阴道成形术中的腹腔镜卵母细胞提取和冷冻保存治疗Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser综合征

摘要

一个专门的团队可以为Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser患者提供在腹腔镜阴道成形术时进行受控卵巢刺激和卵母细胞冷冻保存的选择。

摘要

在计划进行腹腔镜阴道成形术并渴望成为亲生母亲的Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser综合征（MRKHS）患者中，我们建议同时进行腹腔镜卵母细胞取出以进行冷冻保存。在腹腔镜检查开始时进行取卵。定位右侧和左侧5毫米穿刺器，通过该穿刺器分别使用17G卵子抽吸针刺穿右卵巢和左卵巢。为了便于卵泡暴露，动员卵巢并用腹腔镜镊子固定。

当吸出多个卵泡彼此靠近时，针尖保留在卵巢中，以减少卵巢皮层被固定的次数，并且由于固有的出血风险。与Davydov腹腔镜改良的阴道成形术技术相比，后续步骤保持不变。手术前，使用促性腺激素释放激素（Gn-RH）拮抗剂方案进行受控的卵巢刺激，并且计划在最终卵泡成熟触发后36小时进行卵母细胞提取和阴道成形术的伴随程序。将滤泡液收集在经阴道取卵期间使用的相同10mL无菌管中，并在加热块（37°C）中转移到辅助生殖实验室，在那里对成熟（中期II）卵母细胞进行玻璃化。

在这种情况下，一系列23名患有MRKH，卵母细胞的女性在所有患者中成功取出并冷冻保存;随后进行了阴道成形术，没有进行任何修改，住院和门诊术后护理（拔除导尿管的当天、出院的日、扩张器的使用和随访时的舒适度）不受影响。1例患者出现1例术后并发症（术后第5天发热，经腹超声检测腹腔积液），保守治疗后消退。这种方法不是在MRKH患者中进行手术阴道成形术和延迟卵母细胞取出，而是将两种手术结合在一次腹腔镜检查中，从而最大限度地减少手术侵入性和麻醉风险。

引言

MRKHS 的发病率约为 1/4-10，000 女性，是 15% 的原发性闭经病例的原因。MRKHS的特征是阴道和子宫上段先天性缺失，而尿路和骨骼异常则不同。更具体地说，通常存在深度为 1-2 cm 的阴道穹窿，并且可能会发现两个基本的子宫角¹.

过去，MRKHS的主要医学兴趣是实现正常的，这通常需要通过非手术或手术方法构建新阴道²。然而，生殖医学的进步目前允许MRKHS患者通过代孕^3，4 或最近的子宫移植⁵进行遗传母性。虽然子宫移植仍然是一种实验性程序，但全球许多国家都可以代孕⁶，报告的产科和社会心理结果与标准 体外 受精和卵母细胞捐赠相当⁷。

代孕和子宫移植都需要取卵和体外受精，但对于如何对MRKHS患者进行卵子采集尚无共识。经阴道入路可能不可行，因为即使在阴道成形术后阴道弹性不足8^{、卵巢位置}不典型9或卵巢^与阴道袖带之间的距离过大4^，10。在这些情况下，腹腔镜取卵是手术通路的最佳方法。然而，由于大多数MRKHS患者目前接受腹腔镜新阴道成形术，我们建议在阴道成形术¹¹手术时进行腹腔镜取卵，然后进行卵母细胞冷冻保存以备将来使用，从而最大限度地减少侵入性，同时结合MRKHS患者的性和生殖功能的治疗。

患者的人口统计数据
到目前为止，已有23名MRKH患者接受了该方案的治疗。 表1总结了患者的病史、器械和实验室检查结果。除非 表1中另有说明，否则未发现相关的先天性异常。

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研究方案

MRKHS三级转诊中心（意大利米兰IRCCS圣拉斐尔大学医院）的当地伦理委员会在2017年7月实施之前已收到通知并批准了该协议。所有患者或监护人都签署了知情同意书，以便在阴道成形术期间进行腹腔镜卵母细胞提取和冷冻保存，并将匿名临床/实验室数据用于科学目的。

