Recuperación laparoscópica de ovocitos y criopreservación durante la vaginoplastia para el tratamiento del síndrome de Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser

Resumen

Un equipo dedicado puede ofrecer a las pacientes de Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser la opción de realizar estimulación ovárica controlada y criopreservación de ovocitos en el momento de la vaginoplastia laparoscópica.

Resumen

En pacientes con síndrome de Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser (MRKHS) que están programadas para vaginoplastia laparoscópica y tienen un deseo de maternidad biológica, proponemos que se realice una recuperación laparoscópica concomitante de ovocitos para criopreservación. La recuperación de ovocitos se persigue al comienzo de la laparoscopia. Se colocan trócares de 5 mm derecho e izquierdo, a través del cual se utiliza una aguja de aspiración de óvulo de 17 G para la punción de los ovarios derecho e izquierdo, respectivamente. Para facilitar la exposición de los folículos, los ovarios se movilizan y se sostienen con fórceps laparoscópicos.

Al aspirar múltiples folículos cerca uno del otro, la punta de la aguja se retiene en el ovario para reducir el número de veces que la corteza ovárica está paralizada y debido al riesgo inherente de sangrado. Los pasos posteriores no cambian en comparación con la técnica modificada laparoscópica de Davydov para la vaginoplastia. Antes de la cirugía, la estimulación ovárica controlada se realiza con un protocolo antagonista de la hormona liberadora de hormona gonadotropina (Gn-RH), y el procedimiento concomitante de recuperación de ovocitos y vaginoplastia se programa 36 h después del desencadenante final de la maduración folicular. El líquido folicular se recoge en los mismos tubos estériles de 10 ml utilizados durante la recuperación transvaginal de ovocitos y se transfiere en un bloque de calentamiento (37 °C) al laboratorio de reproducción asistida, donde se vitrifican ovocitos maduros (metafase II).

En este caso, una serie de 23 mujeres con MRKH, ovocitos fueron recuperados con éxito y criopreservados en todas las pacientes; La vaginoplastia se realizó posteriormente sin modificaciones, y la atención postoperatoria para pacientes hospitalizados y ambulatorios (día de la retirada del catéter urinario, día del alta hospitalaria, uso del dilatador y comodidad en el seguimiento) no se vio afectada. Una complicación postoperatoria ocurrió en un paciente (fiebre que se desarrolló el día 5 después de la cirugía y detección de líquido intraperitoneal en la ecografía transabdominal) y se resolvió después del tratamiento conservador. En lugar de realizar vaginoplastia quirúrgica y retrasar la recuperación de ovocitos en pacientes con MRKH, este enfoque combina ambos procedimientos en una sola laparoscopia, minimizando así la invasividad quirúrgica y los riesgos anestésicosicos.

Introducción

Con una incidencia de aproximadamente 1 de cada 4-10.000 mujeres, MRKHS es la causa del 15% de los casos de amenorrea primaria. MRKHS se caracteriza por la ausencia congénita del segmento superior de la vagina y el útero, mientras que las anomalías del tracto urinario y esquelético se asocian de manera variable. Más específicamente, una bóveda vaginal con una profundidad de 1-2 cm suele estar presente, y se pueden encontrar dos cuernos uterinos rudimentarios¹.

En el pasado, el interés médico primario en MRKHS era permitir las relaciones sexuales normales, que generalmente requieren la construcción de una neovagina por abordajes no quirúrgicos o quirúrgicos². Sin embargo, los avances en medicina reproductiva actualmente permiten la maternidad genética en pacientes con MRKHS, ya sea por subrogación^3,4 o, más recientemente^, por trasplante de útero⁵. Si bien el trasplante de útero es todavía un procedimiento experimental, la subrogación está disponible en muchos países del mundo⁶, y los resultados obstétricos y psicosociales informados son comparables a los de la fertilización in vitro estándar y la donación de ovocitos⁷.

