Kontinuierliche Langzeitmessung des renalen Blutflusses bei bewussten Ratten

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine langfristige kontinuierliche Messung des renalen Blutflusses bei bewussten Ratten und die gleichzeitige Erfassung des Blutdrucks mit implantierten Kathetern (flüssigkeitsgefüllt oder telemetrisch).

Zusammenfassung

Die Nieren spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase von Körperflüssigkeiten. Die Regulierung des renalen Blutflusses (RBF) ist essentiell für die lebenswichtigen Funktionen der Filtration und des Stoffwechsels in der Nierenfunktion. Viele akute Studien wurden an anästhesierten Tieren durchgeführt, um RBF unter verschiedenen Bedingungen zu messen, um Mechanismen zu bestimmen, die für die Regulation der Nierenperfusion verantwortlich sind. Aus technischen Gründen war es jedoch nicht möglich, RBF kontinuierlich (24 h/Tag) bei ungehemmten, nicht anästhesierten Ratten über längere Zeiträume zu messen. Diese Methoden ermöglichen die kontinuierliche Bestimmung der RBF über viele Wochen bei gleichzeitiger Erfassung des Blutdrucks (BP) mit implantierten Kathetern (flüssigkeitsgefüllt oder telemetrisch). Die RBF-Überwachung wird mit Ratten durchgeführt, die in einem kreisförmigen, servogesteuerten Rattenkäfig untergebracht sind, der die uneingeschränkte Bewegung der Ratte während der gesamten Studie ermöglicht. Gleichzeitig wird das Verheddern von Kabeln aus Strömungssonde und Arterienkathetern verhindert. Ratten werden zunächst mit einer Ultraschall-Durchflusssonde an der linken Nierenarterie und einem arteriellen Katheter instrumentiert, der in die rechte Oberschenkelarterie implantiert wird. Diese werden subkutan zum Nacken geführt und mit dem Durchflussmesser bzw. dem Druckmessumformer verbunden, um RBF und BP zu messen. Nach der chirurgischen Implantation werden Ratten sofort in den Käfig gesetzt, um sich für mindestens eine Woche zu erholen und die Ultraschallsondenaufnahmen zu stabilisieren. Auch die Urinsammlung ist in diesem System möglich. Die chirurgischen und postoperativen Verfahren zur kontinuierlichen Überwachung werden in diesem Protokoll demonstriert.

Einleitung

Die Nieren sind nur 0,5% des Körpergewichts, aber reich an Durchblutung und erhalten 20% -25% des gesamten^{Herzzeitvolumens 1}. Die Regulierung des renalen Blutflusses (RBF) ist von zentraler Bedeutung für die Nierenfunktion, die Körperflüssigkeit und die Elektrolythomöostase. Die Bedeutung der Regulierung des Blutflusses für die Niere wird durch den erheblichen Anstieg der RBF in der verbleibenden Niere nach einseitiger Nephrektomie ^2,3,4 und durch die Reduktionen der RBF, die bei Nierenversagen auftreten ^5,6,7, schön veranschaulicht. Ob solche Veränderungen der RBF als Reaktion auf Veränderungen der Nierenfunktion oder eine Abnahme der Funktion aufgrund einer Verringerung der RBF auftreten, war bei anästhesierten chirurgisch präparierten Tieren oder menschlichen Probanden schwierig festzustellen. Es sind zeitliche Untersuchungen erforderlich, in denen die Ereignisse vor und nach einer definierten Veränderung bestimmt und im selben Tier während des Fortschreitens der Ereignisse beobachtet werden können. In den Tier- und Humanstudien wurde die RBF indirekt durch die Clearance von para-Amino-Hippursäure (PAK)8,9,10 und in jüngerer Zeit durch bildgebende Verfahren wie Ultraschall 9,11,12, MRT^4,13 und PET-CT ^14,15 geschätzt. die hilfreiche Schnappschüsse von jeder Niere liefern und das Fortschreiten der Krankheit verfolgen können. Es ist schwierig, RBF bei Kleintieren durch Ultraschall oder MRT-Scans ohne Anästhesie zu bewerten. Es war unmöglich, RBF unter bewussten Bedingungen bei derselben Ratte über längere Zeiträume kontinuierlich zu messen.

Das vorliegende Protokoll entwickelte daher Techniken, die simultane kontinuierliche 24 h/Tag Messungen von RBF ermöglichen, die mit kontinuierlichen Blutdruckmessmethoden für sich frei bewegende Ratten kombiniert wurden, wie zuvor beschrieben 16,17,18,19,20,21 . Diese Technologie ermöglicht die zeitliche Bewertung von RBF in verschiedenen Modellen von Ratten, um in Zukunft Ursache-Wirkungs-Beziehungen bei verschiedenen Nierenerkrankungen zu untersuchen.

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Protokoll

Das Protokoll ist vom Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use genehmigt. Für die Experimente wurden Dahl-salzempfindliche Ratten (Männchen und Weibchen), ~8 Wochen alt, 200-350 g, verwendet.

