생쥐의 외상성 말초 신경 손상

요약

본 프로토콜은 정밀하게 보정된 압착, 엄격하게 정렬되거나 잘못 정렬된 열상, 생쥐의 좌골 신경의 이식 및 이식되지 않은 틈을 포함한 외상성 말초 신경 손상(TPNI)을 설명합니다. 신경 외상을 측정하기 위해 맞춤형으로 설계된 센서가 개발되었으며, 재현 가능한 TPNI 후 결과를 보장하기 위해 일반적으로 사용 가능한 도구로 유도됩니다.

초록

외상성 말초 신경 손상(TPNI)은 정형외과적 외상 후 이환율의 흔한 원인입니다. 신경 및 탈돌기 근육을 손상시키는 재현 가능하고 정확한 방법은 오랫동안 근골격계 연구의 목표였습니다. 외상으로 손상된 많은 팔다리는 장기적인 환자 결과를 정의하는 신경 외상을 가지고 있습니다. 수년에 걸쳐 압착, 열상 및 신경 간극 이식을 포함하여 미세 수술 신경 손상을 생성하는 정확한 방법이 개발되어 재현 가능한 결과 평가가 가능해졌습니다. 또한, 인간 환자를 평가하는 데 사용되는 결과와 임상적으로 관련된 상관 관계를 제공하는 보정된 압착 부상에 대한 새로운 방법이 개발되었습니다. 신경 손상의 낮은 변동성을 보장하기 위한 최소 조작의 원칙은 이러한 모델에 더 많은 관련 조직 손상을 추가할 수 있도록 합니다. 여기에는 직접적인 근육 찌그러짐 및 사지 부상의 다른 구성 요소가 포함됩니다. 마지막으로, 위축 평가와 행동 결과의 정확한 분석은 이러한 방법을 인간의 외상성 사지 손상의 모든 요소를 현실적으로 통합하는 근골격계 외상 연구를 위한 완벽한 패키지로 만듭니다.

서문

외상성 말초신경 손상(TPNI)은 정형외과적 외상 후 이환율의 흔한 원인이다 ^1,2,3. 매년 약 3%의 외상 환자가 신경 손상을 입고^1,4 있으며, 이 중 3,50,000건^{5이 발생하여} 50,000건의 외과적 치료가 이루어졌다⁶. TPNI는 다양한 중증도로 발생하며, 기능 회복은 이러한 부상의 유형과 중증도에 직접적으로 의존합니다 ^7,8,9. 덜 심각한 외상(예: 가벼운 압착, 불완전한 열상 등)은 수초와 축삭을 먼저 손상시키는 반면, 더 심한 힘(예: 심한 압착, 완전한 열상 등)은 결합 신경 조직을 파괴합니다. 예를 들어, 수초(myelin)와 축삭(^axons) 외에 엔도뇨(endoneurium), 회음관(perineurium), 에피뉴리움(epineurium) ^1,10이 있습니다. TPNI 환자는 결국 신경 기능이 회복되고 근육 위축이 역전되기를 희망합니다. 수십 년간의 연구는 치료 절차의 발전에도 불구하고 완전한 회복을 강화하거나 보장하기 위한 정확한 치료법을 제공하지 못했습니다^11,12.