Tanto la gestación subrogada como el trasplante de útero requieren la recuperación de ovocitos y la fertilización in vitro, pero no existe consenso sobre cómo realizar la recolección de óvulos en pacientes con MRKHS. El abordaje transvaginal puede ser inviable debido a la elasticidad vaginal insuficiente⁸ incluso después de la vaginoplastia, la localización atípica de los ovarios⁹ o la distancia excesiva entre los ovarios y el manguito vaginal ^4,10. En estos casos, la recuperación laparoscópica de ovocitos representa el enfoque óptimo en términos de acceso quirúrgico. Sin embargo, como la mayoría de las pacientes con MRKHS actualmente se someten a neovaginoplastia laparoscópica, sugerimos realizar una recuperación laparoscópica de ovocitos en el momento de la cirugía para la vaginoplastia¹¹, seguida de la criopreservación de ovocitos para uso futuro, minimizando así la invasividad y combinando el tratamiento de la función sexual y reproductiva de las pacientes con MRKHS.

Datos demográficos de los pacientes
Veintitrés pacientes con MRKH se sometieron a tratamiento con este protocolo hasta el momento. Los hallazgos anamnésicos, instrumentales y de laboratorio de los pacientes se resumen en la Tabla 1. A menos que se especifique en la Tabla 1, no se encontraron anomalías congénitas asociadas.

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Protocolo

El comité ético local en el centro de referencia terciaria para MRKHS (IRCCS San Raffaele University Hospital, Milán, Italia) fue notificado y aprobó el protocolo antes de su implementación en julio de 2017. Todos los pacientes o tutores dieron su consentimiento informado firmado para la recuperación laparoscópica de ovocitos y la criopreservación durante la vaginoplastia y para el uso de datos clínicos/de laboratorio anónimos con fines científicos.

1. Composición del equipo

1. Designe un equipo dedicado, compuesto por un cirujano laparoscópico experimentado, un cirujano vaginal experimentado, un experto en infertilidad, un psicólogo dedicado y una enfermera comprometida.
2. Ayudar al paciente como equipo durante toda la configuración y realización del procedimiento.

2. Análisis diagnóstico y asesoramiento

1. Realizar ecografía pélvica y abdominal transabdominal en la paciente para visualización de los ovarios y estimación del recuento de folículos antrales (AFC). Evaluar los niveles sanguíneos de hormona antimülleriana (AMH) para optimizar la dosis inicial de gonadotropina para la estimulación ovárica controlada. Realizar pruebas serológicas para enfermedades infecciosas (VIH-Ab, VHC-Ab, VHB-Ab, RPR-TPHA) de acuerdo con los protocolos nacionales/locales para la criopreservación de tejidos/gametos.
2. Asesorar a la paciente sobre los aspectos sexuales y reproductivos de MRKHS, incluida la vaginoplastia quirúrgica y no quirúrgica, los costos y la legislación relacionada con la subrogación, la perspectiva del trasplante uterino en el contexto de un programa experimental, los diferentes enfoques disponibles para la recuperación de ovocitos y el rendimiento de la criopreservación de ovocitos en términos de tasas de nacidos vivos.
3. Ofrecer a la paciente una evaluación psicológica para apoyarla durante el procedimiento y evaluar la estabilidad emocional y el compromiso y el deseo de una futura maternidad. Obtener el consentimiento informado y firmado para la recuperación laparoscópica concomitante de ovocitos, la criopreservación de gametos y la vaginoplastia laparoscópica. En el caso de un paciente menor de edad, realizar las evaluaciones clínicas en presencia de los padres que también firman el consentimiento informado del familiar.

3. Programación del procedimiento quirúrgico y de la estimulación ovárica controlada

1. Programe el procedimiento de recuperación laparoscópica concomitante de ovocitos, criopreservación de gametos y vaginoplastia laparoscópica, teniendo en cuenta la disponibilidad del equipo clínico (ver arriba), así como la del personal de laboratorio que realiza la vitrificación de ovocitos.
2. Iniciar la estimulación ovárica controlada (COS) el día -14 desde el día de la cirugía, teniendo en cuenta una duración planificada de COS de n = 12 días y las 36 h necesarias entre la activación de la ovulación y la recuperación y vitrificación de ovocitos.
3. En caso de que COS requiera una duración diferente de la esperada, reprograme la cirugía en consecuencia.

