意识大鼠肾血流量的长期连续测量

摘要

本协议描述了意识大鼠肾血流量的长期连续测量，并同时用植入的导管（充满液体或通过遥测）记录血压。

摘要

肾脏在维持体液稳态方面起着至关重要的作用。肾血流量（RBF）的调节对于肾功能过滤和代谢的重要功能至关重要。已经在麻醉动物中进行了许多急性研究，以在各种条件下测量RBF，以确定负责调节肾脏灌注的机制。然而，由于技术原因，不可能在长时间内连续（24小时/天）测量无约束的未麻醉大鼠RBF。这些方法允许在数周内连续测定RBF，同时还使用植入导管（充满液体或通过遥测）记录血压（BP）。RBF监测是将大鼠放置在圆形伺服控制的鼠笼中进行的，该笼子使大鼠在整个研究中不受限制地移动。同时，防止来自流动探头和动脉导管的电缆缠结。首先在左肾动脉上放置超声流动探针，并在右股动脉中植入动脉导管，对大鼠进行仪器化。它们通过皮下输送到颈背，并分别连接到流量计和压力传感器以测量RBF和BP。手术植入后，立即将大鼠放入笼中恢复至少一周并稳定超声探头记录。尿液收集在该系统中也是可行的。该协议演示了用于连续监测的手术和手术后程序。

引言

肾脏仅占体重的0.5%，但血流量丰富，占总心输出量的20%-25%¹。肾血流量 （RBF） 的调节对肾功能、体液和电解质稳态至关重要。单侧肾切除^术后剩余肾脏中RBF的大幅^{增加以及肾衰竭中}RBF的减少很好地说明了血流调节对肾脏的重要性5，^6，7。RBF的这种变化是由于肾功能的改变还是由于RBF减少而导致的功能下降而发生的，在麻醉手术准备的动物或人类受试者中一直难以确定。需要进行时间研究，其中可以在定义的变化之前和之后确定事件，并在事件进展期间在同一只动物中观察到事件。在动物和人类研究中，RBF是通过对氨基马尿酸（PAH^）的清除率间接估计的8，9，10，最近通过超声⁹，11，12，MRI⁴，13和PET-CT^14，15等成像技术间接估计的。 它提供了每个肾脏的有用快照图像，并且可以跟踪疾病的进展。在没有麻醉的情况下通过超声或MRI扫描评估小动物的RBF具有挑战性。在同一只大鼠的意识条件下长时间连续测量RBF是不可能的。

因此，本协议开发了能够同时连续24小时/天测量RBF的技术，该技术已与自由移动的大鼠的连续血压测量方法相结合，如前所述¹⁶，¹⁷，¹⁸，¹⁹，^20，21.该技术允许对各种大鼠模型中的RBF进行时间评估，以研究未来各种肾脏疾病的因果关系。

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研究方案

该协议由威斯康星州医学院机构动物护理和使用批准。达尔盐敏感大鼠（雄性和雌性），~8周龄，200-350g，用于实验。

1. 动物制备

1. 在动物室中为大鼠安装运动反应笼系统，血管周围流量模块，注射泵，记录装置和软件（见 材料表）。
2. 至少在手术前一周将大鼠放入笼子中以熟悉环境、食物和水系统。从手术前一天开始禁食大鼠，因为高胃含量可能会干扰流动探头进入左肾动脉并可能导致气管抽吸。
3. 用PVC水泥将5厘米的聚氨酯管（内径0.30毫米，外径0.64毫米）连接到90厘米聚氨酯管（内径0.64毫米和外径1.02毫米）的末端，以制作股动脉导管（见 材料表）。
   1. 用环氧乙烷灭菌器对导管进行灭菌，用2.5%戊二醛对流动探头进行灭菌，并在蒸汽高压灭菌器中对手术器械进行灭菌。用 1% 次氯酸钠擦拭手术台、显微镜检查和灯。