신경 절개는 종종 현미경으로 수행되는 외과적 복구 없이는 치유되지 않습니다. 수리는 일반적으로 종단 간 수행되어 수리 부위에 긴장이 가해지지 않도록 노력합니다. 신경 이식은 복구가 장력이 없도록 하는 데 사용됩니다^13,14. 이러한 수리에 사용된 겉보기에는 발전된 방법인 것처럼 보이지만 기능적 복구는 일반적으로 인상적이지 않습니다^11,12. 재활은 종종 불완전하고 불만족스럽습니다. 최적의 기능 회복을 위해서는 축삭돌기가 부상 부위(신경교)를 가로질러 표적 장기에 신경을 분포시켜야 합니다. 이러한 과정은 축삭의 방향 오류 또는 성장 저해로 인해 복잡해지며, 이로 인해 근육이 위축되고 결국 회복에 실패하게 됩니다 15,16,17,18. 신경 복구 후 기능적 결과(예: 종단 간 봉합, 동종 이식 등)는 근막 부착^19,20의 정확도에 따라 달라지는 것으로 나타났습니다. 따라서 transection된 신경 그루터기와 그 근막의 적절한 방향성은 신경 복구에 매우 중요하며, 이 기능이 없으면 최적의 축삭 재생에도 불구하고 기능 회복이 잘 되지 않을 것으로 예상됩니다. 미세수술 봉합사 복원은 그 자체로 외상적인 과정이며, 결과를 획기적으로 개선할 수 있는 새로운 방법이 거의 발생하지 않았습니다. 이 분야에는 재현 가능한 신경 절개 동물 모델이 부족하여 기능 및 조직 수준에서 신뢰할 수 있는 회복 측정을 가능하게 하는 예측 가능한 격차가 발생합니다. 이러한 방법을 사용할 수 있다면 신경 혈관형성의 다양한 변화와 탈신경 후 위축의 문제 없이 신경 재생의 특성을 규명할 수 있습니다^21,22. 많은 그룹이 이러한 종류의 변동성을 제한하는 더 나은 모델을 사용하기 위해 노력합니다. 한 가지 방법은 신경 복구를 최소한으로 조작하고 신경 그루터기가 완벽하게 반대되도록 하는 것입니다.

이는 STG(Stepwise Cut and Fibrin Glue)라고 하는 표준화된 말초 신경 절제 기술을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 이 STG 모델의 수리는 피브린 접착제로 고정되며 갭 거리는 표준화되고 최소화됩니다^21,22. 피브린 접착제 자체는 이러한 복구를 위해 인간에게 사용되며, 아마도 같은 이유로 사용되며, 수리 후 흉터 형성에 대한 유익한 효과와 함께^23,24. 현재 방법의 핵심은 열상이 완료되기 전에 신경 복구가 시작되어 고정된 부상 패턴을 보장하는 것입니다. 이 현재의 방법은 황금 표준 epineural 봉합을 통한 신경 절편의 특징적인 병태생리학에 밀접한 공통점을 보였으며 피브린 접착제가 신경 재생에 미치는 부정적인 영향은 관찰되지 않았습니다. 생쥐에서 피브린 접착제로 좌골 신경 절개를 복구하면 봉합을 통한 초기 신경 재생에 비해 축삭의 신장이 개선되며, 이러한 결과는 STG와 일치합니다. STG는 또한 봉합사 위치 지정을 위해 신경을 건드리지 않는 최소 조작 원리의 이점을 얻습니다²¹. 이는 모델의 수리와 관련된 신경 외상을 효과적으로 표준화합니다. 접착제를 붙이기 전에 신경을 뒤집어 정렬 불량을 조사하기 위해 유사한 원리가 사용되었습니다²². 이를 통해 거의 동일한 양의 조작이 간격이나 외상의 증가 없이 정렬의 차이에 기여한 신경 손상을 직접 비교할 수 있었습니다. 이를 통해 신경 손상으로 인한 신경혈관 변화^21,22, 근육 위축^21,22, 기능 회복^21,22에 대한 정렬의 효과를 직접 조사할 수 있었다. 본 연구는 의도적이고 정확하게 잘못 정렬된 신경 그루터기에 대한 연구를 가능하게 하는 전부입니다.

TPNI의 대부분의 신경은 절단되지 않았고, 틈이나 결함이 없으며, 회복할 수 있는 것처럼 보이지만, 이러한 경우 많은 경우 사지가 신경 손상과 혼란스러운 중재로 인해 영구적으로 기능 장애를 겪습니다. 실험적 TPNI는 관례적으로 고정 바늘 드라이버(ND), 겸자 또는 이와 유사한 장치를 사용하여 설치류 좌골 신경 압착 손상(SNCI)에 대해 수행되며, 숙련된 외과의가 이를 통해 정확하고 재현 가능한 압착 손상을 생성합니다 25,26,27,28,29,30. SNCI 동물 모델은 압력 변화를 제한하기 위해 타고난 작업자 정밀도에 의존하지만 명시적으로 측정되지는 않습니다. 이로 인해 동물과 연구 간에 변동성이 발생하며 표준화된 압력에 대한 명확한 지침이 없습니다. 따라서 알려진 다양한 강도의 일관되고 정확한 일련의 부상을 정확하게 전달하고 보고할 수 있는 능력은 TPNI 분야에 도움이 될 수 있을 것으로 예상됩니다. 완벽한 모델은 진정한 연구 간 및 장치 복제를 위해 실험실이나 연구원이 각 동물에 대해 알려진 신경 손상 중증도의 SNCI를 제공할 수 있습니다. 이러한 결함을 해결하기 위해 신경에 가해지는 압력(실시간)을 보고하는 데 능숙한 FSR(Force Sensitive Resistor)을 포함하는 고유한 보정된 디지털 장치가 구성되었습니다. 그런 다음 이 장치는 다양한 유형의 겸자 및 ND³¹에 의해 배치되는 다양한 압착 부상 압력의 재현 가능성에 대해 테스트되었습니다.

