מדידה מתמשכת ארוכת טווח של זרימת הדם הכלייתית בחולדות מודעות

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידה רציפה ארוכת טווח של זרימת הדם הכלייתית בחולדות מודעות ובמקביל רישום לחץ דם עם צנתרים מושתלים (מלאים בנוזלים או בטלמטריה).

Abstract

הכליות ממלאות תפקיד מכריע בשמירה על הומאוסטזיס של נוזלי הגוף. ויסות זרימת הדם הכלייתית (RBF) חיוני לתפקודים החיוניים של סינון וחילוף חומרים בתפקוד הכליות. מחקרים חריפים רבים בוצעו בבעלי חיים מורדמים כדי למדוד RBF בתנאים שונים כדי לקבוע מנגנונים האחראים על ויסות של זליגת כליות. עם זאת, מסיבות טכניות, לא ניתן היה למדוד RBF באופן רציף (24 שעות ביממה) בחולדות חסרות מעצורים לאורך תקופות ממושכות. שיטות אלה מאפשרות קביעה רציפה של RBF במשך שבועות רבים תוך רישום לחץ דם (BP) בו זמנית עם צנתרים מושתלים (מלאים בנוזל או בטלמטריה). ניטור RBF מתבצע עם חולדות הממוקמות בכלוב חולדות מעגלי מבוקר סרוו המאפשר תנועה בלתי מרוסנת של החולדה לאורך כל המחקר. במקביל, נמנעת הסתבכות של כבלים מבדיקת הזרימה וצנתרים עורקיים. חולדות עוברות תחילה בדיקת זרימה על-קולית הממוקמת בעורק הכליה השמאלי וצנתר עורקי המושתל בעורק הירך הימני. אלה מנותבים תת עורית לעורף הצוואר, ומחוברים למד הזרימה ומתמר הלחץ, בהתאמה, כדי למדוד RBF ו- BP. לאחר השתלה כירורגית, חולדות מוכנסות מיד לכלוב כדי להתאושש לפחות שבוע ולייצב את הקלטות הבדיקה העל-קוליות. איסוף שתן הוא גם אפשרי במערכת זו. ההליכים הכירורגיים והפוסט-כירורגיים לניטור רציף מודגמים בפרוטוקול זה.

Introduction

הכליות הן רק 0.5% ממשקל הגוף אך עשירות בזרימת הדם, ומקבלות 20%-25% מתפוקת הלב הכוללת¹. ויסות זרימת הדם הכלייתי (RBF) הוא מרכזי בתפקוד הכליות, בנוזלי הגוף ובהומאוסטזיס של אלקטרוליטים. החשיבות של ויסות זרימת הדם לכליה מומחשת יפה על ידי העלייה המשמעותית של RBF בכליה הנותרת לאחר כריתת רחם חד צדדית ^2,3,4 ועל ידי הפחתות של RBF המתרחשות באי ספיקת כליות ^5,6,7. האם שינויים כאלה ב- RBF מתרחשים בתגובה לשינויים בתפקוד הכליות או ירידה בתפקוד עקב הפחתת RBF היה מאתגר לברר בבעלי חיים שהוכנו כירורגית מורדמים או נבדקים אנושיים. נדרשים מחקרים זמניים בהם ניתן לקבוע את האירועים לפני ואחרי שינוי מוגדר ולצפות באותה חיה במהלך התקדמות האירועים. במחקרים בבעלי חיים ובבני אדם, RBF הוערך בעקיפין על ידי סילוק של חומצה היפופורית פרה-אמינו (PAH)8,9,10 ובזמן האחרון על ידי טכניקות הדמיה כגון אולטרסאונד^9,11,12, MRI ^4,13 ו- PET-CT^14,15 אשר נותנים תמונות תמונה מועילות של כל כליה ואשר יכול לעקוב אחר התקדמות המחלה. זה מאתגר להעריך RBF בבעלי חיים קטנים על ידי אולטרסאונד או MRI סריקות ללא הרדמה. אי אפשר היה למדוד באופן רציף RBF בתנאים מודעים באותה חולדה לאורך תקופות ממושכות.

הפרוטוקול הנוכחי, אם כן, פיתח טכניקות המאפשרות מדידות רציפות בו זמנית של RBF 24 שעות ביממה, אשר שולבו עם שיטות מדידת לחץ דם רציפות עבור חולדות הנעות בחופשיות כפי שתואר קודם לכן 16,17,18,19,20,21 . טכנולוגיה זו מאפשרת הערכה זמנית של RBF במודלים שונים של חולדות כדי לחקור יחסי סיבה ותוצאה בהפרעות כליות שונות בעתיד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפרוטוקול מאושר על ידי המכללה הרפואית של ויסקונסין לטיפול ושימוש מוסדי בבעלי חיים. חולדות רגישות למלח דאהל (זכרים ונקבות), ~ 8 שבועות של גיל, 200-350 גרם, שימשו לניסויים.