4. Estimulación ovárica controlada: dosis inicial, ajustes de dosis y seguimiento, activación de la maduración final de los ovocitos

1. Iniciar COS en cualquier fase del ciclo ovárico, como se hace comúnmente en el contexto de protocolos de "inicio aleatorio" para la preservación de la fertilidad.
2. Elija la dosis inicial de hormona foliculoestimulante (FSH)/gonadotropina menopáusica humana (hMG) en función de la AFC y la AMH del paciente, e indique al paciente que continúe con las inyecciones subcutáneas autoadministradas diariamente. Realizar ajustes de dosis individualizados posteriormente en función de la respuesta ovárica.
3. Monitorizar la respuesta ovárica mediante ecografía transabdominal seriada y mediciones concomitantes de E2 y P (día 1, día 6, día 8, día 10 y día₁₂ ).
4. Desencadenar la maduración final de los ovocitos mediante la administración subcutánea de 0,2 mL de un análogo de Gn-RH (triptorelina).

5. Procedimiento clínico (laparoscopia): recuperación de ovocitos

1. Posicionar al paciente en posición de litotomía dorsal modificada, lo que permite un excelente acceso simultáneo al abdomen y al perineo. Inducir anestesia general y administrar 2 g de cefazolina por vía intravenosa según la profilaxis antibiótica intraoperatoria de rutina. Coloque un catéter de Foley intravesical.
2. Establecer neumoperitoneo con una aguja de Veress periumbilical, colocar un trócar umbilical de 10 mm para la inserción del laparoscopio y dos trócares de 5 mm en los cuadrantes superior derecho e izquierdo. Bajo visión laparoscópica, use una aguja de 17 G de un solo lumen conectada a una bomba de aspiración, como se emplea comúnmente para la recuperación transvaginal, a través de los trócares derecho e izquierdo para la punción del ovario derecho e izquierdo, respectivamente.
3. Levante y sostenga los ovarios con fórceps laparoscópicos para facilitar la exposición de los folículos. Al aspirar múltiples folículos que están uno cerca del otro, retenga la punta de la aguja en el ovario para reducir el número de veces que la corteza ovárica está paralizada y el riesgo inherente de sangrado.

6. Procedimiento clínico (laparoscopia): vaginoplastia

NOTA: Los pasos de la vaginoplastia permanecen sin cambios en comparación con la técnica modificada laparoscópica de Davydov¹².

1. Diseccionar el peritoneo levantando e incisando la hebra peritoneal transversalmente entre los dos cuernos uterinos rudimentarios, y luego extendiendo la incisión anterior, lateral y posteriormente.
2. Comience una sutura de cuerda de bolso en monofilamento 2-0 absorbible sintético (PDS) de polidioxanona en cada hemipelvis, desde el peritoneo movilizado por encima de la vejiga, con transfixión consecutiva del ligamento redondo, el istmo tubárico, el ligamento uteroovárico y la hoja peritoneal lateral. Luego, incluya en las dos suturas la cara lateral del mesorrecto y la cara anterior de la serosa rectal, inmediatamente debajo de la unión rectosigmoidea.
3. Exponga el hoyuelo vaginal en el enfoque perineal y realice una incisión en forma de H, y cree un espacio neovaginal mediante la disección aguda y roma del espacio vesicorectal. Luego, tire hacia abajo de los márgenes peritoneales disecados hasta el borde del vestíbulo vaginal. Posición de suturas interrumpidas en PDS 3-0 para la anastomosis peritoneal-vestibular. Por último, coloque una gasa recubierta de parafina en la neovagina recubierta de peritoneo.

7. Laboratorio de FIV: el día antes de la recuperación de ovocitos

1. Preparar de 2 a 5 tubos de fondo redondo con 9 ml de Quinn's Advantage Medium con HEPES (suplementado con albúmina sérica humana al 5% [HSA]) de acuerdo con el número de folículos esperados e incubarlos durante la noche a 37 °C.
2. Preparar uno o dos platos de 4 pocillos con 0,5 mL/pocillo de Medio de Fertilización (suplementado con 5% HSA), cubiertos con 0,5 mL de aceite mineral para cultivo embrionario e incubarlo durante la noche a 37 °C en atmósfera controlada (6% CO2, 5%_O2).
3. Prepare un plato que contenga 9 (30 μL) gotas de medio de cultivo único continuo (CSCM) (suplementado con suplemento sustituto de suero [SSS] al 10%) cubierto con 6 ml de aceite mineral. Incubarlo durante la noche a 37 °C en atmósfera controlada (6% CO2, 5%_O2).