마지막으로,³²번 신경의 틈을 메우기 위한 구체적인 방법이 개발되었습니다. 문헌에 나타난 신경 간극은 신경 부분을 제거한 다음 결함 ^13,33,34 로 다시 복구함으로써 유도됩니다. 이 수술에 필요한 조작은 종종 봉합과 결합되며, 신경의 그루터기는 다양하게 수축합니다 21,32,34. 그것은 동인성 대형 신경 이식편을 사용하면 신경 그루터기 후퇴가 결코 문제가 되지 않을 것이라는 추론에 근거했습니다³². 이 방법은 한 번에 2마리 또는 3마리의 동물을 동시에 수술하여 다른 동물에서 유도된 5mm 결함에 7mm 이식편을 삽입해야 했습니다. 그런 다음 두 번째 동물의 결함 크기를 사용하여 필요한 경우 다른 동물에서 더 작은 결함을 접목했습니다. 그 결과 긴장 없는 복구를 보장하기 위해 항상 신경 결손보다 큰 기증 신경에 결함을 이식하는 동시 수술을 위한 포괄적인 방법이 탄생했습니다. 최소한의 조작에 대한 요구 사항과 결합하여, 이는 문헌 ^20,32,34에서 흔히 볼 수 있는 비대칭 이식편 갭 없이 syngeneic 동물에서 이식 길이를 직접 연구할 수 있는 방법을 제공합니다.

프로토콜

실험 설계 및 동물 프로토콜은 펜실베이니아 주립 대학교 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 성인 C57BL/6J 수컷 마우스, 10주 령, 체중 20-25g을 연구에 사용했습니다. 동물들은 멸균 동물 관리 조건으로 동물 시설에 수용되었으며, 연구를 수행하기 최소 5일 전에 적응 교육을 받았습니다.

1. 동물 준비

1. 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 칵테일을 사용하여 26G 바늘을 사용하여 복강 내 주사를 통해 동물을 깊숙이 마취합니다.
2. 트리머를 사용하여 동물의 오른쪽 뒷다리와 허리를 면도한 다음 멸균 솜 팁 어플리케이터를 사용하여 10% 포비돈 요오드 용액을 준비한 알코올로 청소합니다( 재료 표 참조).
3. 눈이 건조해지지 않도록 멸균 솜 팁 애플리케이터를 사용하여 눈에 안과 윤활제 연고를 바르십시오.
4. 준비 후 동물을 항온용 발열 패드( 재료 표 참조)에 올려 체온을 37°C로 유지합니다.
5. 생쥐의 뒷다리를 발열 패드에 테이프로 붙이고 무릎 관절이 몸과 직각을 이루도록 조심스럽게 대칭으로 배치합니다.
6. 고압증기멸균으로 모든 수술 도구를 멸균한 다음 멸균 패드에 놓습니다.
   참고: 외과의는 수술을 집도하기 전에 멸균 마스크, 가운 및 장갑을 착용해야 합니다.

