Misurazione continua a lungo termine del flusso sanguigno renale nei ratti coscienti

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una misurazione continua a lungo termine del flusso sanguigno renale in ratti coscienti e contemporaneamente la registrazione della pressione sanguigna con cateteri impiantati (riempiti di liquido o per telemetria).

Abstract

I reni svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi dei fluidi corporei. La regolazione del flusso sanguigno renale (RBF) è essenziale per le funzioni vitali di filtrazione e metabolismo nella funzione renale. Molti studi acuti sono stati condotti su animali anestetizzati per misurare la RBF in varie condizioni per determinare i meccanismi responsabili della regolazione della perfusione renale. Tuttavia, per ragioni tecniche, non è stato possibile misurare i RBF in modo continuo (24 ore al giorno) in ratti non anestetizzati non trattenuti per periodi prolungati. Questi metodi consentono la determinazione continua dei globuli rossi per molte settimane, registrando contemporaneamente la pressione sanguigna (BP) con cateteri impiantati (riempiti di liquido o mediante telemetria). Il monitoraggio RBF viene effettuato con ratti collocati in una gabbia circolare servocomandata che consente il movimento sfrenato del ratto durante lo studio. Allo stesso tempo, viene impedito l'aggrovigliamento dei cavi dalla sonda di flusso e dai cateteri arteriosi. I ratti vengono prima strumentati con un posizionamento di una sonda a flusso ultrasonico sull'arteria renale sinistra e un catetere arterioso impiantato nell'arteria femorale destra. Questi sono instradati per via sottocutanea alla nuca e collegati rispettivamente al flussometro e al trasduttore di pressione per misurare RBF e BP. Dopo l'impianto chirurgico, i ratti vengono immediatamente messi nella gabbia per recuperare per almeno una settimana e stabilizzare le registrazioni della sonda ad ultrasuoni. Anche la raccolta delle urine è fattibile in questo sistema. Le procedure chirurgiche e post-chirurgiche per il monitoraggio continuo sono dimostrate in questo protocollo.

Introduzione

I reni sono solo lo 0,5% del peso corporeo ma ricchi di flusso sanguigno, ricevendo il 20% -25% della gittata cardiaca totale¹. La regolazione del flusso sanguigno renale (RBF) è fondamentale per la funzione renale, il fluido corporeo e l'omeostasi elettrolitica. L'importanza della regolazione del flusso sanguigno per il rene è ben illustrata dal sostanziale aumento di RBF nel rene rimanente dopo nefrectomia unilaterale ^2,3,4 e dalle riduzioni di RBF che si verificano nell'insufficienza renale 5,6,7. Se tali cambiamenti in RBF si verificano in risposta ad alterazioni della funzione renale o una diminuzione della funzione dovuta alla riduzione di RBF è stato difficile da accertare in animali anestetizzati preparati chirurgicamente o soggetti umani. Sono necessari studi temporali in cui gli eventi possono essere determinati prima e dopo un cambiamento definito e osservati nello stesso animale durante la progressione degli eventi. Negli studi sugli animali e sull'uomo, la RBF è stata stimata indirettamente dalla clearance dell'acido ippurico para-amminico (IPA)8,9,10 e in tempi più recenti da tecniche di imaging come ultrasuoni^9,11,12, MRI^4,13 e PET-CT ^14,15 che forniscono utili immagini istantanee di ciascun rene e che possono seguire la progressione della malattia. È difficile valutare RBF in piccoli animali mediante ecografia o risonanza magnetica senza anestesia. È stato impossibile misurare continuamente RBF in condizioni coscienti nello stesso ratto per periodi prolungati.

Il presente protocollo, quindi, ha sviluppato tecniche che consentono misurazioni simultanee continue 24 ore al giorno di RBF, che è stato combinato con metodi di misurazione continua della pressione sanguigna per ratti che si muovono liberamente come descritto in precedenza 16,17,18,19,20,21 . Questa tecnologia consente la valutazione temporale di RBF in vari modelli di ratti per studiare le relazioni causa-effetto in vari disturbi renali in futuro.

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Protocollo

Il protocollo è approvato dal Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use. Per gli esperimenti sono stati utilizzati ratti sensibili al sale di Dahl (maschi e femmine), ~ 8 settimane di età, 200-350 g.