8. Laboratorio de FIV: procedimiento de recuperación de ovocitos

1. Preparar una solución de Quinn's Advantage Medium con HEPES (suplementada con HSA al 5%) con heparina a una concentración final de 10 UI/ml en la que se recogerán aspirados foliculares.
2. Similar a la recuperación transvaginal de ovocitos 13 de rutina, recoger los aspirados foliculares en tubos de fondo redondo de 10 ml, mantenerlos calientes (37 °C) en una incubadora portátil y transportarlos inmediatamente al laboratorio de embriología, con un tiempo de transporte de aproximadamente¹⁰ min.
3. Examinar el líquido folicular en una placa de Petri estéril de 90 mm precalentada para identificar complejos cúmulo-ovocitos (AOC). Una vez que se detecte un AOC, enjuáguelo en un plato de pocillo central lleno de 1 ml de Quinn's Advantage Medium precalentado con HEPES (complementado con HSA al 5%).
4. A medida que se recolectan todos los AOC, colóquelos en el plato de 4 pocillos que contiene el medio de fertilización y etiquete la tapa y el fondo con datos relacionados con la identidad del paciente.
5. Incubarlos a 37 °C en atmósfera controlada (6% CO2, 5%_O2).
6. Asegúrese de que un segundo miembro del personal del laboratorio realice una doble verificación del procedimiento.

9. Denudación de ovocitos

1. Realice la eliminación de células cúmulos/coronas dentro de las 38 h posteriores al desencadenante de la ovulación.
2. Preparar una solución de Quinn's Advantage Medium con HEPES (suplementado con HSA al 5%) con hialuronidasa a una concentración final de 10 UI/ml.
3. Prepare un plato de pocillo central con 1 ml de medio Quinn's Advantage precalentado con HEPES (suplementado con HSA al 5%) que contenga hialuronidasa y otro con 1 ml de medio tamponado con HEPES precalentado (suplementado con HSA al 5%).
4. Etiquete las placas de denudación de ovocitos con los datos de identificación del paciente.
5. Colocar los AOC en el pocillo central que contiene la enzima para dispersar las células del cúmulo con una pipeta de vidrio Pasteur, pipeteando suavemente la solución que contiene AOC hacia arriba y hacia abajo durante un máximo de 30 s.
6. Mover los ovocitos a la segunda placa de pocillo central que contenga solo medio tamponado con HEPES, asegurándose de desplazar una cantidad mínima de la enzima.
7. Retire las células corona restantes utilizando pipetas desnudas con diámetros interiores decrecientes (170-140 μm).
8. Evaluar la etapa de maduración de los ovocitos, separando los ovocitos de metafase II (MII), caracterizados por la extrusión del primer cuerpo polar, de los ovocitos de metafase I (IM) y las vesículas germinales (GV).
9. Transfiera los ovocitos MII en una placa de Petri de 60 mm de cultivo de FIV que contenga nueve (30 μL) gotas de medio de cultivo único continuo (CSCM) (suplementado con suplemento sustituto de suero al 10% [SSS]) cubierto con 6 ml de aceite mineral.
10. Incubarlos a 37 °C en atmósfera controlada (6% CO2, 5%_O2).

