意識のあるラットにおける腎血流の長期連続測定

要約

本プロトコルは、意識のあるラットにおける腎血流の長期連続測定と、埋め込まれたカテーテル(液体充填または遠隔測定による)による血圧の同時記録について説明しています。

要約

腎臓は体液の恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。腎血流(RBF)の調節は、腎機能における濾過および代謝の重要な機能に不可欠です。腎灌流の調節に関与するメカニズムを決定するために、さまざまな条件下でRBFを測定するために、麻酔をかけた動物で多くの急性研究が行われています。しかし、技術的な理由から、拘束されていない無麻酔ラットのRBFを長期間にわたって連続的に(24時間/日)測定することは不可能でした。.これらの方法により、数週間にわたってRBFを継続的に測定すると同時に、埋め込まれたカテーテル(液体充填またはテレメトリによる)で血圧(BP)を記録することができます。RBFモニタリングは、ラットを円形のサーボ制御ラットケージに入れて実施され、研究全体を通してラットの無制限の動きを可能にします。同時に、フロープローブと動脈カテーテルからのケーブルの絡まりが防止されます。ラットは、最初に左腎動脈に超音波フロープローブを配置し、右大腿動脈に動脈カテーテルを埋め込むことで計装されます。これらは首のうなじに皮下配線され、それぞれ流量計と圧力トランスデューサに接続されて、RBFとBPを測定します。外科的移植後、ラットは直ちにケージに入れられ、少なくとも1週間回復し、超音波プローブの記録を安定させる。このシステムでは採尿も可能です。継続的なモニタリングのための外科的および術後の手順は、このプロトコルで示されています。

概要

腎臓は体重のわずか0.5%ですが、血流が豊富で、総心拍出量の20%〜25%を受け取ります¹。腎血流(RBF)の調節は、腎機能、体液、電解質恒常性の中心です。腎臓への血流調節の重要性は、片側腎摘^出術後の残りの腎臓におけるRBFの大幅な増加2,3,4および腎不全で起こるRBFの減少によってうまく示されています^5,6,7。このようなRBFの変化が腎機能の変化に応答して起こるのか、それともRBFの減少による機能の低下が起こるのかは、麻酔をかけた外科的に調製された動物またはヒト被験者で確認することは困難でした。定義された変化の前後にイベントを決定し、イベントの進行中に同じ動物で観察できる時間的研究が必要です。動物およびヒトの研究では、RBFはパラアミノ馬尿酸(PAH)8,9,10のクリアランスによって間接的に推定されており、最近では超音波^9,11,12、MRI ^4,13、およびPET-CT14,15などのイメージング技術によって推定されています。 これは、各腎臓の有用なスナップショット画像を提供し、病気の進行を追跡することができます。麻酔なしで超音波またはMRIスキャンによって小動物のRBFを評価することは困難です。同じラットの意識条件下でRBFを長期間にわたって連続的に測定することは不可能でした。

したがって、本プロトコルは、RBFの24時間/日の同時連続測定を可能にする技術を開発し、これは、前述のように自由に動くラットの連続血圧測定法と組み合わされた16,17,18,19,20,21。.この技術により、ラットの様々なモデルにおけるRBFの時間的評価が可能になり、将来の様々な腎障害における因果関係を研究することができます。

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プロトコル

このプロトコルは、ウィスコンシン医科大学施設の動物の世話と使用によって承認されています。ダール塩感受性ラット(雄および雌)、~8週齢、200〜350gを実験に使用した。

1.動物の準備

1. ラット用の運動反応ケージシステム、血管周囲フローモジュール、シリンジポンプ、記録装置、およびソフトウェア( 材料表を参照)を動物室に設置します。
2. ラットをケージに入れて、少なくとも手術の前の週に環境、食物、水システムに慣れてください。胃の内容量が多いと、左腎動脈へのフロープローブの配置が妨げられ、気管吸引を引き起こす可能性があるため、手術の前日からラットを絶食させます。
3. 5cmのポリウレタンチューブ(内径0.30mm、外径0.64mm)を90cmのポリウレタンチューブ(内径0.64mm、外径1.02mm)の端にPVCセメントで接続し、大腿動脈カテーテルを作ります( 材料表を参照)。
   1. エチレンオキシド滅菌器でカテーテルを滅菌し、2.5%グルタルアルデヒドでフロープローブを滅菌し、蒸気オートクレーブで手術器具を滅菌します。手術台、顕微鏡、照明を1%次亜塩素酸ナトリウムで拭きます。