1. Preparazione degli animali

1. Installare un sistema di ingabbiamento della risposta al movimento per il ratto, un modulo di flusso perivascolare, una pompa a siringa, un dispositivo di registrazione e un software (vedi Tabella dei materiali) nella stanza degli animali.
2. Metti i ratti nella gabbia per familiarizzare con l'ambiente, il cibo e il sistema idrico almeno la settimana prima dell'intervento. Digiunare i ratti dal giorno prima dell'intervento chirurgico perché un alto contenuto di stomaco può interferire con il posizionamento della sonda di flusso nell'arteria renale sinistra e può causare aspirazione tracheale.
3. Collegare un tubo di poliuretano di 5 cm (diametro interno 0,30 mm e diametro esterno 0,64 mm) all'estremità dei 90 cm di tubo in poliuretano (diametro interno 0,64 mm e diametro esterno 1,02 mm) con cemento PVC per realizzare un catetere arterioso femorale (vedi tabella dei materiali).
   1. Sterilizzare i cateteri con uno sterilizzatore all'ossido di etilene, la sonda di flusso con glutaraldeide al 2,5% e gli strumenti chirurgici in autoclave a vapore. Pulire i tavoli chirurgici, la microscopia e le luci con ipoclorito di sodio all'1%.

2. Chirurgia

1. Posizionare la sonda RBF seguendo i passaggi seguenti.
   1. Anestetizzare i ratti con isoflurano al 2,0%-2,5% nella misura in cui i ratti non rispondono allo stimolo del dolore. Posizionarlo sul lettino chirurgico fissato a 37 °C e iniettare 0,09 mg/kg di buprenorfina SR e 15 mg/kg di cefazolina (vedere Tabella dei materiali) prima dell'intervento.
   2. Rasare l'intero addome con un tagliacapelli elettrico e una regione sulla nuca intorno alle 7^° vertebre cervicali dove il catetere e il flusso provano che i fili usciranno.
   3. Dopo la rasatura, pulire l'area con etanolo al 70%, al 10% di iodio povidone e di nuovo con etanolo al 70%.
   4. Metti il topo in posizione prona. Fai un taglio di 1 cm usando un bisturi sulla nuca e sul fianco sinistro. Quindi, eseguire una dissezione smussata con una pinza emostatica e liberare uno spazio sottocutaneo dall'incisione del fianco alla parte posteriore del collo.
   5. Passare la sonda di flusso attraverso questo tunnel sottocutaneo dal collo all'incisione del fianco con pinza emostatica.
   6. Metti il topo in posizione supina. Fare un'incisione addominale della linea mediana di 4-5 cm.
   7. Sezionare l'area intorno all'arteria renale con una pinzetta curva per esporre uno spazio sufficiente per posizionare la sonda di flusso (vedere Tabella dei materiali). Quindi perforare senza mezzi termini il muscolo lombare quadrato sinistro con la pinza emostatica e tirare la testa della sonda di flusso nella cavità addominale.
   8. Agganciare la punta della sonda di flusso all'arteria renale sinistra e collegarla al flussometro (vedere Tabella dei materiali). Aggiungi un po 'di gel intorno alla punta della sonda e il valore della portata apparirà sul flussometro.
      NOTA: Anche se dipende dalle dimensioni del ratto, si osserverà un flusso di circa 3-5 ml/min in un ratto da 230 g.
   9. Incollare la rete in fibra di poliestere attaccata alla sonda con adesivo tissutale alla parete addominale e tenere asciutta e incollata (~1-2 min). Una volta che il flusso è in posizione, scollegare la sonda di flusso dal flussometro e coprire l'addome con una garza imbevuta di soluzione salina e passare alla fase di inserimento del catetere.
2. Inserire il catetere femorale seguendo i passaggi seguenti.
   NOTA: il metodo per l'inserimento di un catetere riempito di liquido è lo stesso delle normali installazioni di telemetria. Sebbene sia preferibile la telemetria, il catetere arterioso consente il monitoraggio della pressione e il prelievo di sangue dal ratto cosciente.
   1. In primo luogo, riempire il catetere con soluzione salina e bloccarlo con una pinza vascolare prima di eseguire un'incisione cutanea di 1 cm usando un bisturi sulla coscia sinistra per sezionare ed esporre l'arteria femorale. Mentre si blocca il flusso sul lato prossimale dell'arteria femorale con un filo, inserire il catetere.
   2. Sciacquare con una piccola quantità di soluzione salina, collegare con filo inossidabile di dimensioni appropriate e legare il catetere con un filo per fissarlo.
   3. Una volta che la legatura è legata attorno al catetere, creare un tunnel sottocutaneo utilizzando un trocar in acciaio inossidabile dalla coscia alla parte posteriore del collo per portare il catetere alla regione del collo. Fissalo con suture di seta 3-0 posizionate nel muscolo trapezio.
3. Suturare la sonda.
   1. Ruotare il ratto in posizione prona e cucire l'anello circolare della sonda di flusso per via sottocutanea sul fianco. Suturare l'incisione sul fianco e sul collo con sutura chirurgica 4-0 (vedi Tabella dei materiali).
   2. Attaccare un pulsante di pelle alla sonda di flusso e suturarlo con seta 3-0 nella parte posteriore del collo.
   3. Collegare nuovamente la sonda di flusso al flussometro, riportare il ratto in posizione dorsale per controllare RBF e apportare le regolazioni finali della sonda di flusso per ottimizzare la sua posizione sull'arteria renale.
   4. Infine, suturare il muscolo con seta 3-0 e la pelle con sutura chirurgica 4-0.