10. Vitrificación de ovocitos

1. Realizar la vitrificación de ovocitos MII inmediatamente después de la denudación de ovocitos, siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante del kit de vitrificación.
2. Llevar a temperatura ambiente (25-27 °C): la solución de equilibrio (ES), la solución de vitrificación (VS) y la solución de lavado (WS), casi 30 min antes del procedimiento.
   NOTA: Según lo informado por los fabricantes, ES contiene 7.5% DMSO, 7.5% etilenglicol, 20% suplemento de suero de dextrano (DSS), gentamicina en M-199 HEPES-buffered Medium; VS contiene 15% de DMSO, 15% de etilenglicol, 0,5 M de sacarosa, 20% de DSS, gentamicina en un medio tamponado con M-199 HEPES y WS contiene 20% de DSS, gentamicina en un medio tamponado con M-199 HEPES.
3. Para un criodispositivo, use Cryotop que consiste en una tira fina de película transparente unida a un mango de plástico.
4. Etiquete los criodispositivos con el nombre del paciente, la fecha de nacimiento, la identificación, la fecha de criopreservación y el número de ovocitos cargados en cualquier dispositivo.
5. Etiquete la placa de vitrificación con el nombre y la identificación del paciente.
6. Asegúrese de que un operador testigo verifique los datos correctos del paciente en los criodispositivos y la plata.
7. Llene una caja de enfriamiento hasta la parte superior con nitrógeno líquido fresco y cubra hasta que la use para minimizar la dispersión y la evaporación.
8. Utilice una pipeta pelante con un diámetro interior de 170 μm para evitar dañar los ovocitos durante la manipulación.
9. Agite suavemente cada vial de ES, VS y WS para mezclar el contenido antes de usarlo.
10. Prepare la tapa de una placa de Petri de 60 mm con una gota de 50 μL de WS1 (Figura 1A).
11. Coloque las gotas justo antes de usarlas para limitar la evaporación media.
12. Tome la placa de ovocitos de la incubadora y transfiera los ovocitos MII (hasta 3 a la vez) con un volumen mínimo de medio desde la placa de cultivo a los 50 μL de WS.
13. Dispensar gotas de 50 μL de WS2, ES1 y ES2 en estrecha proximidad y transferir ovocitos de la gota WS1 a la gota WS2 (Figura 1B).
14. Combine la gota de ES1 a WS2 y espere 2 minutos para la mezcla espontánea de ambas soluciones.
15. Luego, combine la gota de ES2 con las gotas previamente fusionadas y déjela durante otros 2 minutos.
16. Finalmente, combine una nueva gota de 100 μL de ES3 con las gotas previamente fusionadas y déjela durante 1 minuto adicional.
17. Colocar los ovocitos en una gota de 100 μL de ES4 durante 10 min (Figura 1C).
18. Dispensar dos gotas de 50 μL de VS y una de 100 μL de VS (Figura 1D).
19. Mueva los ovocitos secuencialmente en las tres gotas de VS durante 60 s para que los ovocitos permanezcan en cada gota durante ~ 20 s.
20. Cuando queden aproximadamente 10 s antes del final de los 60 s de incubación, coloque el criodispositivo bajo el microscopio.
21. Llevar los ovocitos en la punta de la pipeta y colocarlos en el criodispositivo con la cantidad mínima de VS.
22. Aspirar el exceso de VS, dejando los ovocitos cubiertos por una fina capa de VS.
23. Sumerja el criodispositivo directamente en nitrógeno líquido y muévalo rápidamente. Mantenga el dispositivo en nitrógeno líquido y cúbralo con la tapa protectora.
24. Guarde el criodispositivo en un sistema de almacenamiento (por ejemplo, visiotube) y colóquelo en el tanque criogénico. Registre los datos de criopreservación en la base de datos y la hoja del laboratorio.

11. Atención postoperatoria para pacientes hospitalizados

1. Retirar el catéter urinario y la gasa vaginal recubierta de parafina 48 h después de la cirugía.
2. Explore digitalmente la neovagina de la paciente después de la extracción e instruya a la paciente sobre cómo realizar la exploración digital. Luego, cubra un molde vaginal (9 cm de largo y 2 cm de diámetro) con gel de estrógeno (para favorecer la epitelización) e instruya a la paciente sobre cómo insertar y mantener el moho.
3. A partir del día 3 después de la cirugía y cada día siguiente, instruya al paciente sobre cómo colocar el molde y mantenerlo en su lugar durante al menos 2 h diarias.
4. Si no se producen complicaciones, dar de alta al paciente el día 5-6 después de la cirugía.

12. Atención postoperatoria ambulatoria

1. Instruir a la paciente sobre cómo realizar la dilatación neovaginal durante 2 meses con el mismo molde (9 cm de longitud y 2 cm de diámetro) utilizado durante la estancia hospitalaria, y luego uno más grande (11 cm de longitud y 2,5 cm de diámetro).
2. Después de la visita de 3 meses, permita que la paciente comience la actividad sexual e infórmele que siga usando los moldes en los días en que no haya relaciones sexuales.