1. הכנת בעלי חיים

1. התקינו מערכת להגבלת תגובת תנועה עבור החולדה, מודול זרימה פריווסקולרית, משאבת מזרק, מכשיר הקלטה ותוכנה (ראו טבלת חומרים) בחדר בעלי החיים.
2. הכניסו את החולדות לכלוב כדי להכיר את הסביבה, המזון ומערכת המים לפחות בשבוע שלפני הניתוח. צמו את החולדות מיום לפני הניתוח מכיוון שתכולת קיבה גבוהה עלולה להפריע למיקום בדיקת הזרימה לעורק הכליה השמאלי ויכולה לגרום לשאיפת קנה הנשימה.
3. חבר צינור פוליאוריתן באורך 5 ס"מ (קוטר פנימי 0.30 מ"מ וקוטר חיצוני 0.64 מ"מ) לקצה צינור הפוליאוריתן באורך 90 ס"מ (קוטר פנימי 0.64 מ"מ וקוטר חיצוני 1.02 מ"מ) עם מלט PVC ליצירת קטטר עורקי הירך (ראו טבלת חומרים).
   1. לעקר את הצנתרים עם מעקר תחמוצת אתילן, את בדיקת הזרימה עם 2.5% glutaraldehyde, ואת כלי הניתוח באוטוקלאב קיטור. נגבו שולחנות ניתוח, מיקרוסקופיה ואורות עם 1% נתרן היפוכלוריט.

2. ניתוח

1. מקם את הבדיקה RBF לפי השלבים הבאים.
   1. הרדימו את החולדות עם 2.0%-2.5% איזופלורן עד כדי כך שהחולדות אינן מגיבות לגירוי הכאב. הניחו אותו על שולחן הניתוחים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והזריקו 0.09 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין SR ו-15 מ"ג/ק"ג של צפזולין (ראו טבלת חומרים) לפני הניתוח.
   2. לגלח את כל הבטן עם קוצץ חשמלי ואזור על העורף סביב חוליות צוואר הרחם⁷ שבו קטטר וזרימה להוכיח חוטים ייצאו.
   3. לאחר הגילוח, נגבו את האזור עם 70% אתנול, 10% פובידון-יוד, ושוב עם 70% אתנול.
   4. מניחים את החולדה במצב נוטה. בצע חתך של 1 ס"מ באמצעות אזמל על העורף של הצוואר ואת האגף השמאלי. לאחר מכן, בצע דיסקציה קהה עם מלקחיים המוסטטיים ונקה חלל תת עורי מהחתך באגף לחלק האחורי של הצוואר.
   5. מעבירים את גשושית הזרימה דרך מנהרה תת עורית זו מהצוואר אל חתך האגף עם מלקחיים המוסטטיים.
   6. מניחים את החולדה במצב שכיבה. בצע חתך בטן בקו האמצע 4-5 ס"מ.
   7. נתחו את האזור סביב עורק הכליה בפינצטה מעוקלת כדי לחשוף חלל מספיק כדי למקם את בדיקת הזרימה (ראו טבלת חומרים). ואז לחדור בבוטות את שריר הלומבורום השמאלי עם מלקחיים hemostatic ולמשוך את הראש של בדיקה זרימה לתוך חלל הבטן.
   8. חברו את קצה גשושית הזרימה לעורק הכליה השמאלי וחברו אותו למד הזרימה (ראו טבלת חומרים). הוסיפו מעט ג'ל סביב קצה הבדיקה, וערך קצב הזרימה יופיע על מד הזרימה.
      הערה: למרות שזה תלוי בגודל החולדה, זרימה של כ-3-5 מ"ל/דקה תיצפה בחולדה במשקל 230 גרם.
   9. מדביקים את רשת סיבי הפוליאסטר המחוברת לבדיקה עם דבק רקמה לדופן הבטן ומחזיקים עד לייבוש ומלוכדים (~1-2 דקות). לאחר שהזרימה נמצאת במקומה, נתקו את גשושית הזרימה ממד הזרימה וכסו את הבטן בגזה ספוגה במי מלח ועברו לשלב החדרת הקטטר.
2. הכנס את קטטר הירך לפי השלבים הבאים.
   הערה: השיטה להחדרת קטטר מלא בנוזל זהה לזו של התקנות טלמטריה רגילות. למרות שעדיף טלמטריה, הצנתר העורקי מאפשר ניטור לחץ ודגימת דם מחזורית מהחולדה המודעת.
   1. ראשית, מלאו את הקטטר במי מלח ומהדקים אותו במלקחיים וסקולריים לפני ביצוע חתך עור של 1 ס"מ באמצעות אזמל בירך שמאל כדי לנתח ולחשוף את עורק הירך. בעת חסימת הזרימה בצד הפרוקסימלי של עורק הירך עם חוט, הכנס את הקטטר.
   2. יש לשטוף בכמות קטנה של מי מלח, לחבר חוט נירוסטה בגודל מתאים ולקשור את הקטטר בחוט כדי לתקן אותו.
   3. לאחר שהליגטורה נקשרת סביב הקטטר, צור מנהרה תת עורית על ידי שימוש בטרוקאר מפלדת אל-חלד מהירך ועד העורף כדי להביא את הקטטר לאזור הצוואר. אבטחו אותו עם 3-0 תפרי משי המונחים בשריר הטרפז.
3. לתפור את הבדיקה.
   1. סובבו את החולדה למצב נוטה ותפרו את הלולאה העגולה של גשושית הזרימה באופן תת עורי באגף. תפר את החתך באגף ובצוואר בתפר כירורגי 4-0 (ראו טבלת חומרים).
   2. חברו כפתור עור לבדיקת הזרימה ותפרו אותו עם משי 3-0 בחלק האחורי של הצוואר.
   3. חבר שוב את בדיקת הזרימה למד הזרימה, סובב את החולדה בחזרה למצב הגבי כדי לבדוק RBF, ובצע התאמות סופיות של בדיקת הזרימה כדי לייעל את מיקומה בעורק הכליה.
   4. לבסוף, לתפור את השריר עם 3-0 משי ואת העור עם 4-0 תפר כירורגי.