3. Recupero dell'animale

1. Dopo un'attenta osservazione, fino a quando i ratti non sono completamente recuperati dall'anestesia, riportare i ratti a un sistema di gabbia di risposta al movimento, collegare la sonda di flusso al misuratore di flusso sanguigno e consentire un periodo di recupero di circa una settimana per stabilizzare la sonda e la misurazione del flusso.
   NOTA: la registrazione non deve essere eseguita durante questo periodo.
2. Infondere soluzione salina eparinizzata al 3% in modo continuo durante lo studio dal catetere arterioso alla velocità di 100 μL/h per prevenire la coagulazione.
3. Quando il flusso si stabilizza dopo 5-6 giorni, impostare la calibrazione del flussometro per misurare il flusso sanguigno a 0-20 ml / min e iniziare la registrazione continua di RBF.

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Risultati

Sono mostrati i dati sulla pressione arteriosa media (Figura 1A) e i dati sul flusso sanguigno (Figura 1B) di un ratto rappresentativo maschio di Dahl sensibile al sale. I ratti sensibili al sale di Dahl sono mantenuti in una colonia e allevati presso il Medical College of Wisconsin. L'intervento è stato eseguito all'età di 8 settimane e il peso corporeo era di 249 g al momento dell'intervento. I ratti sono stati nutriti con una dieta NaCl allo 0,4% e la dieta...

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Discussione

Il presente protocollo descrive una tecnica che utilizza strumentazione disponibile in commercio per registrare RBF e pressione arteriosa in modo continuo per molte settimane. Inoltre, l'urina può essere raccolta utilizzando il dispositivo descritto al punto 1.1. Può anche essere utilizzato per valutare i metaboliti nelle urine e, quando viene impiantato un catetere arterioso, il prelievo di sangue per l'analisi.

Tradizionalmente, le misurazioni dei globuli rossi sono state ottenute in modo ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1RB probe	Transonic	1RB	ultrasonic flow probe
Betadine	Avrio Health		povidone-iodine
Buprenorphine SR-LAB	ZooPharm		Buprenorphine
Cefazolin	APOTEX	NDC 60505	Cefazolin
Crile Hemostats	Fine Surgical Instruments	13004-14	Hemostats for blunt dissection
Isoflurane	Piramal	NDC 66794	Isoflurane
Medium Clear PVC cement	Oatey		PVC cement
Mersilene polyester fiber mesh	Ethicon		polyester fiber mesh
MetriCide28	Metrex	SKU 10-2805	2.5% glutaraldehyde
Micro-Renathane 0.025 x 0.012	Braintree Scientific	MRE 025	use for catheter
MINI HYPE-WIPE	Current Technologies	#9803	1% sodium hypochlorite
Oatey Medium Clear PVC Cement	Oatey	#31018	PVC cement
PHD2000 syringe pump	Harvard apparatus	71-2000	syringe pump
Ponemah software	DSI		recording software
Precision 3630 Tower	Dell		Computer for recording
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1407	a movement response caging system
RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025	Braintree Scientific	RPT 040	use for catheter
Silicone cuff	Transonic	AAPC102	skin button
Surgical lubricant sterile bacteriostatic	Fougera	0168-0205-36	gell for flow probe
Tergazyme	Alconox		protease contained anionic detergent
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	perivascular flow module
Vetbond	3M	1469SB	tissue adhesive
WinDaq software	DATAQ		recording software