13. Seguimiento

1. Programe visitas de seguimiento a los 1, 3, 6 y 12 meses después del procedimiento.
2. En cada visita de seguimiento, evalúe el cumplimiento de los ejercicios de dilatación y pregunte al paciente si ha experimentado alguna limitación en sus actividades de la vida diaria, dolor, síntomas urinarios o disfunción sexual (a partir de la visita después del tercer mes después de la cirugía). Realice un examen ginecológico en cada visita de seguimiento para medir el ancho, la longitud, la suspensión y la movilidad de los anexos vaginales.

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Resultados

La Tabla 2 incluye los datos de estimulación ovárica de las pacientes, mientras que los principales resultados quirúrgicos y funcionales se describen en la Tabla 3. Los procedimientos laparoscópicos concomitantes de recuperación de ovocitos y vaginoplastia se combinaron con éxito en todas las pacientes. Se recuperaron un promedio de 11,4 ± 5,4 ovocitos (media ± DE) y 9,6 ± 4,3 ovocitos MII fueron criopreservados (Tabla 3). En nuestra experiencia con la crioprese...

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Discusión

Este protocolo reduce la invasividad en el tratamiento de MRKHS al combinar los procedimientos de vaginoplastia y recuperación de ovocitos. Para este propósito, es crucial que se designe un equipo dedicado para garantizar que el momento del COS, el procedimiento quirúrgico y la vitrificación de ovocitos se programen de manera eficiente.

Los pacientes con MRKHS para quienes se espera que este método laparoscópico combinado sea más beneficioso son aquellos en quienes una recuperación tra...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oocyte retrieval procedure
Equipment
CO2 O2 Incubator	Sanyo
Incubator	Thermo Scientific
Laminar Flow Hood	Cooper Surgical
Portable incubator	Cooper Surgical
Stereomicroscope	Nikon
Consumables
14 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352057
4-well dish	Nunc	144444
60 mm Petri dish	Nunc	FA9150270
90 mm Petri dish	Nunc	FA9150360
Human Serum Albumin 100 mg/ml in Normal Saline (5%)	Origio	3001
Mineral oil for embryo culture	Origio	4008
One Well Dish	Oosafe	OOPW-CW05
Quinn’s Advantage Fertilization medium SAGE	Origio	1020
Quinn’s Advantage medium with HEPES	Origio	1024
Sterile glass pasteur pipettes
Oocyte denudation
Equipment
CO2 O2 Incubator	Sanyo
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674
Incubator	Thermo Scientific
Laminar Flow Hood	Cooper Surgical
Stereomicroscope	Nikon
Consumables
4-well dish	Nunc	144444
CSCM (Continuos single culture) medium	Fujifilm irvine Scientific	90165
Human Albumin 100 mg/mL in Normal Saline (5%)	Origio	3001
Hyaluronidase	Fujifilm Irvine Scientific	90101
IVF culture 60 mm petri dish	Nunc	FA9150270
Mineral oil for embryo culture	Origio	4008
One Well Dish	Oosafe	OOPW-CW05
Quinn’s Advantage medium with HEPES	Origio	1024
Serum Substitute Supplement	Fujifilm irvine Scientific	99193
Sterile glass pasteur pipettes
Stripping pipette tips (140 μm)	Cook	K-FPIP-1140-10BS-5
Stripping pipette tips (170 μm)	Cook	K-FPIP-1170-10BS-5
Oocyte vitrification
35 mm Petri dish	NUNC	150255
60 mm Petri dish	NUNC	150270
90 mm Petri dish	NUNC	150360
Container for Cooling rack	Kitazato
Cryodevice/cryotop	Kitazato	81111
Electronic timer
Flexipet	COOK	K- 1000
Gilson Pipetman	Gilson	F123601
Lab Printer LabXpert	Brady	XSL-86-461
Tips 20-200 µL	Thermo Scientific	2160G
Tips 2-20 µL	Thermo Scientific	2139-HR
Visotubes	Cryo Bio System	20
Vitrification Freeze Kit	Fujifilm Irvine Scientific	90133-SO
Vitrification Thaw kit	Fujifilm Irvine Scientific	90137-SO