3. התאוששות של החיה

1. לאחר התבוננות מדוקדקת, עד שהחולדות יתאוששו לחלוטין מההרדמה, החזירו את החולדות למערכת כלוב של תגובת תנועה, חברו את גשושית הזרימה למד זרימת הדם, ואפשרו תקופת החלמה של כשבוע לייצוב הבדיקה ומדידת הזרימה.
   הערה: אין צורך לבצע הקלטה במהלך תקופה זו.
2. יש להחדיר 3% מי מלח שעברו הפרין באופן רציף לאורך כל המחקר מהקטטר העורקי בקצב של 100 μL/h כדי למנוע את קרישת הדם.
3. כאשר הזרימה מתייצבת לאחר 5-6 ימים, הגדר את כיול מד הזרימה למדידת זרימת הדם ב- 0-20 מ"ל לדקה והתחל בהקלטה רציפה של RBF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מוצגים נתוני לחץ עורקי ממוצע (איור 1A) ונתוני זרימת דם (איור 1B) מחולדה רגישה למלח דאהל זכר מייצג. החולדות הרגישות למלח דאהל מתוחזקות במושבה ומגודלות במכללה הרפואית של ויסקונסין. הניתוח נעשה בגיל 8 שבועות, ומשקל הגוף היה 249 גרם בזמן הניתוח. החולדות הוזנו בדיאטת ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה המשתמשת במכשור זמין מסחרית כדי להקליט RBF ולחץ עורקי ברציפות במשך שבועות רבים. בנוסף, ניתן לאסוף שתן באמצעות המכשיר המתואר בשלב 1.1. זה יכול לשמש גם כדי להעריך מטבוליטים בשתן, וכאשר קטטר עורקי מושתל, דגימת דם לניתוח.

באופן מסורתי, מדידות RBF התקבלו בא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1RB probe	Transonic	1RB	ultrasonic flow probe
Betadine	Avrio Health		povidone-iodine
Buprenorphine SR-LAB	ZooPharm		Buprenorphine
Cefazolin	APOTEX	NDC 60505	Cefazolin
Crile Hemostats	Fine Surgical Instruments	13004-14	Hemostats for blunt dissection
Isoflurane	Piramal	NDC 66794	Isoflurane
Medium Clear PVC cement	Oatey		PVC cement
Mersilene polyester fiber mesh	Ethicon		polyester fiber mesh
MetriCide28	Metrex	SKU 10-2805	2.5% glutaraldehyde
Micro-Renathane 0.025 x 0.012	Braintree Scientific	MRE 025	use for catheter
MINI HYPE-WIPE	Current Technologies	#9803	1% sodium hypochlorite
Oatey Medium Clear PVC Cement	Oatey	#31018	PVC cement
PHD2000 syringe pump	Harvard apparatus	71-2000	syringe pump
Ponemah software	DSI		recording software
Precision 3630 Tower	Dell		Computer for recording
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1407	a movement response caging system
RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025	Braintree Scientific	RPT 040	use for catheter
Silicone cuff	Transonic	AAPC102	skin button
Surgical lubricant sterile bacteriostatic	Fougera	0168-0205-36	gell for flow probe
Tergazyme	Alconox		protease contained anionic detergent
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	perivascular flow module
Vetbond	3M	1469SB	tissue adhesive
WinDaq software	DATAQ		recording software