1. Tierische Zubereitung

1. Installieren Sie ein Bewegungsreaktionskäfigsystem für die Ratte, ein perivaskuläres Durchflussmodul, eine Spritzenpumpe, ein Aufzeichnungsgerät und Software (siehe Materialtabelle) im Tierraum.
2. Setzen Sie die Ratten in den Käfig, um sich mindestens in der Woche vor der Operation mit der Umgebung, dem Futter und dem Wassersystem vertraut zu machen. Beschleunigen Sie die Ratten vom Tag vor der Operation, da ein hoher Mageninhalt die Platzierung der Durchflusssonde in die linke Nierenarterie stören und eine Trachealaspiration verursachen kann.
3. Verbinden Sie einen 5 cm Polyurethanschlauch (Innendurchmesser 0,30 mm und Außendurchmesser 0,64 mm) mit dem Ende des 90 cm Polyurethanschlauchs (Innendurchmesser 0,64 mm und Außendurchmesser 1,02 mm) mit PVC-Zement, um einen Oberschenkelarterienkatheter herzustellen (siehe Materialtabelle).
   1. Sterilisieren Sie die Katheter mit einem Ethylenoxid-Sterilisator, die Durchflusssonde mit 2,5% Glutaraldehyd und die chirurgischen Instrumente in einem Dampfautoklaven. Wischen Sie OP-Tische, Mikroskopie und Lichter mit 1% Natriumhypochlorit ab.

2. Chirurgie

1. Platzieren Sie die RBF-Sonde, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Betäuben Sie die Ratten mit 2,0% -2,5% Isofluran in dem Maße, dass die Ratten nicht auf den Schmerzreiz reagieren. Legen Sie es auf den bei 37 °C eingestellten Operationstisch und injizieren Sie vor der Operation 0,09 mg/kg Buprenorphin SR und 15 mg/kg Cefazolin (siehe Materialtabelle).
   2. Rasieren Sie den gesamten Bauch mit einem elektrischen Haarschneider und einer Region im Nacken um die 7^. Halswirbel, wo Katheter und Durchfluss beweisen, dass Drähte austreten.
   3. Wischen Sie den Bereich nach der Rasur mit 70% Ethanol, 10% Povidon-Jod und erneut mit 70% Ethanol ab.
   4. Stellen Sie die Ratte in die Bauchlage. Machen Sie einen 1 cm großen Schnitt mit einem Skalpell am Nacken und an der linken Flanke. Führen Sie dann eine stumpfe Dissektion mit einer hämostatischen Pinzette durch und reinigen Sie einen subkutanen Raum vom Flankenschnitt bis zum Nacken.
   5. Führen Sie die Strömungssonde mit einer hämostatischen Pinzette durch diesen subkutanen Tunnel vom Hals bis zum Flankenschnitt.
   6. Stellen Sie die Ratte in Rückenlage. Machen Sie einen 4-5 cm Mittellinien-Bauchschnitt.
   7. Sezieren Sie den Bereich um die Nierenarterie mit einer gebogenen Pinzette, um einen Platz freizulegen, der ausreicht, um die Durchflusssonde zu platzieren (siehe Materialtabelle). Dann den linken Musculus quadratus lumborum stumpf mit der hämostatischen Pinzette durchstechen und den Kopf der Strömungssonde in die Bauchhöhle ziehen.
   8. Haken Sie die Spitze der Durchflusssonde an die linke Nierenarterie und verbinden Sie sie mit dem Durchflussmesser (siehe Materialtabelle). Fügen Sie etwas Gel um die Sondenspitze hinzu, und der Wert der Durchflussrate wird auf dem Durchflussmesser angezeigt.
      HINWEIS: Obwohl es von der Größe der Ratte abhängt, wird bei einer 230 g Ratte ein Fluss von etwa 3-5 ml / min beobachtet.
   9. Kleben Sie das an der Sonde befestigte Polyesterfasernetz mit Gewebekleber an die Bauchdecke und halten Sie es, bis es trocken und verklebt ist (~1-2 min). Sobald der Durchfluss vorhanden ist, trennen Sie die Durchflusssonde vom Durchflussmesser, bedecken Sie den Bauch mit salzhaltiger Gaze und fahren Sie mit dem Einführen des Katheters fort.
2. Führen Sie den Femurkatheter wie folgt ein.
   HINWEIS: Die Methode zum Einführen eines flüssigkeitsgefüllten Katheters ist die gleiche wie bei normalen Telemetrieinstallationen. Obwohl Telemetrie bevorzugt wird, ermöglicht der arterielle Katheter die Drucküberwachung und die Blutentnahme der bewussten Ratte.
   1. Füllen Sie zuerst den Katheter mit Kochsalzlösung und klemmen Sie ihn mit einer Gefäßzange, bevor Sie einen 1 cm langen Hautschnitt mit einem Skalpell am linken Oberschenkel machen, um die Oberschenkelarterie zu sezieren und freizulegen. Während Sie den Fluss an der proximalen Seite der Oberschenkelarterie mit einem Faden blockieren, führen Sie den Katheter ein.
   2. Mit einer kleinen Menge Kochsalzlösung bündig verschließen, mit Edelstahldraht der entsprechenden Größe verschließen und den Katheter mit einem Faden binden, um ihn zu fixieren.
   3. Sobald die Ligatur um den Katheter gebunden ist, erstellen Sie einen subkutanen Tunnel, indem Sie einen Trokar aus Edelstahl vom Oberschenkel bis zum Nacken verwenden, um den Katheter in die Halsregion zu bringen. Sichern Sie es mit 3-0 Seidennähten, die in den Trapezmuskel gelegt werden.
3. Vernähen Sie die Sonde.
   1. Drehen Sie die Ratte in die Bauchlage und nähen Sie die kreisförmige Schlaufe der Strömungssonde subkutan an der Flanke. Nähen Sie den Schnitt an der Flanke und am Hals mit 4-0 chirurgischer Naht (siehe Materialtabelle).
   2. Befestigen Sie einen Hautknopf an der Durchflusssonde und nähen Sie sie mit 3-0 Seide am Nacken.
   3. Schließen Sie die Durchflusssonde wieder an den Durchflussmesser an, drehen Sie die Ratte zurück in die dorsale Position, um die RBF zu überprüfen, und nehmen Sie letzte Anpassungen an der Durchflusssonde vor, um ihre Position auf der Nierenarterie zu optimieren.
   4. Zum Schluss nähen Sie den Muskel mit 3-0 Seide und die Haut mit 4-0 chirurgischer Naht.

