 以下の手順に従って、坐骨神経挫傷傷(SNCI)を実行します。
    1. SNを三分部から約3mm近位に、鉗子の先端の間の平らな形状に配置します(図1A)。
      注:動物/グループ間で実験結果にばらつきをもたらす歪んだ位置を避けるために、細心の注意を払う必要があります。
    2. 校正された鉗子とカスタムアルミニウム治具(図1C)31,35を使用してSNCIを実行し、固定幅(3.5 mm)を超える特定の圧力が得られます。
      注:校正された鉗子とカスタムボーリング治具を使用したSNCI用のデジタル圧力センサーデバイスの詳細は、以前に公開されたレポート31,35に記載されています。カスタム治具は、アルミの小片に穴をあけて作られていました。これらの治具は、デジタル圧力センサーを使用して特定の圧力を生成することが確認されており、公開されている部品と仕様を使用して、前述の31,35。
    3. 位置決め後、ジグを軽く押して鉗子のブロックに到達し、30秒後にジグをゆっくりと離し、神経の構造が変化して損傷を確認します(図1B)。
      注:神経の構造的変化は、損傷の重症度を確認します。これは、試験ケースで顕微鏡を使用して検証できます。
    4. SNCIの後、外科医による医原性損傷を避けるために、筋肉の間の神経を慎重に埋めます。
      注:較正された鉗子によって引き起こされた挫傷は、精密なピンチ圧力センサーデバイス31 (図1D)を使用して確立された、正確で信頼性が高く、再現性がありました。鉗子を使用したさまざまな治具によるリアルタイムの挫傷圧力の時間経過を 図2A、Bに示します。
  5. TransectionとGlue(TG)を実行します。
    1. 解剖ハサミを使用して、SN三分位部の近位~3mmでSNを完全に横断します。
    2. 切断後、切断部位の周囲に 10 μL のフィブリン接着剤 ( 材料の表を参照) を塗布して神経ギャップを即座に修復し、切断された神経端のさらなる変位を制限します。フィブリン接着剤の凝固時間は~15秒でした。
      注:SNギャップは、収縮のために交差後に制御されておらず、無計画であり、これは結果として生じる結果の変数である可能性があります。
  6. 段階的な切断と接着剤(STG)を実行します。
    1. SNを不完全(幅の80%)でSN三分位部に近位~3mmで横断し、解剖ハサミを使用してギャップ形成を防ぎます。
    2. 次に、切断部位の周囲に 10 μL のフィブリン接着剤を塗布し、残りの 20% の神経を完全に横断してから、接着剤を完全に凝固させます (~10 秒)。
      注:この方法は、切断された神経端の弾性収縮によって引き起こされるギャップ形成を効果的に減少させましたが、TGモデルとは異なり、神経への追加の外科的操作もありませんでした(図3A)。
  7. 接着剤(FTG)でフリップとトラセクションを実行します。
    1. まず、SNを両側からその幅の40%に横断します(図3B)。
    2. 遠位の切り株を横方向に反転させ、切断部位の周りに10μLのフィブリン接着剤を塗布します。
    3. 次に、フィブリン接着剤の完全な凝固 (~10 秒) の前に、中央の 20% 神経を完全に横断します。
    4. 直視顕微鏡で完全な切断を確認します。
  8. 以下の手順に従って、神経のギャップと移植を行います。
    1. 等級付けされた神経ギャップおよび移植モデルでは、カスケード共生神経移植32 in 1 セットの実験のために、マウスのペアを直列に使用します。
    2. マウス (マウス #1) では、右の SN に 7 mm (G-7/0) の神経ギャップを作成し、そこで神経を SN 分岐部の近位 ~3 mm で解剖し、これから 7 mm の距離を滅菌段階スケールを使用して使用します (図 3C)。
      注:修復不可能な神経ギャップは、移植せずに7mmの坐骨神経を解剖することによって作成されました。このマウスは、7mmのグラフトを採取しますが、修理は行わないため、G-7/0とラベル付けされています。
    3. 解剖後、直ちに切除した神経をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むシャーレの無菌状態に移し、SN(マウス#1)の近位断端を10μLのフィブリン接着剤で筋肉の下に埋めます。
    4. 次に、マウス#2で、右SNに5mmの神経ギャップを作成し、マウス#1の7mmの解剖された神経切片をフィブリン接着剤(10μL、~10秒)の両端(G-5/7)に移植します(図3C)。
      注:移植中は、外科医によるSNのずれやその他の医原性損傷を避けるために特別な注意を払う必要があります。
  9. 段階的離反および縫合糸(STS)を行います。
    1. 坐骨神経の幅の80%に沿って坐骨神経を酷化し(図3D)、9-0ナイロンのエピニューラルステッチを使用して切り株を修復します。
    2. 完成後、神経の残りの部分を厳しくし、9-0ナイロンステッチ1針を使用して修復します。
    3. 神経を反転させて裂傷の裏側を露出させ、2つの9-0ナイロンステッチを使用して修復を完了します。

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結果

特注のデジタル圧力センサ装置(図1D)は、力が加えられたときのFSRの抵抗の変化を検出して動作します。このデバイスは、<5μsの応答時間、20Hzのサンプリングレート、および2.5〜25ポンド31の圧力範囲で、それに加えられた最も控えめな圧力量を感知して記録します。圧力センサーデバイス(図1D)によって検...

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ディスカッション

TPNI研究の歴史は数十年に及びます11,12.イヌや大型種を用いた初期の実験により、TPNIのアウトカム36,37,38の研究における動物モデルの重要性が確立されました。時間の経過とともに、これらのモデルはより小さなげっ歯類に移行し、確立され、一般的に?...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、NIH(K08 AR060164-01A)およびDOD(W81XWH-16-1-0725;W81XWH-19-1-0773)に加えて、ペンシルベニア州立大学医学部、ハーシー、ペンシルバニア州17033、米国からの制度的支援に加えて。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Alcohol prepCOVIDIEN5110
BuprenorphineZooPharmBSRLAB0.5-211706
C57BL/6JJackson Laboratories, Bar HarborN/A
Cotton tipped applicatorsPuritan25-8062WC
Dissecting scissorASSIASSI.SDC18R8
Fibrin glue-TISSEELBaxter1501263
Force Sensitive Resistor (FSR)N/AFlexiForce A301
ForcepsFST-Dumont5SF Inox, 11252-00
GraphPad PrismGraphPad Software Inc.Version 8.4.3.
Homeothermic heating padKent ScientificRJ1675
Ketamine/KetavedVEDCOVED1220
Microsurgical ForcepsMiltex Premium instrumentsBL1901
Ophthalmic lubricant ointmentAkorn Animal HealthNDC 59399-162-35
Petri dishVWR25384-092
Phosphate-buffered salineGibco14190-144
Povidone iodineSolimoL0017765SA
Precision pinch pressure sensor deviceCustom madeN/A
ScissorMiltex Premium21-536
Stereo zoom binocular microscopeWorld Precision InstrumentsModel PZMIII
Sterile glovesCardinal Health9L19E511
Surgical staples3M-PreciseDS-25
Surgical Tape3M-Microphore1530-0
SuturesEthiconBV130-5
SyringeBD syringe309597
TrimmerPhilips ElectronicsMG3750
Xylazine/AnasedAkorn Animal Health, Inc.VAM4811

参考文献

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