1. 团队组成

1. 指定一个专门的团队，由经验丰富的腹腔镜外科医生、经验丰富的阴道外科医生、不孕症专家、专职心理学家和敬业的护士组成。
2. 在整个程序的设置和执行过程中协助患者作为一个团队。

2. 诊断性检查和咨询

1. 对患者进行经腹盆腔和腹部超声检查，以可视化卵巢并估计窦卵泡计数 （AFC）。评估抗苗勒激素 （AMH） 的血液水平，以优化促性腺激素起始剂量，以控制卵巢刺激。根据国家/地方组织/配子冷冻保存协议，对传染病（HIV-Ab，HCV-Ab，HBV-Ab，RPR-TPHA）进行血清学检测。
2. 就MRKHS的性和生殖方面向患者提供咨询，包括非手术和手术阴道成形术，与代孕相关的费用和立法，实验计划背景下子宫移植的观点，可用于卵母细胞提取的不同方法以及卵母细胞冷冻保存在活产率方面的性能。
3. 为患者提供心理评估，以支持她完成手术，并评估情绪稳定性、对未来母亲的承诺和渴望。获得签署的知情同意书，以便同时进行腹腔镜取卵、配子冷冻保存和腹腔镜阴道成形术。如果是未成年患者，请在签署相对知情同意书的父母在场的情况下进行临床评估。

3. 安排手术过程和控制性卵巢刺激

1. 安排伴随腹腔镜取卵、配子冷冻保存和腹腔镜阴道成形术的程序，同时考虑到临床团队的可用性（见上文）以及进行卵母细胞玻璃化的实验室工作人员的可用性。
2. 从手术之日起-14天开始控制卵巢刺激（COS），考虑到COS的计划持续时间n = 12天以及排卵触发和卵母细胞提取和玻璃化之间所需的36小时。
3. 如果COS需要与预期不同的持续时间，请相应地重新安排手术时间。

4.控制卵巢刺激:起始剂量、剂量调整和监测，最终卵母细胞成熟触发

1. 在卵巢周期的任何阶段启动COS，就像通常在"随机启动"方案的背景下进行，以保持生育能力。
2. 根据患者的AFC和AMH选择卵泡刺激素（FSH）/人绝经期促性腺激素（hMG）的起始剂量，并指导患者继续每日自我皮下注射。随后根据卵巢反应进行个体化剂量调整。
3. 通过连续经腹超声和 E₂ 和 P 的伴随测量（第 1 天、第 6 天、第 8 天、第 10 天和第 12 天）监测卵巢反应。
4. 通过皮下施用 0.2 mL 的 Gn-RH 类似物（曲普瑞林）触发最终卵母细胞成熟。

5.临床程序（腹腔镜检查）:取卵

1. 将患者置于改良的背侧截石位置，这样可以很好地同时进入腹部和会阴。诱导全身麻醉，并根据常规术中抗生素预防静脉注射 2 g 头孢唑啉。放置膀胱内 Foley 导管。
2. 用脐周Veress针建立气腹，放置一个10 mm脐带穿刺器以插入腹腔镜，并在左右上腹放置两个5 mm穿刺器。在腹腔镜视力下，使用连接到抽吸泵的 17 G 单腔针，通常用于经阴道取回，通过右套管和左套管分别穿刺右卵巢和左卵巢。
3. 用腹腔镜镊子抬起并握住卵巢，以促进卵泡暴露。当吸出多个靠近另一个的卵泡时，将针尖保留在卵巢中，以减少卵巢皮层被固定的次数和固有的出血风险。