2. 手术

1. 按照以下步骤放置 RBF 探头。
   1. 用2.0%-2.5%异氟醚麻醉大鼠，使大鼠对疼痛刺激无反应。将其放在37°C的手术台上，并在手术前注射0.09mg / kg丁丙诺啡SR和15mg / kg头孢唑啉（见 材料表）。
   2. 用电动剪剃掉整个腹部，并在颈背上的第 7^颈 椎周围有一个区域，导管和血流证明电线将在那里退出。
   3. 剃须后，用70%乙醇，10%聚维酮碘擦拭该区域，然后再次用70%乙醇擦拭该区域。
   4. 将大鼠置于俯卧位。用手术刀在颈背和左胁上切开 1 厘米。然后，用止血钳进行钝性解剖，并清除从侧腹切口到颈部后部的皮下空间。
   5. 用止血钳将流动探头从颈部穿过皮下隧道到侧腹切口。
   6. 将大鼠置于仰卧位。做一个4-5厘米的中线腹部切口。
   7. 用弯曲的镊子解剖肾动脉周围的区域，以露出足以放置流动探头的空间（ 材料表）。然后用止血钳钝刺穿左腰四方肌，将流探头头拉入腹腔。
   8. 将流量探头的尖端钩到左肾动脉并将其连接到流量计（见 材料表）。在探头尖端周围添加一些凝胶，流量值将出现在流量计上。
      注意:虽然这取决于大鼠的大小，但在230克大鼠中将观察到约3-5mL / min的流量。
   9. 用组织粘合剂将附着在探头上的聚酯纤维网粘在腹壁上，并保持直到干燥并粘合（~1-2分钟）。流量到位后，断开流量探头与流量计的连接，用盐水浸泡的纱布覆盖腹部，然后继续插入导管的步骤。
2. 按照以下步骤插入股骨导管。
   注意:插入充满液体的导管的方法与常规遥测安装相同。虽然遥测是首选，但动脉导管可以对有意识的大鼠进行压力监测和定期血液采样。
   1. 首先，用生理盐水填充导管并用血管钳夹住它，然后使用左大腿上的手术刀做一个 1 cm 的皮肤切口，以解剖并暴露股动脉。在用线阻断股动脉近端的流动时，插入导管。
   2. 用少量生理盐水冲洗，用适当尺寸的不锈钢丝塞住，用线系好导管固定。
   3. 一旦结扎在导管周围，使用从大腿到颈部后部的不锈钢穿刺器将导管带到颈部区域，从而形成皮下隧道。用放置在斜方肌中的 3-0 丝线固定它。
3. 缝合探头。
   1. 将大鼠转向俯卧位，并在侧面皮下缝合流动探头的圆形环。用4-0手术缝合缝合侧腹和颈部的切口（见 材料表）。
   2. 将皮肤按钮连接到流动探头上，并在颈部后部用 3-0 丝缝合。
   3. 再次将流量探头连接到流量计，将大鼠转回背部位置以检查RBF，并对流量探头进行最终调整以优化其在肾动脉上的位置。
   4. 最后，用 3-0 丝缝合肌肉，用 4-0 手术缝合皮肤。

3. 动物的恢复

1. 仔细观察后，直到大鼠从麻醉中完全恢复，将大鼠放回运动反应笼系统，将流量探头连接到血流量计，并允许大约一周的恢复期以稳定探头和流量测量。
   注意:在此期间不必进行录制。
2. 在整个研究过程中，从动脉导管以 100 μL/h 的速度连续注入 3% 肝素化盐水，以防止凝血。
3. 当流量在5-6天后稳定下来时，将流量计校准设置为以0-20mL / min测量血流量，并开始连续记录RBF。

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结果

显示了来自代表性雄性达尔盐敏感大鼠的平均动脉压数据（图1A）和血流数据（图1B）。达尔盐敏感大鼠被维持在一个群体中，并在威斯康星医学院繁殖。手术在8周龄时完成，手术时体重为249克。给大鼠喂食0.4%NaCl饮食，并在10周龄时将饮食改为4%NaCl饮食。在4%NaCl饮食下继续测量3周，实验在13周龄时终止。数据以分钟平均值显示。在平均动脉压和血流量?...

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讨论

本协议描述了一种利用市售仪器在数周内连续记录RBF和动脉压的技术。此外，可以使用步骤1.1中描述的装置收集尿液。它还可用于评估尿液中的代谢物，并在植入动脉导管时评估血液采样以进行分析。

传统上，RBF测量值已在手术制备的麻醉动物中急性获得或通过PAH清除率估计。然而，已经表明，各种麻醉剂^{和手术22，23}会改变肾血?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1RB probe	Transonic	1RB	ultrasonic flow probe
Betadine	Avrio Health		povidone-iodine
Buprenorphine SR-LAB	ZooPharm		Buprenorphine
Cefazolin	APOTEX	NDC 60505	Cefazolin
Crile Hemostats	Fine Surgical Instruments	13004-14	Hemostats for blunt dissection
Isoflurane	Piramal	NDC 66794	Isoflurane
Medium Clear PVC cement	Oatey		PVC cement
Mersilene polyester fiber mesh	Ethicon		polyester fiber mesh
MetriCide28	Metrex	SKU 10-2805	2.5% glutaraldehyde
Micro-Renathane 0.025 x 0.012	Braintree Scientific	MRE 025	use for catheter
MINI HYPE-WIPE	Current Technologies	#9803	1% sodium hypochlorite
Oatey Medium Clear PVC Cement	Oatey	#31018	PVC cement
PHD2000 syringe pump	Harvard apparatus	71-2000	syringe pump
Ponemah software	DSI		recording software
Precision 3630 Tower	Dell		Computer for recording
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1407	a movement response caging system
RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025	Braintree Scientific	RPT 040	use for catheter
Silicone cuff	Transonic	AAPC102	skin button
Surgical lubricant sterile bacteriostatic	Fougera	0168-0205-36	gell for flow probe
Tergazyme	Alconox		protease contained anionic detergent
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	perivascular flow module
Vetbond	3M	1469SB	tissue adhesive
WinDaq software	DATAQ		recording software