2. 외상성 말초신경 손상(TPNI) 모델 생성

1. 준비 후 가위와 정밀 스테레오 줌 양안 현미경을 사용하여 대퇴골 길이를 따라 측면 피부 절개(~2cm)를 합니다( 재료 표 참조).
2. 절개 가위와 미세수술 겸자를 사용하여 장경인대를 통해 좌골 신경(SN)을 무뚝뚝하게 노출시킵니다. SN에 대한 의인성 기계적 손상을 피하십시오.
3. TPNI 수술 후 수술용 스테이플로 피부를 봉합합니다(4-9단계). 서방성 부프레노르핀(0.05 mg/kg)( 재료표 참조)을 진통제로 모든 동물에게 피하투여합니다.
4. 아래 단계에 따라 좌골 신경 압착 손상(SNCI)을 수행합니다.
   1. SN을 집게 팁 사이의 평평한 모양으로 삼분기에 약 3mm 근접하게 배치합니다(그림 1A).
      참고: 동물/그룹 간의 실험 결과에 차이를 가져오는 기형적인 위치를 피하기 위해 각별한 주의가 필요합니다.
   2. 보정된 집게와 맞춤형 알루미늄 지그(그림 1C)^31,35를 사용하여 SNCI를 수행하여 고정 너비(3.5mm)에 대한 특정 압력을 얻습니다.
      참고: 보정된 겸자 및 맞춤형 보링 지그를 사용하는 SNCI용 디지털 압력 센서 장치의 세부 사항은 이전에 발표된 보고서^31,35에 언급되어 있습니다. 맞춤형 지그는 작은 알루미늄 조각에 구멍을 뚫어 만들었습니다. 이러한 지그는 공개적으로 입수가능하고 이전에 설명된 부품 및 사양을 사용하여 디지털 압력 센서를 사용하여 특정 압력을 생성하는 것으로 확인되었습니다^31,35.
   3. 포지셔닝 후 지그를 부드럽게 밀어 집게의 블록에 도달하고 30초 후에 천천히 지그를 풀고 신경의 변경된 구조로 부상을 확인합니다(그림 1B).
      참고: 신경의 구조적 변화는 부상의 정도를 확인합니다. 이는 임상시험에서 현미경을 사용하여 확인할 수 있습니다.
   4. SNCI 후에는 외과 의사에 의한 의인성 부상을 방지하기 위해 근육 사이의 신경을 조심스럽게 묻습니다.
      알림: 보정된 겸자로 인한 압착 부상은 정확하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능했으며, 이는 정밀 핀치 압력 센서 장치³¹ (그림 1D)을 사용하여 설정되었습니다. 겸자가 있는 다른 지그에 의한 실시간 크러시 부상 압력의 시간 경과는 그림 2A, B에 나와 있습니다.
5. TG(Transection and Glue)를 수행합니다.
   1. 해부 가위를 사용하여 SN 삼분기에 근접한 ~3mm를 완전히 절제합니다.
   2. 절제 후 절단된 신경 말단의 추가 변위를 제한하기 위해 절제 부위 주위에 10μL의 피브린 접착제( 재료 표 참조)를 적용하여 신경 간극을 즉시 복구합니다. 피브린 접착제의 응고 시간은 ~15초였습니다.
      참고: SN 갭은 수축으로 인해 절제 후 통제되지 않고 우연히 발생했으며, 이는 결과 결과에 대한 변수가 될 수 있습니다.
6. STG(Stepwise Transection and Glue)를 수행합니다.
   1. SN을 불완전하게(너비의 80%) ~3mm 절제 가위를 해부 가위를 사용하여 갭 형성을 방지합니다.
   2. 다음으로, 절단 부위 주위에 10μL의 피브린 접착제를 바르고 접착제의 완전한 응고(~10초) 전에 신경의 나머지 20%를 완전히 횡절합니다.
      참고: 이 방법은 절단된 신경 말단의 탄성 후퇴로 인한 갭 형성을 효과적으로 줄였지만 TG 모델과 달리 신경에 대한 추가 외과적 조작이 없었습니다(그림 3A).
7. FTG(Flip and Transection with Glue)를 수행합니다.
   1. 먼저 SN을 각 측면에서 너비의 40%로 횡단합니다(그림 3B).
   2. 원위 그루터기를 가로로 뒤집고 절단 부위 주위에 10μL의 피브린 접착제를 바릅니다.
   3. 다음으로, 피브린 접착제의 완전한 응고(~10초) 전에 중앙 20% 신경을 완전히 횡단합니다.
   4. 직접 현미경으로 완전한 절단을 확인합니다.
8. 아래 단계에 따라 신경의 틈새와 이식을 수행합니다.
   1. 등급이 매겨진 신경 갭 및 이식 모델에서, 캐스케이드 공생신경 이식³² in 1 실험을 위해 연속으로 마우스 쌍을 사용합니다.
   2. 마우스(예: 마우스 #1)에서 오른쪽 SN에 7mm(G-7/0) 신경 간격을 생성하고, 여기서 신경은 SN 삼분기에 근접하여 ~3mm 떨어져 있고 멸균 눈금 눈금을 사용하여 7mm 떨어진 곳에서 절개되었습니다(그림 3C).
      참고: 이식하지 않고 7mm 좌골 신경을 절개하여 회복할 수 없는 신경 틈이 생겼습니다. 이 마우스는 7mm 이식편을 취했지만 수리가 수행되지 않았기 때문에 G-7/0으로 표시되어 있습니다.
   3. 해부 후 즉시 transection된 신경을 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 페트리 접시의 멸균 상태로 옮기고 SN(마우스 #1)의 근위 그루터기를 10μL의 피브린 접착제로 근육 아래에 묻습니다.
   4. 다음으로, 마우스 #2에서 오른쪽 SN에 5mm의 신경 간격을 만들고 양쪽 끝(G-5/7)의 피브린 접착제(10μL, ~10초)를 사용하여 마우스 #1에서 7mm 절개된 신경 단면을 이식합니다(그림 3C).
      참고: 이식하는 동안 외과의에 의한 SN의 정렬 불량 및 기타 의인성 부상을 방지하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다.
9. 단계적 횡단면 및 봉합사(STS)를 수행합니다.
   1. 좌골 신경의 80%를 따라 좌골 신경을 심하게 하고(그림 3D), 9-0 나일론의 유신경 스티치를 사용하여 그루터기를 수리합니다.
   2. 완료 후 신경의 나머지 부분을 가혹하게 하고 단일 9-0 나일론 스티치를 사용하여 복구합니다.
   3. 신경을 반전시켜 열상 뒷면을 노출시키고 9-0 나일론 스티치 2개를 사용하여 수리를 완료합니다.