6.临床程序（腹腔镜检查）:阴道成形术

注意:与Davydov的腹腔镜改良技术相比，阴道成形术步骤保持不变¹²。

1. 通过在两个基本子宫角之间横向提起和切开腹膜链，然后向前、横向和向后延伸切口来解剖腹膜。
2. 从膀胱上方的动员腹膜开始在每个半骨盆中用聚二恶烷酮合成可吸收 （PDS） 2-0 单丝进行钱包线缝合，并连续转固定圆形韧带、输卵管峡部、子宫卵巢韧带和外侧腹膜叶。然后，在两条缝合线中包括直肠系膜的外侧和直肠浆液的前侧，紧邻直肠乙状结肠连接处下方。
3. 在会阴入路暴露阴道酒窝并进行H形切口，并通过尖锐和钝切的膀胱直肠间隙来创建新阴道空间。然后，将解剖的腹膜边缘拉到阴道前庭的边缘。在PDS 3-0中位置中断缝合用于腹膜 - 前庭吻合术。最后，将石蜡涂层纱布放入腹膜涂层的新阴道中。

7. 试管婴儿实验室:取卵前一天

1. 根据预期的卵泡数量，用9mL含有HEPES的奎因优势培养基（补充有5%人血清白蛋白[HSA]）制备2至5个圆底管，并在37°C下孵育过夜。
2. 用0.5mL /孔的受精培养基（补充有5%HSA）准备一个或两个4孔培养皿，用0.5mL矿物油覆盖用于胚胎培养，并在37°C的受控气氛中孵育过夜（6%CO 2，5%O₂）。
3. 准备一个含有 9 （30 μL） 滴连续单一培养 （CSCM） 培养基（补充有 10% 血清替代补充剂 [SSS]）的培养皿，上面覆盖着 6 mL 矿物油。在37°C受控气氛（6%CO₂，5%O₂）中孵育过夜。

8. 试管婴儿实验室:取卵程序

1. 用HEPES（补充有5%HSA）与肝素制备奎因优势培养基的溶液，终浓度为10 IU / mL，其中将收集卵泡抽吸物。
2. 与常规经阴道卵母细胞提取13类似，将滤泡抽吸物收集在10mL圆底管中，在便携式培养箱中保温（37°C），并立即运送到胚胎学实验室，运输时间约为¹⁰分钟。
3. 在预热的无菌90毫米培养皿中检查滤泡液，以鉴定卵丘 - 卵母细胞复合物（COC）。一旦检测到COC，将其冲洗在装有1 mL预热的奎因优势培养基（补充有5%HSA）的中心孔培养皿中冲洗。
4. 收集所有COC后，将它们放入含有受精培养基的4孔培养皿中，并在盖子和底部标记与患者身份相关的数据。
5. 将它们在37°C的受控气氛（6%CO₂，5%O₂）中孵育。
6. 确保由实验室的第二名工作人员对程序进行双重检查。

9.卵母细胞剥蚀

1. 在排卵触发后38小时内进行卵丘/冠状细胞去除。
2. 用透明质酸酶制备含有HEPES（补充有5%HSA）的奎因优势培养基溶液，终浓度为10 IU / mL。
3. 准备一个中心孔培养皿，其中装有 1 mL 预热的奎因优势培养基，其中含有含有透明质酸酶的 HEPES（补充有 5% HSA），另一个装有 1 mL 预热的 HEPES 缓冲培养基（补充有 5% HSA）。
4. 用患者识别数据标记卵母细胞剥落培养皿。
5. 将COC置于含有酶的中心孔中，用玻璃巴斯德移液管分散卵丘细胞，轻轻上下移液含有COC的溶液长达30秒。
6. 将卵母细胞移动到仅含有HEPES缓冲培养基的第二个中心孔培养皿中，确保置换最少量的酶。
7. 使用内径减小（170-140μm）的剥落移液器去除剩余的电晕细胞。
8. 评估卵母细胞成熟的阶段，从中期I卵母细胞（MI）和生发囊泡（GV）分离中期II（MII）卵母细胞，其特征在于第一极体的挤出。
9. 将MII卵母细胞转移到IVF培养物60mm培养皿中，培养皿中含有9（30μL）滴连续单一培养（CSCM）培养基（补充有10%血清替代补充剂[SSS]），覆盖有6mL矿物油。
10. 将它们在37°C的受控气氛（6%CO₂，5%O₂）中孵育。