2.手術

1. 以下の手順に従ってRBFプローブを配置します。
   1. ラットが痛みの刺激に反応しない程度に2.0%〜2.5%のイソフルランでラットを麻酔します。.37°Cに設定した手術台に置き、手術前に0.09 mg / kgのブプレノルフィンSRと15 mg / kgのセファゾリン( 材料の表を参照)を注射します。
   2. 電気バリカンと、カテーテルと流れがワイヤーを出ることを証明する7^番目の 頸椎の周りの首のうなじの領域で腹部全体を剃ります。
   3. 剃った後、70%エタノール、10%ポビドンヨード、そして再び70%エタノールでその領域を拭きます。
   4. ラットを腹臥位にします。首のうなじと左脇腹にメスを使って1cmのカットをします。その後、止血鉗子で鈍的解剖を行い、脇腹切開部から首の後ろまで皮下空間をきれいにします。
   5. フロープローブをこの皮下トンネルに通し、首から止血鉗子で脇腹切開部まで通します。
   6. ラットを仰臥位に置きます。4〜5 cmの正中線腹部切開を行います。
   7. 湾曲したピンセットで腎動脈の周囲を解剖し、フロープローブを配置するのに十分なスペースを露出させます( 材料の表を参照)。次に、止血鉗子で左腰方形筋を鈍く突き刺し、フロープローブの頭を腹腔に引き込みます。
   8. フロープローブの先端を左腎動脈に引っ掛け、流量計に接続します( 材料の表を参照)。プローブの先端の周りにゲルを追加すると、流量の値が流量計に表示されます。
      注:ラットのサイズにもよりますが、230gのラットでは約3〜5 mL / minの流れが観察されます。
   9. プローブに取り付けられたポリエステル繊維メッシュを組織接着剤で腹壁に接着し、乾いて接着するまで保持します(~1〜2分)。流れが整ったら、流量計からフロープローブを外し、生理食塩水に浸したガーゼで腹部を覆い、カテーテルを挿入するステップに進みます。
2. 以下の手順に従って大腿骨カテーテルを挿入します。
   注意: 液体で満たされたカテーテルを挿入する方法は、通常のテレメトリインストールと同じです。テレメトリが好ましいが、動脈カテーテルは、意識のあるラットからの圧力モニタリングおよび期間採血を可能にする。
   1. まず、カテーテルに生理食塩水を入れ、血管鉗子でクランプしてから、左大腿部のメスを使って1cmの皮膚切開を行い、大腿動脈を解剖して露出させます。大腿動脈の近位側の流れを糸で塞ぎながら、カテーテルを挿入します。
   2. 少量の生理食塩水で洗い流し、適切なサイズのステンレスワイヤーで栓をし、カテーテルを糸で結んで固定します。
   3. 結紮糸がカテーテルの周りに結ばれたら、太ももから首の後ろまでステンレス鋼のトロカールを使用して皮下トンネルを作り、カテーテルを首の領域に持ってきます。僧帽筋に配置された3-0シルク縫合糸で固定します。
3. プローブを縫合します。
   1. ラットを腹臥位に回し、フロープローブの円形ループを側面で皮下縫い合わせます。脇腹と首の切開部を4-0外科用縫合糸で縫合します( 資料表を参照)。
   2. フロープローブにスキンボタンを取り付け、首の後ろに3-0シルクで縫合します。
   3. フロープローブを流量計に再度接続し、ラットを背側位置に戻してRBFを確認し、フロープローブの最終調整を行って腎動脈上の位置を最適化します。
   4. 最後に、3-0シルクで筋肉を縫合し、4-0外科用縫合糸で皮膚を縫合します。

3.動物の回復

1. 注意深く観察した後、ラットが麻酔から完全に回復するまで、ラットを運動反応ケージングシステムに戻し、フロープローブを血流計に接続し、約1週間の回復期間を待ってプローブと流量測定を安定させます。
   注:この期間中に録音を行う必要はありません。
2. 凝固を防ぐために、動脈カテーテルから100 μL / hの速度で研究全体を通して3%ヘパリン化生理食塩水を継続的に注入します。
3. 5〜6日後に流れが安定したら、流量計のキャリブレーションを設定して血流を0〜20 mL / minで測定し、RBFの連続記録を開始します。

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結果

代表的な雄ダール塩感受性ラットからの平均動脈圧データ(図1A)および血流データ(図1B)を示す。ダールの塩分感受性ラットはコロニーで飼育され、ウィスコンシン医科大学で飼育されています。手術は8週齢で行われ、手術時の体重は249gであった。ラットに0.4%NaCl食を与え、10週齢で食餌を4%NaCl食に変更した。測定は4%NaCl食で3週間継続され、実験は1...

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ディスカッション

本プロトコルは、市販の器具を利用してRBFおよび動脈圧を何週間にもわたって連続的に記録する技術を記載する。さらに、尿は、ステップ1.1に記載のデバイスを使用して収集できます。また、尿中の代謝物の評価や、動脈カテーテルが埋め込まれている場合は、分析のための採血にも使用できます。

伝統的に、RBF測定値は、外科的に調製された麻酔動物において急性に?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1RB probe	Transonic	1RB	ultrasonic flow probe
Betadine	Avrio Health		povidone-iodine
Buprenorphine SR-LAB	ZooPharm		Buprenorphine
Cefazolin	APOTEX	NDC 60505	Cefazolin
Crile Hemostats	Fine Surgical Instruments	13004-14	Hemostats for blunt dissection
Isoflurane	Piramal	NDC 66794	Isoflurane
Medium Clear PVC cement	Oatey		PVC cement
Mersilene polyester fiber mesh	Ethicon		polyester fiber mesh
MetriCide28	Metrex	SKU 10-2805	2.5% glutaraldehyde
Micro-Renathane 0.025 x 0.012	Braintree Scientific	MRE 025	use for catheter
MINI HYPE-WIPE	Current Technologies	#9803	1% sodium hypochlorite
Oatey Medium Clear PVC Cement	Oatey	#31018	PVC cement
PHD2000 syringe pump	Harvard apparatus	71-2000	syringe pump
Ponemah software	DSI		recording software
Precision 3630 Tower	Dell		Computer for recording
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1407	a movement response caging system
RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025	Braintree Scientific	RPT 040	use for catheter
Silicone cuff	Transonic	AAPC102	skin button
Surgical lubricant sterile bacteriostatic	Fougera	0168-0205-36	gell for flow probe
Tergazyme	Alconox		protease contained anionic detergent
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	perivascular flow module
Vetbond	3M	1469SB	tissue adhesive
WinDaq software	DATAQ		recording software