결과

맞춤형 디지털 압력 센서 장치(그림 1D)는 힘이 가해질 때 FSR의 저항 변화를 감지하여 작동합니다. 이 장치는 <5μs의 응답 시간, 20Hz의 샘플링 속도 및 2.5-25lbs³¹의 압력 범위로 가해지는 가장 적당한 압력량을 감지하고 기록합니다. 압력 센서 장치(그림 1D)에 의해 감지되고 표시되는 겸자(그림 1C<...

토론

TPNI 연구의 역사는 수십 년에 걸쳐^11,12 이어집니다. 개와 더 큰 종을 대상으로 한 초기 실험은 TPNI 결과 연구에서 동물 모델의 중요성을 확립했습니다 36,37,38. 시간이 지남에 따라 이러한 모델은 확립되고 일반적으로 사용되는 검증된 결과 측정 ^39,40,41

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol prep	COVIDIEN	5110
Buprenorphine	ZooPharm	BSRLAB0.5-211706
C57BL/6J	Jackson Laboratories, Bar Harbor	N/A
Cotton tipped applicators	Puritan	25-8062WC
Dissecting scissor	ASSI	ASSI.SDC18R8
Fibrin glue-TISSEEL	Baxter	1501263
Force Sensitive Resistor (FSR)	N/A	FlexiForce A301
Forceps	FST-Dumont	5SF Inox, 11252-00
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.	Version 8.4.3.
Homeothermic heating pad	Kent Scientific	RJ1675
Ketamine/Ketaved	VEDCO	VED1220
Microsurgical Forceps	Miltex Premium instruments	BL1901
Ophthalmic lubricant ointment	Akorn Animal Health	NDC 59399-162-35
Petri dish	VWR	25384-092
Phosphate-buffered saline	Gibco	14190-144
Povidone iodine	Solimo	L0017765SA
Precision pinch pressure sensor device	Custom made	N/A
Scissor	Miltex Premium	21-536
Stereo zoom binocular microscope	World Precision Instruments	Model PZMIII
Sterile gloves	Cardinal Health	9L19E511
Surgical staples	3M-Precise	DS-25
Surgical Tape	3M-Microphore	1530-0
Sutures	Ethicon	BV130-5
Syringe	BD syringe	309597
Trimmer	Philips Electronics	MG3750
Xylazine/Anased	Akorn Animal Health, Inc.	VAM4811