10. 卵母细胞玻璃化

1. 按照玻璃化试剂盒制造商提供的协议，在卵母细胞剥脱后立即对 MII 卵母细胞进行玻璃化。
2. 在手术前近30分钟达到室温（25-27°C）:平衡溶液（ES），玻璃化溶液（VS）和洗涤溶液（WS）。
   注意:根据制造商的报告，ES 在 M-199 HEPES 缓冲培养基中含有 7.5% DMSO、7.5% 乙二醇、20% 葡聚糖血清补充剂 （DSS）、庆大霉素;VS 在 M-199 HEPES 缓冲培养基中含有 15% DMSO、15% 乙二醇、0.5 M 蔗糖、20% DSS、庆大霉素，WS 在 M-199 HEPES 缓冲培养基中含有 20% DSS、庆大霉素。
3. 对于冷冻设备，请使用由连接到塑料手柄的透明薄膜细条组成的 Cryotop。
4. 用患者的姓名、出生日期、ID、冷冻保存日期以及任何单个设备上装载的卵母细胞数量标记冷冻设备。
5. 在玻璃化盘上贴上患者的姓名和 ID。
6. 确保目击操作员检查冷冻设备和培养皿上的正确患者数据。
7. 用新鲜液氮填充冷却箱顶部并盖上盖子，直到使用，以尽量减少分散和蒸发。
8. 使用内径为170μm的剥离移液器，以避免在操作过程中损坏卵母细胞。
9. 使用前轻轻摇动每瓶 ES、VS 和 WS 以混合内容物。
10. 用一滴 50 μL WS1 准备 60 mm 培养皿的盖子（图 1A）。
11. 使用前滴剂以限制介质蒸发。
12. 从培养箱中取出卵母细胞培养皿，用最小体积的培养基将MII卵母细胞（一次最多3个）从培养皿转移到50μLWS中。
13. 近距离分配 50 μL 滴 WS2、ES1 和 ES2，并将卵母细胞从滴剂 WS1 转移到滴剂 WS2 中（图 1B）。
14. 将ES1的液滴合并到WS2中，等待2分钟以使两种溶液自发混合。
15. 然后，将ES2的液滴合并到先前合并的液滴中，并再放置2分钟。
16. 最后，将新的 100 μL ES3 液滴合并到先前合并的液滴中，再放置 1 分钟。
17. 将卵母细胞放入 100 μL ES4 滴中 10 分钟（图 1C）。
18. 分配两滴 50 μL VS 和一滴 100 μL VS（图 1D）。
19. 将卵母细胞依次移动到三滴VS中60秒，使卵母细胞在每滴中停留~20秒。
20. 当在60秒孵育结束前大约10秒时，将冷冻装置置于显微镜下。
21. 将卵母细胞携带在移液管的尖端，并以最少量的VS将它们放在冷冻装置上。
22. 吸出过量的VS，使卵母细胞被一层薄薄的VS覆盖。
23. 将冷冻设备直接放入液氮中并快速移动。将设备保持在液氮中，并用保护盖盖住。
24. 将冷冻设备存放在存储系统（例如 visiotube）中，并将其放入低温罐中。将冷冻保存数据记录在实验室数据库和工作表上。

11. 住院术后护理

1. 手术后48小时取出导尿管和阴道石蜡涂层纱布。
2. 在切除后以数字方式探索患者的新阴道，并指导患者如何进行数字探索。然后，用雌激素凝胶（有利于上皮化）涂覆阴道模具（长9厘米，直径2厘米），并指导患者如何插入和维持模具。
3. 从手术后第 3 天开始，在接下来的每一天，指导患者如何定位模具并将其保持在适当的位置，每天至少 2 小时。
4. 如果没有并发症，患者在术后第5-6天出院。

12. 门诊术后护理

1. 指导患者如何使用住院期间使用的相同模具（长 9 cm，直径 2 cm）进行新阴道扩张 2 个月，然后使用较大的模具（长 11 cm，直径 2.5 cm）。
2. 在3个月的访问后，让患者开始性活动，并告知她在没有的日子里继续使用模具。