3. Bergung des Tieres

1. Nach sorgfältiger Beobachtung, bis sich die Ratten vollständig von der Anästhesie erholt haben, bringen Sie die Ratten in ein Bewegungsreaktionskäfigsystem zurück, verbinden Sie die Durchflusssonde mit dem Blutflussmesser und lassen Sie eine Erholungsphase von etwa einer Woche, um die Sonde und die Durchflussmessung zu stabilisieren.
   HINWEIS: Die Aufzeichnung muss in diesem Zeitraum nicht durchgeführt werden.
2. Gießen Sie während der gesamten Studie kontinuierlich 3% heparinisierte Kochsalzlösung aus dem arteriellen Katheter mit einer Rate von 100 μL/h, um die Gerinnung zu verhindern.
3. Wenn sich der Durchfluss nach 5-6 Tagen stabilisiert hat, stellen Sie die Durchflussmesserkalibrierung so ein, dass der Blutfluss bei 0-20 ml / min gemessen wird, und beginnen Sie mit der kontinuierlichen Aufzeichnung von RBF.

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Ergebnisse

Die mittleren arteriellen Druckdaten (Abbildung 1A) und Blutflussdaten (Abbildung 1B) einer repräsentativen männlichen Dahl-Salz-empfindlichen Ratte werden gezeigt. Die Dahl-Salz-empfindlichen Ratten werden in einer Kolonie gehalten und am Medical College of Wisconsin gezüchtet. Die Operation wurde im Alter von 8 Wochen durchgeführt und das Körpergewicht betrug zum Zeitpunkt der Operation 249 g. Ratten wurden mit einer 0,4% NaCl-Diät gefüttert, und die Di...

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Diskussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik, die kommerziell erhältliche Instrumente verwendet, um RBF und arteriellen Druck kontinuierlich über viele Wochen aufzuzeichnen. Darüber hinaus kann Urin mit dem in Schritt 1.1 beschriebenen Gerät gesammelt werden. Es kann auch verwendet werden, um Metaboliten im Urin und, wenn ein arterieller Katheter implantiert wird, Blutentnahme für die Analyse zu bewerten.

Traditionell wurden RBF-Messungen akut an chirurgisch präparierten anästhesie...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1RB probe	Transonic	1RB	ultrasonic flow probe
Betadine	Avrio Health		povidone-iodine
Buprenorphine SR-LAB	ZooPharm		Buprenorphine
Cefazolin	APOTEX	NDC 60505	Cefazolin
Crile Hemostats	Fine Surgical Instruments	13004-14	Hemostats for blunt dissection
Isoflurane	Piramal	NDC 66794	Isoflurane
Medium Clear PVC cement	Oatey		PVC cement
Mersilene polyester fiber mesh	Ethicon		polyester fiber mesh
MetriCide28	Metrex	SKU 10-2805	2.5% glutaraldehyde
Micro-Renathane 0.025 x 0.012	Braintree Scientific	MRE 025	use for catheter
MINI HYPE-WIPE	Current Technologies	#9803	1% sodium hypochlorite
Oatey Medium Clear PVC Cement	Oatey	#31018	PVC cement
PHD2000 syringe pump	Harvard apparatus	71-2000	syringe pump
Ponemah software	DSI		recording software
Precision 3630 Tower	Dell		Computer for recording
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1407	a movement response caging system
RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025	Braintree Scientific	RPT 040	use for catheter
Silicone cuff	Transonic	AAPC102	skin button
Surgical lubricant sterile bacteriostatic	Fougera	0168-0205-36	gell for flow probe
Tergazyme	Alconox		protease contained anionic detergent
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	perivascular flow module
Vetbond	3M	1469SB	tissue adhesive
WinDaq software	DATAQ		recording software