13. 跟进

1. 安排在手术后 1、3、6 和 12 个月进行随访。
2. 在每次随访时，评估扩张运动的依从性，并询问患者是否经历了日常生活活动、疼痛、泌尿系统症状或性功能障碍的任何限制（截至手术后第三个月后的随访）。在每次随访时进行妇科检查，以测量阴道的宽度、长度、悬液和附件的活动度。

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结果

表2包括患者的卵巢刺激数据，而表3描述了主要的手术和功能结局。所有患者均成功联合腹腔镜取卵和阴道成形术。平均检索到11.4±5.4（平均±SD）卵母细胞，冷冻保存9.6±4.3个MII卵母细胞（表3）。根据我们在接受ART的患者中冷冻保存卵母细胞的经验，该玻璃化方案后的卵母细胞存活率 - 定义为卵胞浆内单精子注射时形态完整的卵母细胞的比例 - 为84.5±19.3。总...

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讨论

该协议通过结合阴道成形术和卵母细胞提取程序来减少MRKHS治疗的侵入性。为此，至关重要的是，指定一个专门的团队来确保有效地安排COS，外科手术和卵母细胞玻璃化的时间。

MRKHS患者预计这种联合腹腔镜方法最有益，因为盆腔外卵巢沿盆壁¹⁴横向放置或靠近肝脏和胆囊9等器官，或由于盆腔肾脏的存在，经阴道取回被认为在技术上具有挑战性或不可行。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oocyte retrieval procedure
Equipment
CO2 O2 Incubator	Sanyo
Incubator	Thermo Scientific
Laminar Flow Hood	Cooper Surgical
Portable incubator	Cooper Surgical
Stereomicroscope	Nikon
Consumables
14 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352057
4-well dish	Nunc	144444
60 mm Petri dish	Nunc	FA9150270
90 mm Petri dish	Nunc	FA9150360
Human Serum Albumin 100 mg/ml in Normal Saline (5%)	Origio	3001
Mineral oil for embryo culture	Origio	4008
One Well Dish	Oosafe	OOPW-CW05
Quinn’s Advantage Fertilization medium SAGE	Origio	1020
Quinn’s Advantage medium with HEPES	Origio	1024
Sterile glass pasteur pipettes
Oocyte denudation
Equipment
CO2 O2 Incubator	Sanyo
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674
Incubator	Thermo Scientific
Laminar Flow Hood	Cooper Surgical
Stereomicroscope	Nikon
Consumables
4-well dish	Nunc	144444
CSCM (Continuos single culture) medium	Fujifilm irvine Scientific	90165
Human Albumin 100 mg/mL in Normal Saline (5%)	Origio	3001
Hyaluronidase	Fujifilm Irvine Scientific	90101
IVF culture 60 mm petri dish	Nunc	FA9150270
Mineral oil for embryo culture	Origio	4008
One Well Dish	Oosafe	OOPW-CW05
Quinn’s Advantage medium with HEPES	Origio	1024
Serum Substitute Supplement	Fujifilm irvine Scientific	99193
Sterile glass pasteur pipettes
Stripping pipette tips (140 μm)	Cook	K-FPIP-1140-10BS-5
Stripping pipette tips (170 μm)	Cook	K-FPIP-1170-10BS-5
Oocyte vitrification
35 mm Petri dish	NUNC	150255
60 mm Petri dish	NUNC	150270
90 mm Petri dish	NUNC	150360
Container for Cooling rack	Kitazato
Cryodevice/cryotop	Kitazato	81111
Electronic timer
Flexipet	COOK	K- 1000
Gilson Pipetman	Gilson	F123601
Lab Printer LabXpert	Brady	XSL-86-461
Tips 20-200 µL	Thermo Scientific	2160G
Tips 2-20 µL	Thermo Scientific	2139-HR
Visotubes	Cryo Bio System	20
Vitrification Freeze Kit	Fujifilm Irvine Scientific	90133-SO
Vitrification Thaw kit	Fujifilm Irvine Scientific	90137-SO